当进行工艺放大时,“细胞”都在谈论什么？

当进行工艺放大时，“细胞”都在谈论什么？

关键词：P/V；Mixing time；K L a；CO2 stripping

细胞培养的小试工艺确定后，如何保证规模扩大后细胞生长、产品产量及质量的稳定性是一个新的考验。简单的说，工艺放大主要是保证细胞所处的环境不变，那么工艺放大过程中“细胞”在意的主要有哪些参数？影响细胞环境的参数主要有：P/V、Mixing time、K L a和CO2 stripping。工艺放大时常会根据这些参数进行放大，但有时不仅依靠单一因素进行放大，还会将两个或多个因素结合起来进行放大。

P/V

单位体积功耗比（P/V，Power / V olume），一定程度表示混合程度，P/V值直接影响物料混合及传质。P/V分为平均P/V和最大P/V，平均P/V可以测定反应器的总输入功率，最大局部P/V表现最高比能量耗散速率。工艺放大时

P/V可以单独使用，也可以与k L a、vvm一起使用。

P/V计算公式如下：

其中，P o：功率指数；ρ：液体密度（kg/m3）；N：搅拌速率（s-1）；Di：搅

不同规模反应器参考参数（图表来源：A-Mab Cass Study）

Mixing time

表征体系达到均质所需的时间，通过体系中添加一种标记物（如，盐、染料、放射性材料等）时，测定其达到95%均质状态所需的时间，即为混合时

间。

为使测量模型更适应于细胞培养环境，推荐使用NaOH作为标记物，测量过程中采用两个pH电极测两个不同点的pH值，pH安装及NaOH添加位置如下图。

电极安装及NaOH添加位置（图表来源：Scale-Up Analysis for a CHO Cell Culture

Processin Large-Scale Bioreactors）

下面图A表示标记物NaOH添加后，通过pH（上面和下面的探头）的变化表示体系从均质变为非均质，再变为均质的过程。图B为混合时间的计算方法，t=(t1+t2)/2。一般情况下，反应器规模越大，混合时间越长；混合时间与通气策略没有关系，而是由搅拌速率决定的，但混合时间会影响体系中的DO和pH（规模较大时），进而影响细胞生长。

（图表来源：Scale-Up Analysis for a CHO Cell Culture Processin Large-Scale

Bioreactors）

氧气传质系数（K L a）

K L a，表征氧气从气相进入到液相的速率，影响k L a的因素有很多，如液相性能、气泡大小、体系几何结构和操作参数等。由于氧气在水中的低溶解度，氧气传质速率（OTR）一直是好氧微生物培养的重要参数。细胞培养过程中，氧气从气泡进入细胞分为两个过程：1）从气相进入液相；2）从液相进入细胞，可以用氧气传质速率（OTR）和氧气吸收速率（OUR）表示。

氧气从气泡进入细胞的过程（图表来源：Bioreactor Scale-Up and Oxygen Transfer

Ratein Microbial Processes: An Overview）

由体系中氧气质量平衡可知：dC L/dt=OTR-OUR；C L为液相溶氧浓度。根据双膜理论和亨利定律，OTR=k L a(h C B-C L)，C B为气相氧浓度，k L a为氧气传质系数。则dC L/dt=k L a(h C B-C L)-OUR。

测定k L a可以采用化学和物理方法。通过化学反应（亚硫酸钠法）可以测定OTR和k L a，测定的值一般比正常要高，因为化学反应的快速性。众多测定k L a 的物理方法中，常见的为动态测定模型，而此时又分为两种情况：1）考虑OUR，模拟细胞培养过程，在活细胞存在的条件下，一定时间内停止泵入氧气，将OUR 和OTR分隔开测定。第一阶段确定OUR，第二阶段根据OUR和DO再测定k L a；2）不考虑OUR，体系中没有活细胞，通往氮气降低溶氧，第一阶段省略，仅用测定第二阶段。

物理法测定k L a（图表来源：An Improved Dynamic Method to Measure kLa in

Bioreactors）

CO2 stripping

CO2 stripping，表示体系中移除CO2的能力，即维持体系中p CO2水平的能力。不同细胞系的最佳p CO2均不同，当体系中CO2累积增加导致p CO2升高时不仅对细胞生长和蛋白产生影响，而且还会影响蛋白的质量如糖基化水平等。

vvm较低时（0.002），k L a CO2（CO2传质系数，测定方法与k L a类似）还不能达到k L a的15%，且随着反应器规模的扩大k L a CO2越低，即CO2 stripping越低。体系中气体饱和度和气泡量直接影响CO2 stripping，提高vvm及气泡停留时间可以加快移除，搅拌转速与CO2 stripping关系不大。

参考文献：

1.A-Mab Cass Study

2.Scale-Up Analysis for a CHO Cell Culture Processin Large-Scale Bioreactors

3.An Improved Dynamic Method to Measure kLa in Bioreactors

4.Bioreactor Scale-Up and Oxygen Transfer Ratein Microbial Processes: An Overview

5. A practical approach in bioreactor scale-up and process transfer using a combination of

constant P/V and vvm as the criterion

文章首发https://www.wendangku.net/doc/a17532515.html, 制药在线