分离名词解释

10 蛋白质复性

包含体（inclusion body) 重组蛋白质的高表达常常导致其在细胞内发生错误折叠和聚集，形成被成为包含体的聚集体。

包含体主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物，这些基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，没有生物活性。

以包含体形式表达的蛋白质，需要在回收后溶解，使其肽链伸展（unfolding)，然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性。这一过程称为蛋白质的体外再折叠（refolding）或复性（renaturation）。

10.1.1 包含体的形成

氨基酸顺序决定了蛋白质的立体结构。理论上蛋白质折叠成天然活性状态是自发完成的，但伸展的肽链折叠成立体结构的过程受周围环境的影响。

包含体是在表达产物翻译后立即形成，包含体内的表达产物具有部分二级结构。

一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态（intermediates)之间疏水性相互作用的结果，主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如温度、离子组成）不适或缺少某些折叠辅助因子（如分子伴侣）的作用。

在大多数情况下，包含体的形成是蛋白质过量表达的结果，而与蛋白质种类和表达系统无关。对于任何蛋白质和任何表达系统，在过量表达的情况下都可能形成包含体。

活性产物N的形成为分子内折叠反应，折叠速率与浓度成正比；聚集体A的形成反应在分子间发生，反应速率与浓度的高次方成正比，即反应级数≥2。因此如果新生肽折叠成天然活性蛋白质的速度缓慢，新生肽浓度增加和中间态的疏水性相互作用就可能导致包含体的形成。

外源基因基因表达产物在原核细胞中易于形成包含体，许多蛋白质药物的生产依赖于蛋白质复性技术的提高。

蛋白质的错误折叠和聚集还可能与许多重要疾病（如阿尔茨海默症、疯牛病、帕金森症等）有关。

10.1.2 包含体的性质

较大的包含体由于其折光性的不同，可以在显微镜下观察，所以包含体又称光折射体。

以包含体形式表达重组蛋白质具有一定优势：

1、包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿主细胞的原核细胞表达系统中形成，有利于大规模生产目标蛋白质；

2、一般包含体蛋白质的表达量都很高；

3、包含体富含目的基因表达产物，有利于后续的分离纯化；

4、沉积于包含体内的目标蛋白质不易被蛋白酶水解；

5、对于那些对宿主细胞有毒害作用或杀伤作用的目的基因表达产物，以包含体形式表达是最可取的生产途径。

10.1.2 包含体的体内抑制

如果能有效地进行蛋白质的体外复性，可充分发挥包含体蛋白质表达系统的优势。

有效蛋白质很难进行体外复性，特别是相对分子质量较大，结构复杂和含有较大二硫键的蛋白质，此时应抑制包含体的生成，提高可溶性蛋白质的表达量。

方法：降低细胞培养温度，减缓蛋白质的表达速度和降低表达量；将目标蛋白质与分子伴侣蛋白、折叠酶和二硫键异构酶共表达，弥补外源蛋白质表达过程中缺乏的辅助因子；使用非代谢性碳源降低代谢速度和蛋白质表达量；将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达

10.2.1 包含体的分离纯化

蛋白质复性过程包括包含体的分离纯化、包含体的溶解已经复性等步骤。

包含体的分离从细胞破碎开始，以离心沉降或膜分离方法分离回收包含体。

包含体纯度对复性收率影响显著，为实现较高的蛋白质复性收率，必须进行包含体的纯化，除去质粒DNA、脂多糖和其他蛋白质，降低蛋白质的聚集体生成速率，促进复性方向向正确折叠的方向进行。

包含体分离纯化的一般过程：

1、细胞破碎：为提高下一步的离心效果，需进行高强度的破碎。

2、离心沉降回收包含体：较高转速下除去可溶性组分和沉降速度较小的细胞碎片，回收沉降的粗包含体。

3、粗包含体的洗涤：加入螯合剂EDTA及低浓度变性剂或表面活性剂，溶解吸附在包含体表面的磷脂和膜蛋白质。

4、离心沉降回收包含体。

10.2.2 包含体的溶解

获得适当纯度的包含体后，需溶解包含体，是目标蛋白质肽链伸展，为进一步的复性创造条件。

通常用高浓度的强变性剂溶解包含体。

溶解的包含体蛋白质中仍会有一些杂质存在，如蛋白质、核酸和细胞膜组分等。为提高复性收率，在复性前可对变性/还原的蛋白质进一步纯化。主要纯化方法有凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱和固定化金属离子色谱等。

纯化操作中要保持蛋白质的溶解状态，还可将变性蛋白质交换到酸性溶液中，冻干保存。复性前重新溶解。

10.3 蛋白质复性

降低变性剂浓度至非变性范围内可引发变性蛋白质的重折叠复性。对含有二硫键的蛋白质，其复性过程需要添加氧化剂和还原剂，条件复性液的氧化还原环境，促进正确二硫键的形成。一般认为疏水性作用在蛋白质折叠过程中发挥主要作用。

蛋白质复性的主要挑战是创造适宜的复性条件，最大程度地抑制聚集体的生成，提供复性收率。

现有的主要复性方法：稀释复性、添加剂辅助复性、分子伴侣或人工分子伴侣辅助复性、反胶团的应用、色谱柱复性等。

10.3.1 稀释复性

稀释复性是最简单和最常用的传统复性方法，根据具体操作模式又分为直接稀释复性、透析（或洗滤）复性和流加复性等。

直接稀释复性：将变性蛋白质溶液直接稀释到适宜的复性缓冲液中。变性剂浓度降低，伸展肽链迅速折叠成中间体I。复性过程可简化为中间体I折叠成天然活性态N和生产聚集体A 的平行反应。

10.3.1 稀释复性

聚集体的生成速率与蛋白质浓度的高次方成正比，浓度越高，聚集体生成速度越快，复性收率越低。降低蛋白质浓度有利于获得较高的收率。

为提高收率，通常要在较低的浓度下进行蛋白质复性操作，但降低蛋白质浓度会增大复性液的体积，为后续的分离纯化增加困难。

10.3.2 辅助因子的作用

在稀释复性中添加各种小分子溶质，以抑制聚集体的生成。利用辅助因子的稀释复性方法又称稀释添加复性。

许多小分子溶质具有促进蛋白质复性的作用，最常用的是低浓度变性剂；其他辅助因子有：精氨酸、甘油、聚乙二醇、各种表面活性剂。

一般认为辅助蛋白质复性的添加剂主要有两种作用：稳定天然态蛋白质的结构，降低错误折叠蛋白质的稳定性；提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度（稳定性）。

利用稀释添加剂应注意：

添加剂辅助蛋白质的作用具有选择性。

对于稳定折叠中间体或伸展肽链的添加剂，其辅助作用存在最佳浓度或浓度范围。

添加剂的最佳浓度或浓度范围与蛋白质种类和浓度有关。

利用添加剂提高复性收率的同时，会降低蛋白质的折叠复性速率，增加复性时间。

11 结晶

1结晶的概念

结晶是从液相或气相生成形状一定、分子（或原子、离子）有规则排列的晶体的现象。

固体有结晶和无定形两种状态

结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则

无定形固体（沉淀）：析出速度快，粒子排列无规则

2结晶操作的特点

只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。

通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。

结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便

3 结晶原理

饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；

过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；

溶质只有在过饱和溶液中才能析出；

大多数物质的溶解度随温度的升高显著增大，也有一些物质的溶解度对温度变化不敏感，少数物质的溶解度随温度升高而显著下降。

温度与溶解度的关系

由于物质在溶解时要吸收热量、结晶时要放出结晶热。因此，结晶也是一个质量与能量的传递过程，它与体系温度的关系十分密切。

溶解度是温度的函数，溶质在特定溶剂中的溶解度常用温度-溶解度曲线表示，又称饱和曲线。

4 过饱和溶液与介稳区

稳定区和亚稳定区

各区域的结晶现象：

A 稳定区，即不饱和区，此区域内即使有晶体存在也会自动溶解

B 第一介稳区，即第一过饱和区，此区域内不会自发成核，但加入结晶颗粒时结晶会生长，但不会产生新晶核，加入的结晶颗粒称为晶种

C 第二介稳区，即第二过饱和区，此区域内也不会自发成核，但加入晶种后，在结晶生长的同时会有新晶核产生

D 不稳定区，是自发成核区域，瞬时出现大量微小晶核，发生晶核泛滥

在温度-溶解度关系图中，曲线1 下方为稳定区，在该区域任意一点溶液均是稳定的；

而在曲线1和曲线3之间的区域为亚稳定区，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核），溶液可长时间保持稳定；

加入晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低，并降至曲线1；

介于饱和溶解度曲线和过饱和溶解度曲线之间的区域，可以进一步划分刺激结晶区（第二亚稳区）和养晶区（第一亚稳区）

不稳定区

在曲线3 的上半部的区域称为不稳定区，在该区域任意一点溶液均能自发形成结晶，溶液中溶质浓度迅速降低至曲线1（饱和）；

晶体生长速度快，晶体尚未长大，溶质浓度便降至饱和溶解度，此时已形成大量的细小结晶，晶体质量差；不稳定区结晶产品质量难于控制，而且结晶回收困难。

因此，工业生产中通常采用加入晶种，结晶操作均在介稳区内进行，主要在第一介稳区，将溶质浓度控制在养晶区，以利于大而整齐的晶体形成。

5影响溶液过饱和度的因素

饱和曲线是固定的

不饱和曲线受搅拌、搅拌强度、晶种、晶种大小和多少、冷却速度的快慢等因素的影响

结晶过程的实质

结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程

这一过程包括：溶质分子凝聚成固体和分子有规律地排列在一定晶格中

这一过程与表面分子化学键力变化有关；因此，结晶过程是一个表面化学反应过程。

6结晶的步骤

（1）过饱和溶液的形成（2）晶核的形成（3）晶体生长

其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。

7过饱和溶液的形成

热饱和溶液冷却（等溶剂结晶）

适用于溶解度随温度升高而增加的体系；同时，溶解度随温度变化的幅度要适中；

自然冷却、间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）、直接接触冷却（在溶液中通入冷却剂）

部分溶剂蒸发法（等温结晶法）适用于溶解度随温度降低变化不大的体系，或随温度升高溶解度降低的体系；加压、减压或常压蒸馏

真空蒸发冷却法

使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种结晶方法。设备简单、操作稳定

8成核

在一定过饱和度下存在临界晶体半径rc，半径大于rc的晶体生长，半径小于rc 的晶体溶解消失。

理论上通常将半径为rc 的结晶微粒定义为晶核，而将半径小于rc 的结晶微粒称为胚种。晶核的成核速度

定义：单位时间内在单位体积溶液中生成新核的数目。

是决定结晶产品粒度分布的首要动力学因素；成核速度大：导致细小晶体生成，因此，需要避免过量晶核的产生

9常用的工业起晶方法

自然起晶法：溶剂蒸发进入不稳定区形成晶核、当产生一定量的晶种后，加入稀溶液使溶液浓度降至亚稳定区，新的晶种不再产生，溶质在晶种表面生长。

刺激起晶法：将溶液蒸发至亚稳定区后，冷却，进入不稳定区，形成一定量的晶核，此时溶液的浓度会有所降低，进入并稳定在亚稳定的养晶区使晶体生长。

晶种起晶法：将溶液蒸发后冷却至亚稳定区的较低浓度，加入一定量和一定大小的晶种，使溶质在晶种表面生长。

该方法容易控制、所得晶体形状大小均较理想，是一种常用的工业起晶方法。

10影响晶体生长速度的因素

杂质：改变晶体和溶液之间界面的滞留层特性，影响溶质长入晶体、改变晶体外形、因杂质吸附导致的晶体生长缓慢；

搅拌：加速晶体生长、加速晶核的生成；温度：促进表面化学反应速度的提高，增加结晶速度；

11提高晶体质量的方法

晶体质量包括三个方面的内容：晶体大小、形状和纯度

影响晶体大小的因素：温度、晶核质量、搅拌等

影响晶体形状的因素：改变过饱和度、改变溶剂体系、杂质

影响晶体纯度的因素：母液中的杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布

重结晶：是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。

11.5.1 结晶操作特性

增大溶液过饱和度可提高成核速率和生长速率，但过饱和度过大影响结晶质量

本章作业

结晶操作的原理是什么？饱和溶液和过饱和溶液的概念凯尔文公式的内容和意义是什么？结晶的一般步骤是什么？过饱和溶液形成的方法有哪些？绘制饱和温度曲线和过饱和温度曲线，并标明稳定区、亚稳定区和不稳定区。

常用的工业起晶方法有哪些？重结晶的概念

12 干燥

干燥的基本概念

用热能加热物料，使物料中水分蒸发而干燥或者用冷冻法使水分结冰后升华而除去的单元操作；

通常是生物产品分离的最后一步

干燥过程中应注意：热敏性物质严格控制操作温度和操作时间，操作温度不使物质热分解、着色、失活和变性，在最短时间内完成干燥处理；在洁净环境中操作，防止微生物污染

物料内水分的种类

（1）化学结合水：水分与物料的离子型结合和结晶型分子结合（结晶水），结晶水的脱除必将引起晶体的崩溃；

（2）物化结合水：包括吸附、渗透和结构水分，其中吸附水分结合力最强；

（3）机械结合水：毛细管水、湿润水分、孔隙水份，其中，结合水（包括细胞含水、纤维束含水以及毛细管水）较难以除去；而非结合水（物料表面的湿润水分和孔隙水份）较容易除去

（1）平衡水分：

当一种物料与一定温度及湿度的空气接触时，物料势必会放出或吸收一定量的水分，物料的含水量会趋于一定值。此时，物料的含水量称为该空气状态下的平衡水分。

平衡水分代表物料在一定空气状态下的干燥极限，即用热空气干燥法，平衡水分是不能去除的

（2）自由水分

在干燥过程中能够除去的水分，是物料中超出平衡水分的部分