稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因+cDNA+克隆及组织表达分析

第３９卷　第１０期西南师范大学学报（自然科学版）２０１４年１０月Vol畅３９　No畅１０ Journal of Southwest China Normal University（Natural Science Edition）Oct畅２０１４

DOI：１０畅１３７１８／j畅cnki畅xsxb畅２０１４畅１０畅０１３

稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因cDNA克隆及组织表达分析①

景　致，　彭作刚，　张耀光

西南大学生命科学学院／淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室／水产科学重庆市市级重点实验室，重庆４００７１５摘要：铜蓝蛋白（Cerulo p lasmin，Cp）是一种重要的铜转运蛋白，合成于肝脏并参与生物体铁的代谢，在医学上是各种炎症、感染、中毒及癌症疾病的标志性蛋白．铜蓝蛋白的研究已在多种真骨鱼类中被报道，文中第一次在稀有鮈鲫（Gobioc y p ris rarus）中报道此基因．采用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）克隆了稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因，使用荧光定量PCR的方法构建了该基因组织表达谱．序列分析表明稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因包含３２６４bp全长编码序列，该序列编码１０８７个氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列与斑马鱼同源性最高（分别为８８畅１％和９０畅３％）．理论相对分子质量和等电点分别为１２４４２９畅１D和６畅４１．荧光定量PCR检测表明该基因在肝脏和脾脏中相对表达量最高，在肌肉和鳃中相对表达量最低．使用氨基酸序列进行蛋白结构保守域分析，结果表明铜蓝蛋白基因在脊椎动物中是相对保守的，推测其功能也与其他物种相似．这为进一步研究稀有鮈鲫该基因的功能及其应用奠定了基础．

关　键　词：稀有鮈鲫；铜蓝蛋白；基因克隆；序列分析；基因表达

中图分类号：S827 文献标志码：A 文章编号：１０００５４７１（２０１４）１０００６１１０

铜蓝蛋白（Cerulo p lasmin，Cp）是Holmberg和Laurell于１９４８年从人血清α２球蛋白中纯化出的一种对芳香二胺、儿茶酚等具有氧化酶活性，且外观呈蓝色的蛋白质，故Holmberg将之命名为铜蓝蛋白，之后其不断地在各种生物体中被发现［１－３］．

到目前为止，人们在常见的家畜禽机体中均发现了铜蓝蛋白的存在，而植物中却广泛含有与铜蓝蛋白结构、性质及功能相似的其他多铜氧化酶家族的成员．因此铜蓝蛋白被认为是广泛分布于各种动物体中的一种含铜蛋白质［４－７］．

铜蓝蛋白主要合成和表达于动物的肝脏，肝细胞先合成铜蓝蛋白前体蛋白，当前体蛋白到达肝细胞分泌区时，铜原子即渗入到前体蛋白中形成全铜蓝蛋白，最后被分泌出肝细胞，进入组织间液的铜蓝蛋白可发挥氧化酶作用，参与生物体内铜的转运；参与低等生物（如：斑马鱼）的肝脏发育过程，在人的胚胎发育过程中它也发挥着重要的作用，广泛参与神经系统的发育；在医学上是各种炎症、感染、中毒及肿瘤疾病的标志性蛋白；与人类wilson病、阿尔茨梅病、帕金森病等有十分密切的联系．因此，长期以来一直受到人们的关注［８－１２］．

稀有鮈鲫（Gobioc y p ris rarus）是我国特有的小型鲤科鱼类，自然分布于四川省境内，是我国近十几年开始使用的一种优良的实验鱼．具有以下优点：体型小、生命力强、饲养简便；繁殖季节长，人工控制条件下可周年产卵；性成熟快，在适宜的温度和充足的饵料条件下孵出４个月左右即可性成熟；产卵批次多，同一雌鱼每隔数天即可产卵１次，每次产卵数百粒，属于连续产卵类型；是培育实验鱼、灭蚊鱼、饵料鱼和观赏鱼的理想对象［１３］．

①收稿日期：２０１４０２２５

基金项目：重庆市科委重点实验室专项经费资助．

作者简介：景　致（１９８６），男，青海西宁人，硕士研究生，主要从事动物分子遗传学方向的研究．

通信作者：张耀光，教授．

２６西南师范大学学报（自然科学版） http：／／xbbjb畅sw u畅cn 第３９卷

本研究以稀有鮈鲫为对象，采用RACE技术克隆出稀有鮈鲫铜蓝蛋白的cDNA全长，通过软件分析该基因的生物学信息，并进行高级结构预测及组织表达差异等方面的研究．填补了铜蓝蛋白在稀有鮈鲫中的研究空白，同时对稀有鮈鲫的分子生物学研究有着重要意义．

1　材料与方法

1畅1　稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因克隆

以稀有鮈鲫肝脏为材料，采用常规酚／氯仿法提取RNA．RNA的提取按照RNAiso T M Plus（TaKaRa，Dalian，China）试剂盒说明操作，于T hermo Scientific NanoDrop２０００（NanoDrop Technologies Inc，Wilmington，USA）测定RNA样品的浓度和纯度，OD２６０／OD２８０介于１畅９～２畅１之间可以使用．采用试剂盒PrimeScript＠RT reagent Kit with gDNAEraserRNA（TaKaRa，Dalian，China）反转录合成cDNA，放置于－２０℃保存备用．

将UCSC中斑马鱼、斑点叉尾鮰、眼斑雪冰鱼的铜蓝蛋白基因的序列进行比对分析，根据一致性最高的保守序列，利用Primer Preimer５畅０软件设计引物CCpF１／CCpR１，CCpF２／CCpR２（表１），以肝脏cDNA 为模板，PCR扩增稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因部分cDNA序列．PCR反应体系：cDNA１００ng，LA Taq buffer （M g２＋）１２畅５μL，２００μmol／L dN T P，CCpF１／CCpR１，CCpF２／CCpR２（１０mmol／L）１畅０μL，LA Taq０畅２５μL（５畅０U／μL（TaKaRa，Dalian，China），灭菌水补至２５μL．反应程序：９４℃５min；９４℃３０s，５６℃２畅５min，７２℃３０s，３５个循环；７２℃１０min．

５’RACE按照SM ART T M RACE cDNA Amplification Kit说明书加以改进进行．以２μg稀有鮈鲫肝脏RNA为模板、SM ART IV primer和CDS III primer为引物，在Super scriptⅢ逆转录酶作用下合成单链cDNA并将其稀释１００倍．巢试PCR扩增５’U T R区域，第一轮以U P和RCpR３，RCpR２（表１）为引物，反应条件：９４℃５min；９４℃３０s，６０℃１min，７２℃３０s，３２个循环；７２℃１０min．第二轮以N U P和RCpR２，RCpR１为引物，反应条件：９４℃５min；９４℃３０s，６０℃１min，７２℃３０s，３２个循环；７２℃１０min．３’RACE同样按照SM ART T M RACE cDNA Amplification Kit说明书加以改进进行．以２μg稀有鮈鲫肝脏RNA为模板、SM ART IV primer和CDS III primer为引物，在Super scriptⅢ逆转录酶作用下合成单链cDNA并将其稀释１００倍．巢试PCR扩增３’U T R区域，第一轮以RCpF３，RCpF２和CDS III primer 为引物，反应条件：９４℃５min；９４℃３０s，６０℃１畅５min，７２℃３０s，３２个循环；７２℃１０min．第二轮以RCpF２，RCpF１和CDS III primer为引物，反应条件：９４℃５min；９４℃３０s，６０℃１畅５min，７２℃３０s，３２个循环；７２℃１０min．

PCR产物用１畅５％琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像仪（Bio‐Rad）观察结果．采用凝胶回收试剂盒（Omega，USA）回收目的片段，回收产物与PMD１９‐T（TaKaRa，Dalian，China）载体连接后转化E畅coli DH５ 感受态细胞，将初步鉴定为阳性克隆的重组质粒送北京华大基因公司测序．

1畅2　稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因生物信息学分析

使用DNAStar工具Editseq对获得的cDNA序列进行开放阅读框预测，并翻译为氨基酸序列．利用ProtParam在线工具（http：／／w w w畅expasy畅ch／tools／Protparam畅html）推测蛋白质氨基酸组成、等电点、理论分子量；利用DNAM AN分析稀有鮈鲫铜蓝蛋白氨基酸序列与其他物种的蛋白保守域结构．并用M EGA５［１４］中的邻接法（Neighbor‐Joining）构建进化树，在线预测稀有鮈鲫铜蓝蛋白氨基酸的二级结构（http：／／npsa‐p bil畅ibcp畅fr／cgi‐bin／npsa＿automat畅p i？p age＝npsa＿sopm畅html）和三级结构（http：／／w ww畅sbg畅bio畅ic畅ac畅uk／～p hyre２／html／p age畅cgi？id＝index）．

1畅3　稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因组织表达分析

实验样本取自本实验繁育性成熟个体，分别取同一个体的心、肝、脾、肾、肠、脑、肌肉、鳃、性腺，共９个组织样本，使用新鲜组织样本进行实验．

以稀有鮈鲫各组织cDNA为模板，以稀有鮈鲫β‐actin（βF１／βF２）基因为内参，每个样品重复３次．反应总体系为２５μL：SYBR Premix Ex Taq T MⅡ（TaKaRa，Dalian，China）１２畅５μL，引物β‐F／β‐R（１０p mol／μL）１畅０μL，模板cDNA２畅０μL，ddH２O８畅５μL，反应在StepOne（ABI，USA）仪器上进行．反应条件为：

９５℃３０s ；９５℃５s ，６０℃３０s ，读板收集荧光，４０个循环；从６０℃到９５℃，每隔０畅５s 读板５s 以绘制

溶解曲线．采用２－△△Ct 方法计算稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因的相对表达量．以组织为变量，运用origin ８畅０软

件进行单因素方差分析．

表1　稀有鮈鲫铜蓝蛋白克隆和组织表达分析引物

基　因

引物名称引物序列（５’－３’）产物大小／bp 退火温度／℃铜蓝蛋白基因CCpF １CAAT ACACCGACGCCACC ４６０５７畅３CCpR １T TCTCGTCAGAT ACCGT AAACA ５５畅４CCpF ２ATGGCGAT AAGACAGGTGAC ２２５８５４畅８CCpR ２CCAGTCCCATCAGAT ACCAG ５４畅７SM ART IV

AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTGGCCAT TACGGCCGGG CDS III

AT TCT AGAGGCCGAGGCGGCCGA CATG －d （T ）３０N UP CT AATACGACTCACT AT AGGG NUP AAGCAGTGGT ATCAACGCAGAGT RCpR １T AATGAGGGGTCCGAGGT ５４畅５RCpR ２GTGCTCCT TCAT TGGTCT TGT T ４８３５８畅５RCpR ３TGGGAAGGCGGT AGAGTC ４５４５５畅３RCpF １

AAAGT AGGAGAAAAAGTGAA ５７畅４GAT TGT RCpF ２GGGCTGAAGAAAGAGAT TGAG ５７３５６畅０RCpF ３CT AAAGAACTGAAGGAGGACGAG ５４６５７畅３内参基因β－F

CCCCAT TGAGCACGGTAT TG １２１β－R

GGGAGCCTCTGTGAGCAGGA 载体M １３＋CGCCAGGGT T T TCCCAGTCACGAC M １３－GAGCGGAT AACAAT T TCACACAGG

M ：DN A marker DL ２０００；１：引物CCpF １／CCpR １产物；２：引物CCpF ２／CCpR ２扩增产物；３：５’RACE 产物（４８０bp ）；４：３’RACE 产物（５７４bp ）图１　稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因PCR 扩增结果2　结 果

2畅1　稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因cDNA 全长克隆

通过克隆测序，引物CCpF １／CCpR １，CCpF ２／CCpR ２扩增产物为２７２３bp ，５’RACE 产物为４８０bp ，３’RACE 产物为５７４bp （图１）．拼接和比对上述３个序

列，分析发现稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因含有２２bp 的５’端U T R 序列和１０３bp 的３’U T R ．将各PCR 测序结果拼接，得到３３８９bp 的稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因全长cDNA

序列（图１）．将稀有鮈鲫铜蓝蛋白核苷酸序列与其他物

种进行BLAST 同源性分析，发现稀有鮈鲫与斑马鱼核

苷酸相似度最高８８畅１％，与斑点叉尾鮰、罗非鱼、斑马宫丽鱼、红鳍东方鲀和眼斑雪冰鱼的相似度分别为７５畅６％，６６畅８％，６６畅４％，６６畅１％和６５畅１％（表２）．2畅2　稀有鮈鲫铜蓝蛋白氨基酸序列分析

根据DNAStar 工具Editseq 预测基因编码区，发现稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因包含３２６４bp 的开放阅读框，编码１０８７个氨基酸．使用DNAM AN 分析稀有鮈鲫铜蓝蛋白与其他６种鱼类的氨基酸序列，发现其含有A １，A ２和B 等９个结构域（图２，图３）．

通过软件ProtParam 分析得到其分子量为１２４４２９畅１D ，等电点为６畅４１．将稀有鮈鲫铜蓝蛋白氨基酸序列与其他物种进行BLAST 同源性分析，发现稀有鮈鲫与斑马鱼氨基酸相似度最高９０畅３％，与斑点叉尾鮰、罗非鱼、斑马宫丽鱼、红鳍东方鲀和眼斑雪冰鱼的相似度分别为７６畅９％，６７畅６％，６７畅２％，６６畅８和６５畅３％，比对结果表明其在物种间相对保守（表２）．

３６第１０期 景　致，等：稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因cDNA 克隆及组织表达分析

表2　稀有鮈鲫与其他物种间铜蓝蛋白基因的同源性

物　种相似度

（

核苷酸）a

相似度（氨基酸）b 物　种相似度（核苷酸）a 相似度（氨基酸）b 斑马鱼８８畅１％

９０畅３％鸡６０畅５％５７畅４％斑点叉尾鮰７５畅６％

７６畅９％珍珠鸡６０畅４％５６畅９％罗非鱼６６畅８％

６７畅６％青色变色蜥６０畅５％５６畅９％斑马宫丽鱼６６畅４％

６７畅２％爪蟾５９畅４％５４畅７％红鳍东方鲀６６畅１％

６６畅８％人５８畅１％５３畅４％眼斑雪冰鱼

６５畅１％６５畅３％小鼠５８畅０％５２畅８％ a ：核苷酸序列同源性；b ：氨基酸序列同源性．

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第１０期 景　致，等：稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因cDNA克隆及组织表达分析

５６

小写字体核苷酸序列为５’U T R 和３’U T R ，大写字体为编码区（ORF ），有下划线的为起始密码子和终止密码子

图２　稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因序列

2畅3　系统进化树分析

根据之前序列分析结果得知，铜蓝蛋白在物种间相对保守．为了比较稀有鮈鲫铜蓝蛋白氨基酸序列与其他动物的差异，从而确定物种间的进化关系，将人、小鼠、鸡、珍珠鸡、变色龙、热带爪蟾、斑点叉尾鮰、红鳍东方鲀、眼斑雪冰鱼、罗非鱼、斑马宫丽鱼和斑马鱼的铜蓝蛋白氨基酸序列运用M EGA ５软件比对氨基酸序列和构建系统发育树（图４）．结果１３个物种分为４组：哺乳类、鸟类和爬行类属于一组，两栖类独自为一组，稀有鮈鲫、斑马鱼和斑点叉尾鮰为一组，其他４种鱼类构成一组，其中稀有鮈鲫与斑马鱼亲缘关系最近．

６６西南师范大学学报（自然科学版） http ：／／xbbjb 畅sw u 畅cn 第３９卷

黑色部分为保守区域，其二级结构大致可分为：A １，A ２和B 等９个结构域

图３　

７个物种铜蓝蛋白氨基酸序列比对

图４　１３个物种铜蓝蛋白氨基酸序列构建的NJ 进化树

７

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2畅4　稀有鮈鲫铜蓝蛋白结构分析

利用在线软件对稀有鮈鲫铜蓝蛋白的二级结构进行预测，结果显示稀有鮈鲫铜蓝蛋白主要由４种形式组成，即α螺旋、β转角、延伸链和无规卷曲．α螺旋占２９畅５３％，β转角占７畅６４％，延伸链占２３畅０９％，无规卷曲占３９畅７４％．进行跨膜结构预测结果为该氨基酸序列分布于跨膜区的百分率为０，推测该蛋白为膜外分泌型蛋白．

利用在线网站和蛋白三级结构制作软件Raswin 对稀有鮈鲫、斑马鱼和人铜蓝蛋白三级结构进行预测，并进行比较分析（图５）．３D 结构模型图显示，因稀有鮈鲫与斑马鱼氨基酸数量相同，种类相似，所以二者蛋白三级结构基本一致（斑马鱼三级结构图略）．而稀有鮈鲫与人铜蓝蛋白由于氨基酸数量和种类相差较大，所以在局部空间结构上有所不同，但总体结构十分相似，属于同一蛋白模型．证明铜蓝蛋白在物种间相对保守，

这也与本文之前分析结果一致．

图５　稀有鮈鲫与人铜蓝蛋白三级结构预测2畅5　稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因组织表达谱分析

以β‐actin 为内参基因，采用荧光定量PCR 的方法对稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因做组织表达谱分析．荧光定量显示在心、肝、脾、肾、肠、脑、肌肉、鳃、性腺组织中均能检测到，其中在肝脏中的相对表达量最高，在鳃和肌肉中相对表达量最低（图６），

说明该基因广泛分布于体内各组织中．

以β‐actin 为内参基因，采用２－△△

Ct 方法计算稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因的相对表达量．

以组织为变量，运用origin ８畅０软件进行单因素方差分析．图６　稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因组织表达荧光定量PCR 检测

3　讨 论

铜蓝蛋白自从１９４８年从人血清α２球蛋白中纯化出之后，不断在各种生物体中被发现．迄今为止，人们发现几乎所有常见家畜禽机体中均有铜蓝蛋白的存在，而植物中广泛含有与其结构、性质及功能相似的其他多铜氧化酶家族的成员，因此可以说铜蓝蛋白是广泛分布于各种动物机体中的一种含铜蛋白质．又因其与生物体生长发育、生物体内调节和人类疾病密切相关，从而使研究者在近几十年内对其蛋白结构、生８６西南师范大学学报（自然科学版） http ：／／xbbjb 畅sw u 畅cn 第３９卷

化特性、生物合成、在体内的分布和代谢及生理功能等诸多方面展开了大量研究，尤其以该蛋白与人类部分疾病之间的联系研究报道较多，并取得了不少的成就．

本研究根据铜蓝蛋白基因在鱼类之间的保守性，首次克隆了稀有鮈鲫该基因全长cDNA 序列，并检测了其表达方式．核苷酸序列比较表明，稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因与斑马鱼、斑点叉尾鮰、红鳍东方鲀和眼斑雪冰鱼的序列具有非常高的相似性，其中与斑马鱼的相似性最高，这与以氨基酸序列构建的进化树结果相一致，进一步证实了铜蓝蛋白基因序列在物种间的高度保守性．

预测稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因蛋白的三级结构，发现其三级结构与斑马鱼和人铜蓝蛋白基因三级结构非常相似，属于同一蛋白结构模型．分为３大结构域，结构域之间由β转角连接．只是因稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因蛋白数少于人体铜蓝蛋白基因蛋白数，因此在结构域大小和蛋白N 端有一部分结构差别．而与斑马鱼铜蓝蛋白基因蛋白三级结构相比，其结构域除少数位点氨基酸有所区别之外基本一致．跨膜结构预测结果表明该氨基酸序列分布于跨膜区的百分率为０，推测该蛋白为膜外分泌型蛋白，这一研究结果与Makoto 等对人铜蓝蛋白氨基酸结构的研究结果相似［１５］．

通过荧光定量PCR 法研究了稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因蛋白在不同组织中的分布，发现基因转录活性最强的组织是肝脏，但在其余８个组织中均有分布．这与其合成于肝脏，参与其他组织发育相符合．为日后研究铜蓝蛋白基因在稀有鮈鲫体内复制、转录和翻译等生物学活动提供了数据基础．

此外，有实验表明在低剂量环境污染暴露对生物的损害影响研究中，重金属异常会对铜蓝蛋白基因表达有所抑制［１６－１７］．同时，研究人员Sahoo 等人发现，利用嗜水单胞菌对罗斯塔野鲮进行侵染，在侵染过程

中鱼体内铜蓝蛋白基因表达量明显上调，并且其能稳定遗传到子代，从而培养出抗病系子代［１８］．这些结果

表明，铜蓝蛋白基因对环境污染有应激反应，同样与生物体免疫机能密切相关，对日后研究环境污染对生物体基因表达及环境污染对生物体免疫调节影响提供了参考依据．

因此，稀有鮈鲫作为被广泛应用于鱼病学（免疫、抗草鱼出血病病毒育种、病原体载体等）、环境科学（鱼类毒性试验、污水监测等）和鱼类遗传学（基因转移等）等领域中的研究对象，将其与铜蓝蛋白基因研究相结合，对未来新的研究工作的开展是具有可行性与实际意义的．

4　结 论

本实验首次克隆了稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因全长cDNA 序列，获得了该基因完整的５’U T R 和３’U T R ．铜蓝蛋白基因表达量在稀有鮈鲫的９个组织呈现差异性表达，在肝脏中表达量最高，其余８个组织中表达量较低．此外，结构预测分析显示稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因蛋白质三级结构与人铜蓝蛋白基因蛋白结构属同一模型，并推测其为膜外分泌型蛋白．这些为进一步研究稀有鮈鲫该基因的功能及应用奠定了基础．参考文献：

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On Cloning，Sequence Analysis and Tissue Expression

of Cerulo p lasmin Gene in Rare Gudgeon

JING　Zhi，　PENG Zuo‐g ang，　Z HANG Yao‐g uang ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｒｅｓｈｗａｔｅｒＦｉｓｈＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ），ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｑｕａｔｉｃＳｃｉｅｎｃｅｏｆＣｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１５，Ｃｈｉｎａ

Abstract：Cerulo p lasmin（Cp），w hich is the major copper‐carrying protein synthesized in the liver，p lays a role in iron metabolism．It is a marker protein for inflammation，infection，p oisoning and cancer．T he Cp g ene has been reported in several teleosts and here the gene in rare gudgeon（Gobioc y p ris rarus）has been first characterized．In this study，the Cp gene has been cloned by rapid amplification of cDNA ends （RACE）．Real‐time PCR has been performed to demonstrate the expression pattern in different tissues．T he CDS of Cp gene is３２６４bp long，w hich encodes１０８７amino acids．BLAST result indicates that the most similar homologue of rare gudgeon Cp is from zebrafish，with a homology of８８．１％（DNA）and ９０．３％（amino acid）．T he predicted relative molecular mass of the protein is１２４４２９畅１D with an estimated PI of６．４１．Real‐time PCR show s that liver and spleen tissues have the highest level of expression of Cp g ene，w hereas its lowest expression level has been detected in muscle and gill．Conserved domain analysis indicates that its sequence and function are conserved among vertebrates．T his provides a powerful tool for future study on gene function and its possible application．

Key words：rare gudgeon；Cerulo p lasmin；g ene cloning；sequence analysis；g ene expression

责任编辑　周仁惠

稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因 cDNA 克隆及组织表达分析

作者：景致， 彭作刚， 张耀光， JING Zhi， PENG Zuo-gang， ZHANG Yao-guang

作者单位：西南大学生命科学学院/淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室/水产科学重庆市市级重点实验室,重庆,400715

刊名：

西南师范大学学报（自然科学版）

英文刊名：Journal of Southwest China Normal University (Natural Science Edition)

年，卷(期)：2014(10)

引用本文格式：景致.彭作刚.张耀光.JING Zhi.PENG Zuo-gang.ZHANG Yao-guang稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因 cDNA 克隆及组织表达分析[期刊论文]-西南师范大学学报（自然科学版） 2014(10)

绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取

绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#

绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录

1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿

色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产

红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

基因的克隆、表达载体构建与功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，

移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告

题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。

3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。

一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.wendangku.net/doc/a87794212.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.wendangku.net/doc/a87794212.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.wendangku.net/doc/a87794212.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.wendangku.net/doc/a87794212.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.wendangku.net/doc/a87794212.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发

基因克隆和表达

Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/a87794212.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006

gfp基因的克隆与表达

基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L

生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告

学号：班级：姓名： 《生物化学与生物分子学实验》 ——分子生物学设计性实验开题报告 实验课题：绿色荧光蛋白的基因克隆及表达 指导老师： 作者姓名： 所在院系： 小组编号： 小组成员： 完成时间：

成都医学院 Cheng Du Medical College 题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。 3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出

目的基因的克隆与及表达

分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定

(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)

第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中

目的基因的克隆表达

目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照， 不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环

（6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2）在微波炉中打化，每20s摇一下 （3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记

绿色荧光蛋白的基因克隆及表达

绿色荧光蛋白的基因克隆和表达的研究 沈国军（指导老师：王友如） （湖北师范学院生命科学学院湖北黄石435002） 引言 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。 2008 年10 月8 日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白的发现者和推广者。他们分别为日本科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·查尔菲(Martin Chalfie)和钱永健(Roger Tsien)[3]。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[4]。1994年，查尔菲等首次在大肠杆菌细胞中表达了能发射绿色荧光的GFP，开创了GFP 研究与应用之先河[5]。 绿色荧光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP)是238个氨基酸组成的单体蛋白，其分子量为27 kDa。GFP作为一种新的报告基因，与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，