幼年大鼠癫痫持续状态海马齿状回神经元发生与突触重建的 …
缩略词表
Abbreviation
缩略词英文全称中文全称BrdU 5-bromo-2’-deoxyuridine 5-溴脱氧尿核苷BDNF Brain-derived neurotrophic factor 脑源性神经营养因子COD Corrected opitical density 校正吸光度
CNS Central nervous system 中枢神经系统
DAB Diaminobenzidine 3,3-二氨基联苯胺DG Dentate gyrus 齿状回
GCL Granule cell layer 颗粒细胞层
GFAP Glial fibrillary acidic protein 胶质原纤维酸性蛋白i.p. Introperitioneal 腹腔内注射
IGF-I Insulin-like growth factor-I 胰岛素样生长因子KA Kainic acid 红藻氨酸（海人酸）LTP Long-term potentiation 长时程增强
MK-801 5-methyl-10,11-dihydro 5-甲基二氢二苯并环-5H-dibenzocyclohepten- 庚烯亚胺马来酸
戊四氮诱导发育鼠癫痫持续状态后海马内
神经发生与突触重塑的研究
中文摘要
目的目前，对癫痫反复发作的病因的说法很多，但齿状回颗粒细胞的神经发生增加，颗粒细胞的苔藓纤维异常发芽及伴随的突触重塑已被认为是其细胞机制之一。故近年有关神经发生和突触重塑的研究正成为脑科学中令人瞩目的热点，但是这些现象对临床上常见的儿童癫痫反复发作的病因是否有作用，目前还少有报道。
方法腹腔注射戊四氮制作发育期SD大鼠（7天、14天、21天和28天四个日龄组）癫痫持续状态(SE)发作模型，再将各日龄组随机分为NS组、SE组和MK-801组，选择处理后第7天、14天和28天三个时间点进行观察。
结果BrdU免疫反应产物：SE发作后第7天和14天，SE组中各日龄组幼鼠齿状回BrdU 阳性细胞数明显高于各自的NS组（P＜0.01），而MK-801组较SE组明显减少（P＜0.05），但在第28天三组之间无明显差异（P＞0.05）；发作后第7天，三组中大部分BrdU阳性细胞分布于颗粒下层。
结论 1.癫痫持续状态发作可使不同日龄的发育鼠脑内齿状回神经元发生数量的增加、位置的迁移和异位以及突触的重塑。2.NMDA受体在癫痫后的神经元发生和突触重塑中起着
促进作用。
关键词发育鼠；癫痫持续状态；突触素；海马；BrdU；MK-801
The study of neurogenesis and synaptic plasticity in hippocampus following pentylenetetrazol-induced status epilepticus of developing
rats
Abstract
Objective Recently dentate granule cell neurogenesis in hippocampus and mossy fiber abnormal sprouting and synaptic reorganization have been identified as one of cell mechanism of recurrent attacks of epilepsy. Thus the research of neurogenesis and synaptic reorganization has been one of hot spots in adult brain study. But there was little data of epilepsy mechanism on children with recurrent epilepsy frequently in clinic.
Methods Postnatal day(P) P7, P14, P21 and P28 Sprague Dawley(SD) rats were received PTZ to make status epilepticus models, which were divided randomly into SE group, we subjected MK-801 to rats after PTZ and observed the changes of them above.
Results 1. BrdU immunohischemistry: Quantitative analysis of BrdU labeling revealed a significant increase in the proliferation rate of neural precursor cells in the dentate gyrus 7 days and 14 days after SE. But on 28 days after SE there was no difference among three groups (P＞0.05).
Conclusion SE may induce the neurogenesis and synaptic plasticity in hippoca- mpus in developing brain. In the process of neurogenesis, there is an increase in number and migration in location. And NMDA receptor plays an important role in the neu rogen- esis of hippocampus and synaptic plasticity after seizures.
Key words developing rats; status epilepticus; neurogenesis; synaptophysin; hippocampus; MK-801
前言
癫痫(Epilepsy)是最常见的神经系统疾病之一，是由于脑细胞突然异常放电所引起的反复性惊厥发作。近年来由于环境和心理因素癫痫的发病率有逐年增高的趋势，据统计我国每年新发癫痫在40万例左右，其中高发区每年每十万人口新发病例60例左右，而儿童癫痫发病率比成人高出1～4倍，尤以出生后1岁内发病率最高[1]。因此对儿童癫痫的发病机制和治疗的研究越来越受到重视，但对于癫痫机制研究的思路和设想目前大多来源于对癫痫病灶的病理和生化活动的详细观察。由于癫痫病灶最常见的病理变化（以海马区为例）是神经元变性、凋亡和坏死，未死亡神经元树突分布范围的缩小和突触棘的消失，胶质细胞的增生以及海马颗粒细胞的轴突发芽等。因此，大多数癫痫的机制假说均以此为依据。
目前，对癫痫反复发作的病因的说法很多，但齿状回颗粒细胞的神经发生增加、颗粒细胞的苔藓纤维异常发芽及伴随的突触重塑已被认为是其可能的细胞机制之一。过去研究认为，哺乳类中枢神经系统的神经发生主要限于胚胎期，而且认为出生后将不再存在神经发生现象。但
近来研究发现，脊椎动物中枢神经系统很多区域包括海马齿状回在生后乃至成年的整个发育期仍然保持着神经发生的能力，并在某些生理刺激和病理因素作用下，这些部位的神经发生表现出明显的增强趋势[2~3]，从而使人们对神经元再生的认识产生了根本性改变，并揭开了中枢神经系统神经再生在不同病理状态下如何发挥作用的新研究。另外，神经系统受损后现存的神经元可通过轴突出芽形成不同的径路与原有的突触后位点或新的突触后位点发生接触, 形成新的突触；同时，平时处于休眠状态的侧支和突触联系在病理状态下被激活，从而完成神经回路的改造和突触的重塑。
材料和方法
1 材料
1.1
戊四氮S i gm a公司
B r d U S i gm a公司
抗体稀释液北京中山生物技术有限公司
T r i t o n-x100华美生物工程公司
1.2 仪器
F A1004型电子天平上海天平仪器厂
O l y m p h u s P M-C B日本奥林巴斯公司
K D1508轮转式切片机浙江金华科迪设备有限公司S2-93自动双重纯水蒸馏器上海亚莱生化仪器厂各种微量加样仪芬兰L a b s ys t e m公司2 方法
2.1 研究对象选择健康Sprague Dawley（SD）大鼠出生后第7天、14天、21天和28天（Postnatal,P7,P14,P21,P28）四个日龄组，雌雄不限，同一日龄组内体重相近，各组均为54只，共计216只，由徐州医学院实验动物中心提供。将大鼠再随机分为癫痫持续状态组（SE
结果
1 动物模型行为表现
SE组和MK-801组：注射PTZ后经过1～2 分钟的潜伏期，大鼠由自由活动状态逐渐转为安静或俯卧，随后出现眼神呆滞，头面部肌肉轻微抽搐，伴有须动、耳抖和搔抓动作，继而进入大发作期，渐次出现前肢阵挛、狂奔、跳跃、嘶叫、后肢站立伴头偏向一侧及全身阵发性抽动；达到7级发作的动物则表现为摔倒、翻滚等全身强直-阵挛性发作，同时伴有喉鸣、口角流涎、肢端青紫等。整个发作持续为1小时后经注射安定后逐渐缓解，发作停止后，动物可自由活动。NS组：注射NS后无任何发作迹象和抽搐表现，行为正常。
2 BrdU免疫反应产物
SE发作后第7天和14天，SE组各日龄组幼鼠齿状回BrdU阳性细胞数明显高于各自的NS组，同时MK-801组较SE组明显减少（P＜0.05），但在第28天时三组之间无明显差异（P ＞0.05）（见表1和图2～5）。SE发作后第7天，三组幼鼠的大部分BrdU阳性细胞分布于颗粒下层(见图1 A)，发作后第14天，新生细胞在SE组和MK-801组幼鼠中除主要分布于颗粒细胞层以外，另有一部分位于门区和内分子层(图1 B)，而在NS组幼鼠的BrdU阳性细胞主要分布于整个颗粒细胞层（见图1 C）。新生细胞在由颗粒下层向颗粒细胞层迁移的过程中，胞核变大，形状更接近圆形或卵圆形（见图1 D）。阴性对照试验切片无特征性免疫反应产物。
讨论
本实验中对发育鼠年龄的选择是基于人脑和大鼠脑发育程度的对应关系。虽然大鼠脑发育与人脑发育的年龄对应关系目前还不十分清楚，但普遍接受的观点认为，生后5～7d大鼠的脑发育程度与足月新生儿的脑发育程度相当，15d大鼠的脑发育程度与1岁儿童相当，28～30d大鼠的脑发育程度与2岁儿童相当[6]，大鼠于生后50d左右进入青春期，生后60d性成熟。由于儿童癫痫发病率比成人高，以出生后2岁内发病率最高，因此本试验中选择发育鼠的年龄段与人类癫痫的好发年龄相当，能够很好地反映出癫痫发作对发育期大鼠的脑损伤结果。
本实验中采用BrdU来标记新生细胞是源于以下理论：细胞增殖周期包括G1、S、G2和M期4个时期，S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA 的原料掺入到DNA中。故BrdU标记和检测的准确性高，而且方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖的理想指标[7~8]，目前已被越来越多地用于神经发生的研究领域。
一、癫痫发作后的齿状回神经发生
人和大多数哺乳动物的部分脑区产生新神经元的过程称之神经发生[9]，主要存在于海马齿状回及侧脑室下带（subventricular zone, SVZ）等脑区，最近研究表明在动物的一生中，这些地方不断地进行着干细胞和祖细胞的分裂并生成新神经元。DG各区均有不同程度的颗粒细胞前体增殖，新生神经元发育产生轴、树突并建立突触联系，而这一过程极易受个体所处的外界环境和病理因素的影响，使得海马区结构具有极大的适应性和可塑性。
结论
本实验条件下
1．SFI可以改善HIBD 新生大鼠的生长发育，提高其生存率。
2．SFI减少HIBD 新生大鼠海马神经元凋亡的发生。
HIBD新生大鼠海马CA1区锥体细胞Bcl-2的蛋白表达，减弱Bax蛋白的表达。
3．SFI能增强
论文图片
Fig1 PNA(10μmol/L) group RCC cell apoptosis
参考文献
1．吴逊. 癫痫和发作性疾病. 北京：人民军医出版社，2001(9)：6-7.
2．Eriksson PS, Perfilieva E, Bjork-Eriksson T, et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med, 1998, 4(11): 1313-1317.
3．Dash PK, Mach SA, Moore AN. Enhanced neurogenesis in the rodent hippocampus following traumatic brain injury.J Neurosci Res, 2001,63(4): 313-319. 4．Lado FA, Sperber EF, Moshe SL. Anticonvulsant efficacy of gabapentin on kindling in the immature brain. Epilepsia, 2001, 42(4): 458-463.
5．Nakagawa E, Aimi Y, Yasuhara O, et al. Enhancement of progenitor cell division in the dentate gyrus triggered by initial limbic seizures in rat models of epilepsy. Epilepsia, 2000, 41(1): 10-18.
6．Jiang W, Guong TM, de Lanerolle NC. The neuropathology of hyperthermic seizures in the rat.
Epilepsia, 1999, 40(1): 5-19.
7．Nakamura S, Takeda Y, Kanno M, et al. Application of bromodeoxyuridine (BrdU) and anti-BrdU monoclonal antibody for the in vivo analysis of proliferative characteristics of human leukemia cells in bone marrows. Oncology, 1991, 48(4): 285-289.
8．Ci1io MR, Sogawa Y, Cha BH, et al. Long-term effects of status epilepticus in the immature brain are specific for age and model. Epilepsia, 2003, 44(4): 518-528.
9．Gage FH. Neurogenesis in the adult brain. J Neurosci, 2002, 22(3): 612-613.
10．Kornack DR, Rakic P. Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque
缺氧缺血性脑损伤细胞凋亡的
机制及治疗进展
综述
新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)系新生儿窒息后严重并发症, 是导致新生儿死亡及影响神经预后的严重疾病。该病病情重,病死率高, 并可能产生永久性神经功能障碍, 如智力低下、癫痫、脑性瘫痪、痉挛和共济失调等。因此及时诊断和采用有效的治疗手段对提高存活率减少后遗症有重要意义。对于新生儿HIBD的发病机制和防治方法的研究, 由于受到临床多方面条件的制约, 很多资料难以获得, 因此目前多采用HIBD动物模型进行实验研究。不同种类动物出生时, 脑发育并不处于同一阶段,人脑发育的高峰期即脑占体重的百分比最大的时候在出生时, 这与7日龄新生大鼠的脑处于同一发育阶段[1], 现就以新生大鼠为模型对HIBD细胞凋亡的机制及其治疗进展作一综述。
1 凋亡的概念
细胞凋亡是个体发育过程中基因调控下的细胞自杀活动, 是机体为调控机体发育、维持内环境稳定, 由基因编码程序的细胞主动死亡过程。细胞首先接受、识别某些特殊的生理或病理性刺激信号, 然后启动细胞特有的基因或基因群, 通过mRNA转录, 合成一组致死性效应蛋白质, 从而导致细胞解体、死亡, 是机体对外界刺激进行主动应答过程。
攻读硕士学位期间发表学术论文题目
1．戊四氮诱导发育鼠癫痫持续状态后海马突触素的变化及MK-801的影响.徐州医学院学报，2006，26(2)：120-124.
2．戊四氮诱导发育鼠癫痫持续状态后海马神经发生及MK-801的影响（中国当代儿科杂志，已修回）
3．24h
临床培训小结
本人于2006年九月考入徐州医学院临床医学系攻读心血管内科学硕士学位。三年来，在
理论学习、
一
徐州医学院附属医院心内科，临床培训15个月
2007年3月～2008年3月，2009年3月～2009年5月
二、培训内容
1、临床专业理论学习
临床培训期间，在导师的指导下对心内科及相关专业理论知识进行了系统全面的学习，通过了专业课和专业英语的考核。对心内科常见病、多见病、疑难病的病因、病理机制、鉴别诊断及诊断治疗有了更加系统全面的认识。
2、临床技能学习与实践
在临床培训期间参加学习和管理了大量的心内科常见病、疑难病及急危重症病例，包括高血压病、冠心病、心肌炎、心肌病、心力衰竭、瓣膜病、高血压急症、急性心肌梗死、肺栓塞、恶性心律失常。并基本掌握了以上疾病的诊断及治疗方法。
在临床培训期间，对本专业相关X片、冠脉CTA、心电图、动态心电图、核磁共振、心脏ECT进行了大量的学习，掌握了常见病的影像学诊断如：肺部疾病、心包积液、肺动脉高压、肺栓塞、心律失常、缺血性心电图改变、心肌梗死心电图改变、主动脉夹层、冠脉狭窄、风湿性心脏病、先天性心脏病的诊断。
对心脏彩色多谱勒超声检查有了系统的学习，掌握了多种疾病的诊断如：先天性心脏病的房间隔缺损、室间隔缺损、法洛氏四联症、肺动脉狭窄、风湿性心瓣膜病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、急性心肌梗死、室壁瘤。
对冠脉造影、心室造影、冠脉支架植入术、起搏器植入术、瓣膜成形术、数字血管减影的学习有了深刻的体会。
三、临床能力评估
通过严格的临床培训，目前可独立完成心内科常见操作如：胸腔穿剌、心包穿剌；完成心内科常见急症的诊断、治疗及紧急处理；对本专业相关辅助检查结果可以做出较准确的诊断。可以协助老师完成本专业的高难度手术。
四、总结
通过临床培训，不仅使我的临床心血管内科专业技能得到了很大的提高，更开阔了思维，增长了知识，为毕业后更好的从事临床心血管内科工作打下了坚实的基础！
致谢
的经历将成为我此后工作和学习的一笔宝贵的财富。导师在百忙之中以很大的精力和热情给予本课题悉心的指导和帮助，没有这些指导帮助，本课题最终成文是难以想象的。
感谢徐州医学院附属医院儿科全体老师，特别感谢卢思广教授、王军副教授、程华主任医师、薛天阳主任医师、高莉莉主任医师、路明主任医师等对我学习、科研及生活中的谆谆教诲、悉心指导和热情关怀，并在临床工作中给予的指导和帮助。
感谢徐州医学院神经解剖教研室王梅申老师为本课题提供良好的实验条件和学术气氛，耐心帮助我解决试验技术上的各种难题。
感谢所有帮助过我的同学，尤其是杨丽娟、张红、陈光侠、李国民、汪自龙、刘畅等在
我试验中给以自始至终的帮助和无私的奉献，感谢他们在我遇见困难时，给予我亲如兄弟姐妹般的情谊。
特别感谢我的爱人李旭东和家人给予我默默地关心、支持与鼓励，使我能够自信、专心地学习和工作。
再次感谢所有关心、支持和帮助过我的老师、同学和朋友！
论文独创性声明
本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。
作者签名：
论文使用授权声明
本人完全了解徐州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。
作者签名：导师签名：日期：200 年月
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导师签名：日期：200 年月