丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展_刘德辉
中国生物制品学杂志2010年2月第23卷第2期Chin J Biologicals February 2010，Vol.23No.2通过微生物表达各种蛋白已成为一种很普遍的方法，丝状真菌由于其能高效表达异源蛋白而越来越受到人们的重视［1］。丝状真菌表达异源蛋白具有表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞等特点，且表达的外源蛋白具有天然活性。另外，丝状真菌还能进行各种翻译后加工，如糖基化修饰、蛋白酶切割和二硫键的形成等［2］。丝状真菌具有良好的安全性，许多菌种如黑曲霉（A.niger ）、米曲霉（A.oryza e ）和瑞氏木霉（T.reesei ）等已长期应用于食品及食品加工业，并被联邦食品与药品管理局认定属于GRAS 和FDA 范围的菌株［3］。同时，丝状真菌的发酵程序较成熟，且成本较低，为其投入工业化生产奠定了良好的基础。许多同源和异源蛋白已在丝状真菌中实现高效表达，丝状真菌中的曲霉属和赤霉属的一些种,在理想的培养条件下发酵，分泌葡糖淀粉酶的产率可达20g ／L 发酵液,分泌纤维素酶可达40g ／L 发酵液，是T.reesei 胞外分泌性蛋白总量的50%,比一般细菌高出2～400倍
［4］
。但来源于其他高等生物，如
动物和植物基因的表达量不高［5］。为了提高丝状真菌异源蛋白的分泌表达量，研究者进行了多方面研究。本文从基因表达与调控、蛋白质分泌途径及丝状
真菌菌株等方面对丝状真菌高效表达异源蛋白的最新研究进展作一综述。1.
基因表达与调控
1.1引入多拷贝、正向调控基因：引入多拷贝的表达载体，一般可以提高表达量。Verdoes 等［6］在黑曲霉中增加葡糖淀粉酶基因拷贝数，结果酶表达量在一定范围内与拷贝数（1～20拷贝）呈线性关系，但随着拷贝数的进一步提高，表达量不再升高。原因可能是由于引入多拷贝基因的调控区，引发了调控蛋白的滴定效应。但在引入多拷贝调控基因时，将激活转录的正调控基因同时引入宿主，以表达足够量的调控蛋白，可去除滴定效应，促进外源蛋白的高表达。Allelix 生物制药公司用含多拷贝alcA 启动子的表达载体在A.nidulans 中表达人干扰素α时，由于每个拷贝alcA 启动子上可结合的反式作用因子al －cR 的减少，抑制了产物的表达。alcR 基因产物的滴定效应可通过引入宿主染色体的alcR 的过量表达而得到解决，从而增加干扰素α的表达量［7］。1.2构建融合基因：丝状真菌表达的很多自身蛋白能够高效分泌到胞外，异源基因通过基因融合的方法取代某个分泌性良好的同源蛋白基因的3′端，表达融合蛋白，并分泌到细胞外，不仅便于分离纯化,也有利于蛋白的累积。在构建融合蛋白时，一般利用
作者单位：华南农业大学兽医学院（广州510642）.
通讯作者：黄毓茂，E -mail ：ymaohuang@https://www.wendangku.net/doc/a58569047.html,
中国图书分类号Q949.32文献标识码A
文章编号1004-5503（2010）02-0221-04
【综述】
丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展
刘德辉
黄毓茂
徐蕙
【摘要】丝状真菌作为细胞工厂在生物技术领域被广泛应用于生产药物、化学试剂和酶类。近年来，丝状真菌基因组学领域取得了快速发展，利用丝状真菌表达异源蛋白也越来越受到重视。本文从基因表达与调控、蛋白质分泌途径及丝状真菌菌株等方面对丝状真菌高效表达异源蛋白的最新研究进展作一综述。【关键词】丝状真菌；基因组学；蛋白质分泌；异源蛋白；表达
Advance in Research on High Expression of Heterologous Protein in Filamen －tous Fungi
LIU De -hui,HUANG Yu -mao,XU Hui （College of Veterinary Medicine ,South China Agricultural University ,Guangzhou 510642,China ）
【Abstract 】Filamentous fungi are widely used in biotechnology as cell factories for the production of pharmaceuticals,chemi －cals and enzymes.The study of gene function in filamentous fungi is a field of research that has made great advances in very recent years.Filamentous fungi are widely developed for the production of heterologous proteins.This review describes the recent advances in research on high expression of heterologous protein in filamentous fungi,such as gene expression and control,protein secretion pathway and filamentous fungus strains.
【Key words 】Filamentous fungi;Genomics;Protein secretion;Heterologous protein;Expression
221··
DOI ：10.13200/j.cjb.2010.02.115.liudh.009
可高效表达分泌的内源蛋白作为载体蛋白，辅助靶蛋白通过分泌途径。由于丝状真菌的分泌系统最适合其内源蛋白的分泌，因此与其融合的异源蛋白便可借助内源蛋白的分泌而增加分泌。目前通常使用葡糖淀粉酶的催化结构域来融合目的蛋白，表达的融合蛋白可用蛋白水解酶特异性水解N-端氨基酸序列，从而得到目的蛋白产物［8］。通过基因融合表达蛋白的方法一直被认为是提高异源基因表达量的首选方法，且被广泛应用，但其机制尚未完全明确,有研究者试图通过融合基因提高表达量，但未获得成功［9］。
1.3使用强启动子：为使丝状真菌能够高效分泌表达异源蛋白，往往选用一些宿主自身的强启动子来进行调控。其中，使用最多的是曲霉葡萄糖淀粉酶基因（glaA）启动子、构巢曲霉的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（gpdA）启动子、米曲霉的α-淀粉酶基因（amyB）启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶基因（cbh1）启动子。Andrie等［10］用来自Pyrenophora tritici repentis （属于半知菌亚门）的ToxA和ToxB启动子表达了多种异源基因,并详细阐述了ToxA和ToxB作为丝状真菌异源表达启动子的潜力,为今后使用这两种启动子提供了依据。Temporini等［11］研究发现，用粗糙链孢霉的cfp基因启动子在丝状真菌中表达异源蛋白时,其表达量受碳源影响明显，可通过改变碳源来阻遏或诱导异源蛋白的表达。
2.蛋白质分泌途径
蛋白质的分泌是涉及多种细胞器的复杂过程［12］。Gouka等［13］发现，分泌蛋白的成熟如糖基化和专一蛋白酶裂解过程，发生在内质网（Endoplasmic retic－ulum，ER）、高尔基体和一些具有分泌、转运作用的细胞器。丝状真菌的外源蛋白的分泌可能在蛋白质分泌某个或某几个环节受到障碍。
2.1内质网：分泌表达的异源蛋白需要在ER中经正确折叠后才具有生物活性，未正确折叠的蛋白会滞留在ER中或被ER降解清除，这将严重影响蛋白的转运和分泌［14］。蛋白质靶向ER有两种途径，一种为信号识别颗粒蛋白SRP依赖途径，即蛋白质翻译与进入ER同时进行，通过转位，进入膜结合的囊泡，再由囊泡运输或在胞内定位或与质膜融合。信号肽切除、蛋白折叠、二硫键形成、糖基化以及前导肽切除均在这一过程完成。另一种为非SRP依赖途径，翻译后蛋白靶向ER，此过程涉及分子伴侣Bip。Raden等［15］报道，信号肽的疏水性决定了每种蛋白的靶向路线，即信号肽序列疏水性弱的蛋白通过非SRP依赖途径，但信号肽疏水性强时，两条路线均可行。已知在A.niger中存在S.cerevisiae信号识别颗粒蛋白SRP54的一个类似物，且许多真菌均含有与S.cerevisiae相类似的KAR2／BiP，因此两种路线可能也存在于丝状真菌中［16，17］。
AL-Sheikh等［18］在丝状真菌中发现一个新的反馈途径，称为分泌压力抑制。该途径在蛋白分泌压迫时发挥作用，下调一些基因的转录水平。
2.2高尔基体：在电子显微镜下可以看到，丝状真菌的高尔基体在菌丝的顶端，呈细孔状结构［19］，而正确折叠的蛋白质从内质网靶向高尔基体进行进一步的修饰，说明蛋白的修饰与分泌主要在菌丝的顶端。在高尔基体中发生的N-、O-糖基化，几乎普遍存在于丝状真菌的胞外蛋白中，N和O寡聚甘露糖在丝状真菌中居优势的是葡萄糖，也有在聚糖分子上连接半乳糖、磷酸、硫酸和简单的N-乙酰葡糖胺的报道［20］。更复杂的典型哺乳动物糖蛋白的糖链结构在丝状真菌中却未发现，可能因为丝状真菌中缺少高等真核生物所含有的某些糖基转移酶。当正确糖基化对某些哺乳动物蛋白活性有重要影响时，丝状真菌系统的应用受到限制。为此，已有报道将丝状真菌所不具备的糖基化转移酶基因引入丝状真菌，如哺乳动物的N-乙酰葡糖胺转移酶I已在A.nidulans 中成功表达。进一步解决此问题可采取破坏典型的真菌糖链结构，提供转化引入的哺乳动物糖基转移酶的底物，也许能将丝状真菌的糖基化模式转化为哺乳动物类模式［21］。
2.3囊泡转运：细胞物质转运实质上是细胞内的一个庞大而复杂的物流系统。分泌途径是胞外蛋白生产的关键，囊泡是这一物流系统中的一种可调控的重要的运输工具。丝状真菌中的囊泡转运可能是异源蛋白生产的瓶颈，且具有潜在的可提高分泌能力的机制［22］。液泡内含有很多液泡蛋白水解酶，如液泡靶向信号不存在，则到达液泡的蛋白便被降解，说明液泡靶向可能依赖于错误折叠蛋白的伸展二级结构形式的识别［23］。目前，真菌中液泡降解对外源蛋白产量的影响程度尚不明确，因此，对液泡蛋白水解酶的研究对工业上生产异源蛋白具有重要意义。一些研究机构也正在构建一些不分泌液泡水解酶的丝状真菌菌株，用于商业生产异源蛋白［24］。
目前，对丝状真菌囊泡转运蛋白机制了解甚少，但最近，Kuratsu等［25］在A.oryzae中利用增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）检测N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感因子吸附蛋白受体SNARE。SNAREs保证了识别的特异性和介导运
输小泡与靶膜的结合。位于靶膜上的叫t-SNAREs，位于运输小泡上的叫γ-SNAREs。t-SNAREs和γ-SNAREs相互缠绕形成跨SNAREs复合体，并通过这个结构将运输小泡的膜与靶膜融合在一起，实现运输小泡的特异性停止和融合［26，27］。有研究发现，不同的丝状真菌拥有质膜syntaxin样t-SNAREs受体的数量不同，A.nidulans和A.fumigatus仅有1个蛋白，而A.niger、Neurospora crassa和T.reesei具有2个质膜syntaxin样t-SNAREs受体［28，29］。这意味着丝状真菌至少存在两种不同的分泌途径，也许能解释丝状真菌高效分泌同源和异源蛋白的原因。
3.丝状真菌菌株
3.1菌株稳定性：丝状真菌的稳定性是分泌表达异源蛋白的前提，多种外源和内源因素均可诱发丝状真菌细胞凋亡［19］。此现象与动物细胞凋亡具有相似的表型和生理生化特征,如细胞核染色体收缩、细胞质液泡化、细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻、染色质DNA断裂等。另外，Chen等［30］和Barhoom等［31］分别发现，在酿酒酵母和紫花苜蓿的真菌病原体胶孢炭疽中表达人源抗凋亡基因Bcl-2，能抑制细胞凋亡过程。丝状真菌的线粒体是其能量工厂，参与多种调控过程。动物细胞凋亡存在线粒体通路，而丝状真菌凋亡也依赖有功能的线粒体并产生ROS［32，33］，ROS 参与许多真菌细胞凋亡的调控。Chen等［34］报道，DARas突变导致的刺盘孢菌（C.trifolii）细胞凋亡过程中，ROS水平升高。添加外源抗氧化剂L-脯氨酸能避免死亡并回复野生型表型［35］。丝状真菌存在多核现象，转入的异源蛋白基因一般不可能同时整合到所有细胞核中，因此会引起同一隔室内同时出现整合目的基因的细胞核与非整合目的基因的细胞核，从而引起转化子出现异核现象［36］。因此，在获得初始转化子后，筛选一定数量的单孢子十分必要，可以降低阴性转化子和异核的可能性。丝状真菌表达异源蛋白需要利用很多能量和代谢资源，这将增加细胞代谢的负担，而且生产重组蛋白的菌株经常被不生产重组蛋白的菌株代替，低产量或不产生异源蛋白的菌株生长效率更快［37］。
丝状真菌生长的环境因素也会影响其稳定性，进而影响表达的异源蛋白的稳定性。不同的培养方法产生的丝状真菌形态不同，其分泌效率也会不同。菌体的生长反过来也会改变培养基的流动性，造成营养物质、氧气和pH值等在发酵罐中分布不均，如重组葡萄糖淀粉酶在pH4.0的培养基中可以高浓度表达，而在pH5.4的同样培养基中却很快丧失表达能力［38］。
3.2蛋白酶缺陷型菌株：蛋白降解已成为影响分泌蛋白产量的重要因素之一，丝状真菌自身产生的蛋白酶对于蛋白生产是一个极大的障碍。与同源蛋白相比较，对异源蛋白生产的影响更大。这些蛋白酶或位于细胞内或分泌到细胞外，能迅速降解多种异源蛋白。因此，编码蛋白酶基因的缺失或破坏是改善表达系统的有效方案。目前，编码内源蛋白酶的许多基因已被克隆，并用于构建特定蛋白酶缺陷的菌株。Berka等［39］克隆了编码内源Aspergillusin A的基因，并通过同源重组方式破坏了生产菌株中的该基因，使得分泌的凝乳酶Chymosin的表达水平在原有基础上增加了25倍。在A.niger中已构建1株pepA、pepB和pepE基因破坏的菌株［40］，该菌株的培养滤液可使敏感蛋白PELB的体外降解明显减少。刘丽等［41］利用自外诱变技术成功筛选出1株酸性蛋白酶活性缺陷的黑曲霉菌株，其生长特性和糖化能力与一般菌株无异，但其胞外酸性蛋白酶活性只有正常菌株的0.76%。他们还利用VHB报告基因比较这株黑曲霉在转录和分泌水平上的差异，结果显示, VHB的分泌量与酸性蛋白酶活性呈明显负相关，蛋白酶缺陷型菌株表达量比出发菌株增加了约5倍。目的蛋白不仅会被共分泌的蛋白酶降解，而且还会受胞内蛋白酶的作用，以及从自溶的菌丝中释放至培养液的蛋白酶的降解［42］。
4.展望
丝状真菌作为异源蛋白生产的细胞工厂，在工业、农业、医药以及基础生物学研究中具有重要作用［43］。近年来，多个同源、异源蛋白通过丝状真菌实现了高效工业化生产。但丝状真菌在表达异源蛋白时仍存在一些问题，如基因组水平、分泌途径和修饰加工等，但从丝状真菌已表现出的优良性状及不断发展的生物学技术来看，相信在不久的将来，利用丝状真菌工业化高效表达异源蛋白必将实现。
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（收稿日期：2009-04-10）
霉菌毒素简介
一、疾病概述 谷物和饲料中霉菌毒素的发生霉菌毒素是谷物或饲料中霉菌生长产生的次级代谢物，它们是由与各种植物和环境因素相关的应激反应或霉菌生长条件的改变造成的。兽医遇到的大多数霉菌毒素问题涉及饲料谷物(如：玉米、小麦、高粱、棉籽)。霉菌生长需要易于获得的碳水化合物(由谷物提供)、充足的水分、氧气和适宜的温度(通常为12～25℃；Wilson和Abramson，1992)。植物或霉菌 应激因素(如：干旱、环境温度过高、虫害、收割时的机械损伤、植物活力降低)使作物植株易受产生霉菌毒素的有毒霉菌的感染(Richard和Cole，1989；Ominski等，1994)。环境和植 虽然霉菌与霉菌毒素形成有关，但不能使用简单的肉眼观察和谷物或饲料的培养检测确定其对动物的安全性。许多产生毒素的霉菌品系可以在谷物中不产生霉菌毒素，因此孢子计数或霉菌生长程度与霉菌毒素存在之间的关联很少。相反，饲料中未检出霉菌孢子并不意味饲料中不存在霉菌毒素，因为碾磨过程由于高温、高压的作用，霉菌总数可能会减少以至霉菌生长不明显。然而，常见的霉菌毒素能耐受杀死霉菌的高温，所以霉菌毒素可能会持续存留于未受霉菌孢子污染的饲料中(Osweiler等，1985) 公认的两大类霉菌为田间霉菌和仓库霉菌(Christensen和Kaufmann，1965；Wilson和Abramson，1992)。在收割前的作物中有田间霉菌生长。镰孢霉(Fusarium spp)被认为是常见霉菌毒素的一种来源，它们生长需要较高的相对湿度(＞70%)和作物含水量(＞23%)。田间霉菌经常引起胚珠死亡，种子或核仁皱缩，胚虚弱或死亡。表示这种效应程度的术语叫&34;风化&34;。由于谷物贮藏期采取防止腐败的措施，因此不存在田间霉菌生长所需的条件，所以田间霉菌在收获后生长得很差，如果干燥的谷物受潮，在贮藏期田间霉菌也不会再生长，也不产生毒素(Christensen和Kaufmann，1965) 仓库霉菌包括曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)，它们产生的几种霉菌毒素对养猪业具有重要影响。这些霉菌甚至在湿度为14％～18％和温度为10～50℃条件下也可生长并产生霉菌毒素。黄曲霉菌(Aspergillus flavus)，通常被认为是一种仓库霉菌，经常在 霉菌毒素是偶尔发生的，具有季节性和地区性(Pier，1981)。某些地区被认为是某些特定霉菌毒素的高发区。然而，早霜、干旱和虫害等当地条件严重地影响着霉菌毒素产生的地区性。另外，谷物和饲料产品的长途运输，以及混合和运输对谷物造成的损伤，和不适宜的贮藏等 环境和管理条件可影响霉菌毒素的产生和动物接触霉菌毒素。过筛过程可使谷物受损或破碎并出现轻质谷粒，在上述谷物中霉菌毒素浓度较高。过筛物用于饲喂农场动物或在收割季节当地出售，接触高浓度霉菌毒素的机会将会增长。 如果谷物生产者同时也喂养仔猪，在收割季节可能给母猪短期饲喂劣质谷物。贮藏于稍高于最适温度的谷物，可继续呼吸并产生水分；最终，部分粮仓可达到开放贮藏的湿度，从而促进霉菌生长和产生毒素。秋、春季节，由于冷、暖温度交替有利于粮仓内水分的转移和冷凝。每当受霉菌污染的谷物破裂或粉碎后，其具有保护性的种衣破裂，这样的谷物易被霉菌感染。贮存于温暖、潮湿条件下(例如苗圃)的饲料，仅在数天时间内即可发霉并产生霉菌毒素。 霉菌中毒发生的最重要因素是易感动物接触被污染的谷物。日粮中缺少蛋白质、硒和维生素被认为是霉菌毒素中毒的易感因素，但文献报道的实例很少。由于大多数常见霉菌毒素代谢中间产物或终产物的毒性与霉菌毒素原形的毒性不同，因此减少或增加外源性化合物代谢的
金属硫蛋白的生理作用
金属硫蛋白的生理作用 张俊燕 （化学化工学院云南师范大学昆明650500） 摘要： 金属硫蛋白（MT）在1987年根据MT命名委员会规定，具有：低分子量，6000-7000道尔顿，含有60~63个氨基酸残基；高金属含量，每个蛋白质分子可结合7~12个金属离子；氨基酸特征组成，半胱氨酸的含量占23%~33%，不含芳香族氨基酸和组氨酸；独特的氨基酸序列结构，即半胱氨酸残基的分布有特征性分布的保守性很强；所有的半胱氨酸残基均为还原态出现，并以金属离子通过巯基结合，从而具有金属巯基化合物的光谱特性；具有金属硫醇簇结构。特征的蛋白质或多肽被称MT。 本文重点介绍金属硫蛋白在，清除自由基、解除重金属的毒素、抗辐射、调节机体内的微量元素等方面的生理作用。 关键词：金属硫蛋白、自由基、抗辐射、重金属、微量元素、生理作用。 引言： 一、金属硫蛋白简介 金届硫蛋白(metaHothioneins，MT)是一类富含金属与巯基的非酶蛋白，广泛存在于生物界它与“硬梆榔”的金属有着一种奇妙的亲缘关系．它能和许多金属元素结台成各种金属斑蛋白，所以又称为“重金属结台蛋白”。 二、金属硫蛋白的结构
现代生化丹1f『技术的应用．使研究者对MT 的分干结构有了较深捌的了解不管从何种生物悼中分离出来的MT，分子量6000~7000，比一般蛋白质的分子量低，为低分子量蛋白质哺乳动物的MT分子一般为61～62个氨基酸残基所组成的多肽链。其中含半胱氪酸20个，约占l／3；6～8个赖氪酸，7～10十丝氪酸在氨基酸末端是单一的乙酰甲硫氪酸在MT分子中，含有2个金属硫簇，分别螯合4个和3十二价金属离子。金属离子与半胱氪酸残基的琉基共价结台令人惊奇的是．MT 的20个半胱氨酸琉基均处于还原状态[1]。 三、金属硫蛋白的一般特征 经实验表明，金属硫蛋白具有很强抗热变性和抗蛋白酶消化作用，并且不宜失活，在0~4℃条件下可存活2-3年，在常温条件下也可保存1.5年[1]。 四、金属硫蛋白的生理作用 1、解除重金属的毒性： MT的巯基基团（-SH）能强烈螯合有毒金属汞、银、铅、镉、砷、铬、镍等[2, 3]，其中螯合铅的强度比锌大200倍，而螯合镉的强度又比铅大10倍，并可将之排出体外，从而使它们无法毒害人体，同时对体内锌等微量元素无影响。MT是目前临床是最理想的生物整合解毒剂。 2、清除体内自由基、防止机体衰老： MT是细胞中防御自由基伤害的一种重要机制，可藉由自由基的清除来达到防止DNA伤害的发生[4]；是体内清除自由基能力最强的一种，其清除自由基的能力约为SOD的1,000倍[5]，而也是谷胱甘（GSH）
丝状真菌的分类和临床意义
丝状真菌的分类和临床意义 (一)分类 曲霉(Aspergillus)种类很多，达900余种，其中大多数曲霉只发现了无性阶段，它们归属于半知菌亚门、半知菌纲、念珠菌目、念珠菌科、曲霉菌属，少数菌种具有有性阶段，它们归属于子囊菌门、子囊菌纲、散囊菌目、散囊菌科。常见的曲霉包括烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉。 毛霉主要是毛霉科，毛霉科中的根霉属(Rhizopus)、梨头霉属(Absidia)、毛霉属(Mucor)、根毛霉属(Rhizomucor)是常引起毛霉病的菌，其中以根霉属最为常见，尤其是少根根霉(Rhizopus arrizusFisher1892)和米根霉(Rhizopus oryzae Went et prinsen Geerlings1895)两种最多见。 镰刀菌属(Fusarium)又称镰孢霉属，目前属内含有20多个种，常见引起人类感染的镰刀菌主要有茄病镰刀菌(F. solani)、串珠镰刀菌(F. moniliforme)、层生镰刀菌(F. poliferatum)、尖孢镰刀菌(F．oxysporum)和半裸镰刀菌(F. semitectum)等。 (二)临床意义 曲霉是条件致病菌，到目前为止，20~30种可导致人类疾病。其中最常见的是烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉。正常人体对曲霉有极强免疫力，只有在人体免疫功能降低时才能致病，如长期使用广谱抗菌药物、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素等，尤其是AIDS等可诱发曲霉病。此外，现已有动物试验证明曲霉产生的毒素如黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作用，黄曲霉毒素可能与人类原发性肝癌发生有关。 毛霉可致毛霉病，本病是一种发病急，进展快、病死率极高的系统性条件致病性真菌感染。免疫功能低下者易感染，尤其是慢性消耗性疾病如糖尿病、自血病、长期应用化疗、皮质类固醇激素的患者最易感染。临床上常见的有眼眶及中枢神经系统的毛霉病。此外还可发生于肺部、胃肠道、皮肤等处。由于毛霉病发病急、进展快，疾病的诊断常在病死后尸检才明确。 镰刀菌生态适应性强，属于兼寄生或腐生生活。镰刀菌可引起眼内炎、角膜炎、溃疡、甲真菌病、皮肤感染、脓皮病、关节炎、肺炎部感染、心内膜炎、脑脓肿和真菌血症等。
霉菌和酵母菌介绍及检测方法
霉菌和酵母菌介绍及检测方法 一、霉菌和酵母菌介绍： 霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。 霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。 二、检验方法： 霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。 具体检测标准参见： GB4789.15-94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》三、说明： 1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。 2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。 3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必项加入抗菌素以抑制细菌。 孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。 高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。 4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。 5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平
密码子偏好性与异源蛋白表达
密码子偏性与异源蛋白表达 原文：Claes Gustafsson, et al. TRENDS in Biotechnology, 2004,22(7): 346-353. https://www.wendangku.net/doc/a58569047.html,/corp/images/MS102504CG.pdf 翻译：zhxm409511 在1977年，当Genetech的科学家和他们的科研合作伙伴首次利用细菌生产出人类蛋白（生长激素释放抑制因子）时[1]，蛋白的异源表达在整个生物技术产业中发挥着关键的角色。那时，仅知道生长激素释放抑制因子的氨基酸序列，还不知如何从人的基因组中克隆该基因，因此，Genetech小组采用数条寡核苷酸合成了14个密码子长的生长激素释放抑制因子基因。Itakura和同事们设计这些寡核苷酸时遵循了三条标准[1]。首先，优先使用MS2噬菌体偏爱的密码子——尽管当时对大肠杆菌的基因组DNA序列还知之甚少，却已刚刚完成了MS2噬菌体的测序，并认为该噬菌体的序列能够代表大肠杆菌高表达基因所使用的密码子。其次，消除寡核苷酸不必要的分子内和分子间配对，因为这可能影响基因合成。第三，避免那些先是富含GC随后是富含AT的序列，当时认为这种序列可能会导致转录终止。结果，利用这条合成的基因首次制生产出来了具有功能活性的多肽。 25年后的今天，大多数基因克隆自cDNA文库或直接利用聚合酶链反应（PCR）从相应的基因组中扩增获得。要尽量避免从头合成基因，因为这样做需要消耗大量的财力和人力[2]。尽管基于PCR的克隆被广泛使用，但很多情况下它还是不及所描述的那样快捷和容易。它经常需要一些不易得到的模板（对于具有内含子的生物，需要cDNA模板），此外还需要进行PCR条件的优化，需要对PCR产物进行测序，如果PCR引入了任何的配对错误，还经常需要通过定点突变进行修复。然而，当扩增出的基因克隆入表达载体后，真正有趣的事情就发生了：经常是没有蛋白表达或表达水平很低。人们已经进行了大量的研究，以提高克隆基因的表达水平，包括优化宿主的生长条件，建立新的宿主系，改用新的宿主，和无细胞系统[3]。尽管这些方法都取得了一些进展，但它们都是围绕一个最根本问题进行的：一种生物所采用的编码蛋白的DNA序列经常不同于另外一种生物在编码该蛋白时所采用的DNA序列。 为什么不同的生物会偏爱不同的密码子？ 遗传密码采用61组三连核苷酸（密码子）编码20种氨基酸，采用3个密码子终止翻译。因此每个氨基酸利用1个（Met和Trp）至6个（Arg，Leu，和Ser）同义密码子编码。这些密码子在核糖体中被互补的tRNAs阅读，而这些tRNAs已经事先携带了相应的氨基酸。密码子的兼并性使得同一蛋白可采用多种不同的核苷酸序列编码。对于两种不同的生物，或对于同一生物的高表达和低表达基因，有时甚至在同一个操纵子内部，对不同密码
1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
实验六 丝状真菌形态特征观察.
实验六丝状真菌形态特征观察 杨明轩生物111 1102040128 一、实验目的 1、观察并描述真菌菌落特征。 2、掌握制作水压片观察真菌的方法。 3、区分丝状真菌的军体特征及其形态特点。 二、实验原理 毛霉和根霉都属于真菌的结合菌门。菌落生长迅速，表面呈棉花样，初为白色，以后变灰至褐灰色。菌丝单细胞无横隔，有分支，多核。毛霉无假根；根霉有假根和匍匐死。无性生殖产生孢囊孢子。孢囊梗直接由菌丝体上长出，孢囊梗顶端膨大形成孢囊，孢囊成熟破裂后，露出囊轴，囊轴基部与孢囊梗连接处称为囊托。毛霉无囊托，根霉的假根上方产生孢囊梗。孢囊孢子呈球形、卵形或不规则形。有性生殖形成接合孢子，常为异宗配合。这些结构均可通过水压片进行观察。 很多青霉、曲霉及镰刀菌尚未发现它们的有性生殖阶段，称为半知菌。这三种菌的无性生殖阶段均有特征性的分生孢子梗及分生孢子形态和分生孢子着生方式。青霉菌落多为灰绿色，菌落质地绒状、絮状、绳状或束状，成熟后表面呈粉末状。青霉菌丝可直接分化为分生孢子梗，其顶端具有对称或不对称的扫帚状分枝，其上着生几轮小梗，小梗顶端着生成串的球状或卵状的绿色分生孢子。曲霉菌落呈绒毛状或絮状，表面有同心圆形的轮状带。分生孢子梗长在厚壁的足细胞上，不分枝，顶端膨大呈球形、椭圆形或棍棒状顶囊。其表面着生一层或两层小梗，下层为柱状初生小梗，上层为瓶装次生小梗，顶端着生成串的球状分生孢子。镰刀菌菌落呈绒毛状，多为白色、粉红色或紫红色。菌丝分隔有分枝。具有两种分生孢子。小型分生孢子梗分枝或不分枝，其顶端有链状或假头状着生的小型分生孢子。大型分生孢子梗不分枝，其顶端着生镰刀状大型分生孢子多隔，单生或丛生。 三、实验材料 1、菌种：毛霉（Mucor sp.）“＋”“－”型菌株、根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、 曲霉（Aspergillus sp.）、镰刀菌（Fusarium sp.） 2、浮载剂：乳酸酚溶液
重组蛋白表达系统的选择
重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究 宁
1. 前言 在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。 关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物？具有什么样的功能？分子量和聚合状态？是膜蛋白还是水溶蛋白？胞表达还是分泌表达？是否需要以及需要何种翻译后修饰？有没有配体、底物或产物类似物可以利用？对蛋白酶是否敏感？有多少分子及分子间二硫键？对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求？除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。 表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用围。 大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞流程简单简单复杂复杂 培养基简单简单复杂复杂 成本低低中高 产率高中中低 表达量高高较高较低 蛋白折叠中较好较好好 胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基 细胞增殖周期30min 90min 18H 24H 折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确 二硫键难以形成有有有 N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂 O-糖基化无有有有 磷酸化无有有有 酰化无有有有 γ-羧基化无无无有 适用原核蛋白、简单 真核蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 复杂高等真核生 物蛋白 表1：常用表达系统比较
甜瓜属人工异源四倍体Cucumis×hytivus早期世代表型与基因表达变化研究
甜瓜属人工异源四倍体Cucumis×hytivus早期世代表型与基因 表达变化研究 多倍体化是高等植物进化过程的重要阶段,是植物进化的主要动力之一。研究表明,异源多倍体在形成的早期可发生广泛的基因组构成和基因表达水平的变化,与此同时,异源多倍体形成早期也常表现出不同于其二倍体祖先、且不能用孟德尔定律解释的新表型,这些变化直接关系到物种的形成和稳定。 分子标记及比较基因组学的发展为认识种间杂交和多倍体化进程提供了重 要依据。前人研究天然异源多倍体进化过程中发生的种种变化主要是通过比较其与二倍体祖先的“候选”后代而进行的。 但现有的天然异源多倍体大多数形成于成千上万年以前,基因组经历了长期的“多倍体二倍化”过程,其二倍体祖先也不断进化或已灭绝,因此很难确定它们在早期进化中发生的表型和基因表达变化的具体过程和机制。新合成的异源多倍体及一些“年轻”的异源多倍体,由于其亲缘关系明晰,为准确、深入研究多倍体基因组进化及相关机制提供了良好的模式系统。 通过这种模式系统,可以精确比较亲本二倍体种与人工异源多倍体早期世代间的表型和基因表达变化特点,从而为丰富多倍体物种进化理论提供重要的例证。本研究基于实验室已合成的甜瓜属人工异源四倍体C.×hytivus(2n=4x=38),比 较研究了其早期世代间的形态学和细胞学变化特征、基因表达变化的特点和黄瓜por基因在异源四倍早期世代的表达和序列变化特征,探讨了异源多倍化引发以 上变化的相关机制。 具体如下：1.甜瓜属人工异源四倍体C.×hytivus早期世代表型变化研究研究了甜瓜属人工异源四倍体C.×hytivus早期四个自交世代S1-S4的主要形态学
金属硫蛋白基本知识
金属硫蛋白 1、MT命名及定义 根据与 MT结合的金属的不同，对只舍一种金属，例如 Cd或 Cu等，可分别定名为镉金属硫蛋白或铜金属碗蛋白等；还可根据结合金属的摩尔含量写成 Cd 7–MT、Zn 7 –MT等 (表示每分子结合7个分子Cd或Zn)。对于含一种以上金属， 如同时含 Cd和Zn时，可写成Cd，Zn-MT。对其分子结构上的差别，可用罗马数字和小写字母标出，例如MT-Ⅱ、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ a 等。 经典MT定义：根据金属硫蛋白命名委员会（Thecommitteeon the Nomenclature of Metallothionein）的建议，1988年，Kagi将具有以下特征的蛋白质或多肽定义为MT（Kagi & Schaffer, 1988）。 1.低分子量，一般为6,000－7,000道尔顿，含60-63个氨基酸残基； 2.高金属含量，每分子蛋白质可结合7个二价金属离子，或多至18个一价金属离子； 3.特有的氨基酸组成，无芳香族氨基酸及组氨酸； 4.富含Cys残基(约23-33%)，无二硫键；特征的氨基酸序列，Cys残基在氨基酸序列中占据相当保守的位置； 5.所有的Cys残基均以还原态存在；并通过巯基以硫酯键结合金属离子；从而具有金属巯基化合物的特征吸收光谱。 实际上，这只是对经典MT的一个定义。现在MT家族所包括的成员远远超出以上定义的范围。 ※ Cys半胱氨酸 2、MT的分类 1.1 根据 MT的结构差异，一般将其分3类 第1类：MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置与最先从马肾中分离的 MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置紧密相关的多肽。所有哺乳动物的 MT都属于这一类。其它来源的 MT只要其基本结构与哺乳动物的MT相似亦归这一类。 第2类：MT氨基酸序列结构中的半胱氨酸位置与马肾 MT关系较远，与哺乳动物 MT没有或很少有相似的进化关系。如酿酒酵母和某些高等植物的 MT属于这一类。 第 3类：非典型的 MT。是一类由非转译合成的金属硫醇盐多肽，由γ-谷氨酰半胱氨酰基单元组成。这类MT主要来源于真核微生物，常称之为类 MT。依据它们之间的差异，又可分为4种类 MT： 第一类：含大量的酸性氨基酸残基，天冬氨酸含量大于 14％，谷氨酸含量大于18％，这类 MT仅被Cu、Ag诱导。 第二类：它们由同样的肽基亚单位构成，基本结构为γ-谷氨酰肽或称(γ -EC) n G 或 (γ-Glu-Cys) n -Gly。 第三类: MT不舍芳香族氨基酸，分子量为9～9.5kD。
异源表达
异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因 另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度： 1。以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达 这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时现转也能顺利表达的情况也有的是 2。重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达 这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。。。。 一般个人认为可以一试的方法包括 (1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等 (2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是保存最原始的菌种 (3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了 异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。 另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。 但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。 还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。 首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论： 1. 宿主的选择。 表达宿主虽众多，但比较常用的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。 E.coli 原核宿主，无翻译后修饰。但周期短、费用低、表达量大，一直是最常用的宿主之一。蛋白一般很好表达，量很大，但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。
金属硫蛋白在肺癌细胞系中的表达及其临床意义
金属硫蛋白在肺癌细胞系中的表达及其临床意义【摘要】目的探讨肺鳞癌、腺癌中金属硫蛋白在肺癌细胞系中的表达。方法运用sp免疫组化方法检测检测肺癌细胞系的表达定位。结果 mt在肺癌细胞系a549、be1表达，均为胞浆表达。在hbe为胞核表达。结论 mt在非小细胞肺癌转移起促进作用。 【关键词】金属硫蛋白；肺癌；转移 doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.120 文章编号：1004-7484（2012）-08-2512-01 expression and clinical significance of metallothionein in lung cancer cell lines liu jun，zhang yun-biao，zhang ting，shen xiao-xia，zhang jun-yi，jiang gui-yang 1.liaoning province shenyang city sujiatun district hospital pathology department，liaoning shenyang 110101； 2.liaoning province shenyang hunnan new district hospital，liaoning shenyang 110068； 3.department of ophthalmology the first affiliated hospital china medical university，liaoning shenyang 110001； 4.the fourth affiliated hospital of liaoning university of traditional chinese medicine department of hemodialysis，liaoning shenyang 110101； 5.department of pathology，chifeng university school of
金属硫蛋白综述
金属硫蛋白（Metallothionein，MT) 综 述 报 告 王吉
目录 一、MT的主要生理功能…………………………………… (一)重金属的去除解毒功能………………………………… (二)自由基的清除功能……………………………………… (三)抗肿瘤功能……………………………………………… 二、金属硫蛋白提取工艺………………………………… (一)MT的诱导………………………………………………… (二)MT的提取与分离纯化…………………………………… (三)MT的检测方法…………………………………………… 三、MT的应用……………………………………………… 四、MT的研究展望…………………………………………
金属硫蛋白（Metallothionein，MT） ——综述报告 王吉 摘要：金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一种广泛存在于生物界、低分子 量、高金属含量、功能独特的蛋白质。目前，对MT的研究已涉及农业、医药、生物 化学、分子生物学、环境科学、卫生毒理学、食品科学、营养学、保健科学和方法学 等领域，其特殊的理化性质与结构及独特的生物学功能在疾病的发生、发展、诊断及 发病机制探讨中显示了重要作用。 关键词：金属硫蛋白MT，医学，环保，动物养殖 前言：金属硫蛋白(metallothionein，MT) ，化学名为金属硫组氨酸三甲基 内盐，是一类广泛存在于生物中的低分子质量(2 ～7kD)、富含半胱氨酸(20%～30%)、 不含组氨酸和芳香族氨基酸的一类金属结合蛋白质。MT能被金属、细胞因子、荷尔蒙、 细胞毒性药物、有机化学药物和应激等诱导。自1957年Margoshoes等首次报道从马 肾中分离得到Cd-MT以来，MT成为基础和应用科学的热点之一，也是我国“863 ”重 大攻关课题和“火炬”计划之一，我国在MT 的研究和应用方面已经在国际上占有重 要一席。但目前，人们对金属硫蛋白在生物学上的功能的认识远远不够，还有待进一 步研究。临床实验证明，MT具有调节生物体内微量元素浓度以及对重金属的解毒作用， 此外它对激素、细胞代谢的调节，细胞分化和增殖的控制以及参与紫外(UV)诱导反应 和清除自由基都有重要作用。对MT的研究和开发利用涉及农业、医药、保健、生物 工程、环境保护等各个领域。到目前为止，已经在瑞士、日本、美国、中国等国家相 继召开了 5 次金属硫蛋白国际会议。 一、MT的主要生理功能 (一)重金属的去除解毒功能 目前，金属硫蛋白解毒机理尚不明确，可能通过这样3 个途径： 1.与重金属螯合成无活性的复合物； 2.螯合重金属，并将其排出体外； 3.减少金属的进入量。目前普遍让人接受的一种观点是还原条件下MT通过巯基与金属离 子结合再形成Cys-M 或Cys-M-Cys 键。 (二)自由基的清除功能 正常情况下，参与代谢的氧大多数与氢结合生成水，然而有一部分氧被酶催化形成超氧阴离子，后者又可以形成氧化氢，它们都属于自由基。自由基有很多种，如氧自由基和羟自由基。一般来说，动物体组织内自由基较少，其参与体内的重要有益的反应。但当机体处于病理或应激时，体内自由基产生过多，就使机体许多重要的生物大分子发生不可逆的氧化损伤，从而导致细胞结构和功能的破坏甚至导致细胞的突变。由于MT具有特殊的化学结构，
丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展
丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展
摘要:根据一般真核生物的特点，同时，真菌也有微生物系统的优点，比如利用一个简单的发酵系统有能力分泌的蛋白质改性方案。丝状菌中的黑曲霉等真正有效分泌蛋白质，但是关于重组蛋白的分泌是一个困难的任务。作为黑曲霉因其高的分泌量,而且通常作为一种生物模型。然而，具有高的生产产可以取得相应的蛋白质表达,低得多的大量生产,也获得了外源蛋白质。要充分利用丝状真菌的潜力，了解分子遗传学，他们的生理，和糖基化代谢进行调查，并在更详细的澄清。本综述丝状真菌异源蛋白生产中的最近的事态发展，还推广了由各种基因和生物处理方法蛋白质产量提高的可能性，从而减轻相关和可靠的表达平台的丝状真菌的认可。 引言 丝状真菌能够生产大量特定的蛋白质。其丰富的遗传多样性，利用他们作为一个新的基因源，并作为表达宿主。许多重要的工业，如里氏木霉、霉真菌菌株，已被列为GRAS （一般认为是安全的），可以生长在相对廉价的载体上，既可以产生和分泌巨大的重组蛋白。如成本低，生产效率高的特点也吸引了许多研究工作，在分子遗传技术与过程改进。许多研究者已经在丝状真菌的发展总结自己的进步，为同源载体上进行异源蛋白的生产。为了提高外源蛋白的表达，已成为真菌分子生物学的一个重大的问题。酵母只占1%的产品
（如表1所示） 1.丝状真菌表达宿主 目前，丝状真菌已用于同源和外源蛋白的表达。事实上，真菌分泌到培养液中的酶有明显的优势，如果他们在细胞内积聚，在生产蛋白质可能有毒。同时，分泌也有利于净化所需的产品，因为没有必要打破细胞，并摆脱所有的细胞内蛋白质，这一过程往往是繁琐和昂贵的。此外，发酵技术也非常发达，真菌可以生长大量廉价的目的蛋白。从此，许多重要的工业真菌蛋白质产生了各种表达，主要优势真菌表达系统列于表3。产量最高的是获得性异种真菌酶（如表4所示），生产真菌蛋白与此相反，丝状真菌的非真菌蛋白产量是非常低的，不具有工业生产力。
低温脂肪酶基因的异源表达
低温脂肪酶基因的异源表达 引言 低温脂肪酶是一种胞外酶，酶的产生要经过异源表达，修饰折叠，最终分泌至细胞外。决定脂肪酶表达的因素是多方面的，如宿主、外源基因、外界环境以及它们之间的相互作用等。低温脂肪酶的异源表达大多选择大肠杆菌做为宿主。 现已发现分子伴侣能识别并调节细胞内多肽的折叠。如果宿主体细胞分子伴侣与外源基因表达所需要的分子伴侣不匹配，外源基因便不能正确表达。革兰氏阳性菌所产脂肪酶首先以“前酶原”的形式表达，酶的前体区域(pre．region)为信号肽，运输酶原至细胞外，酶原在胞外经蛋白酶水解后断裂产生成熟酶。Rosenau将革兰氏阴性菌脂肪酶的分泌机制概括为三种类型。 (1)含有ATP结合盒(ABC)的输出体(ATP-binding cassette exporter)。这种类型适用于N端缺少代表性的信号序列，但c端包含靶信号序列的脂肪酶的分泌。ABC输出体包括三种蛋白质，由内而外依次是ATP酶，弓型的细胞膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)。三种蛋白质组合体横跨内外细胞膜，从而在周质中形成通道直接将酶分泌到胞外。 (2)分泌子(secreton)介导的分泌。这种类型主要由xcp基因编码的蛋白质组成，其分布于细胞内外膜，并在外膜形成孔状通道。 (3)自输送体(autotransporter)介导的分泌。通过该途径分泌的脂肪酶尽管分泌到胞外，但仍然与细胞表面密切相连或紧紧固着在细胞表面。脂肪酶包含两个独特的结构域，N端具有催化活性并且暴露在细胞外，c端结构与所谓的自动输送蛋白(autotransporterprotein)类似，通过形成B．折叠结构的分泌通道协助将脂肪酶N端转运出外膜。 Quyen在对脂肪酶异源表达的研究时发现，在分子伴侣的作用下，大肠杆菌中表达的P．cepacia 的脂肪酶可以分泌。但也有学者研究发现，能表达脂肪酶并不意味着能完全分泌至胞外。有一部分菌表达的重组蛋白存在于周质中，只有少部分分泌至胞外。Feller研究发现，莫拉氏菌TA144的脂肪酶在大肠杆菌中表达后，培养物的上清液几乎没有酶活性，而菌悬液有一定的酶活力，说明脂肪酶没有分泌到胞外，而是存在与外周质空间或镶嵌于细胞膜上。迄今为止，已经有多例低温脂肪酶能用基因工程技术成功表达的报告。Choo等将分离自阿拉斯加土壤的适冷的假单胞杆菌的低温脂肪酶基因在大肠杆菌中表达。其最适pH为8．0左右，在45℃时酶活力最高。以对硝基苯月桂酸酯为底物计算酶的活化能为7．7kcal／mol，低于其它南极适冷菌的12~~~~~~~17 kcal／mol，和中温铜绿假单胞菌的25 kcal／mol。Feller_9 报道了一株南极适冷型莫拉氏菌的脂肪酶基因在中温型大肠杆菌中的克隆与表达。结果发现，包含有耐冷型脂肪酶编码基因的克隆只有在生长温度从对应嗜温菌的最适生长温度37℃降至25~C或17℃以后，才表达有酯解活力脂肪酶，从而防止基因产物的热变性，重组酶的最适温度比野生型低了10~C，而且异源表达的脂肪酶比野生型具更明显的热不稳定性。Rashid[1 将深海分离出的假单胞杆菌KB700A脂肪酶基因在大肠杆菌中成功表达。其基因序列与中温菌P． P．fluorescens 的脂肪酶基因的序列同源性可达90％，该脂肪酶只有在Ca 作用下才表现酶活力，另外添加Mn2+ 、Sr2+ 等离子以及去垢剂皆可提高酶活。
实验三 重组蛋白的表达及Western boltting鉴定
实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定 一、实验内容 1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。 2．重组蛋白的Western boltting鉴定。 二、实验要求 通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。 三、实验方法 1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析 （1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。 （3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。 （4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。 （5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。 （6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。 2．Western blot分析 （1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。 （2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。 a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。 b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。 c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、 凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。 d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。 （3）杂交 a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。 b.TBST漂洗3 × 10 min c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中， 室温反应1 hr。 d.TBST漂洗3 × 10 min e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG
丝状真菌地鉴定主要根据形态特征
丝状真菌地鉴定主要根据形态特征。形态特征包括群体形态和个体形态。 1、群体形态 群体形态即菌落的形态。观察菌落形态时多采用固定的培养基，将固体培养基制成平板，以点植法接种，即用接种针尖沾取少量孢子点植在平板上适当的位置，例如中心，或三角形的三点。然后于25－28℃培养一定时间（如2、4、7、10天）进行观察，观察时可用肉眼或借助放大镜、低倍镜、解剖镜等。 观察的要点一般包括下列几项： 1）大小：它反映生长或发育速度，通常测量菌落的直径。 2）颜色：包括菌落表面子实体、气生菌丝、菌核的颜色和基内的颜色，还应注意培养基颜色的变化。 3）菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。 4）菌落的质地：即菌落外观呈毡状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状，有无成束状或绳状的气菌丝。 5）菌落的高度：菌落扁平或凸起，中心部分凸起或凹陷。气生菌丝的高度。 6）菌落的边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。 7）渗出物：指菌落表面有无液滴、液滴的颜色和数量。 2、个体形态 个体形态指菌丝的特征，子实体的形态(如孢子囊。子囊壳、子囊、担子果等的形态)，孢子的形态（如孢囊孢子、分生孢子、芽孢子、节孢子、厚垣孢子、卵孢子、接合孢子、担孢子等）。由于丝状真菌的个体大都较小，必须制成载片标本在显微镜下观察。 丝状真菌的制片比较简单，通常将乳酸苯酚（Lactophenol）液一滴，滴于
载片上，再用解剖针挑取欲观察的培养物置此液滴内，并且用针尖将其分散开勿使成团，盖好盖片即得载片标本。这种载片可保存数月，如盖片四周涂封漆则可保存数年。 1两种分生孢子, 大型分生孢子呈镰刀形，小型分生孢子呈椭圆形 2孢子长方形，接连成链 菌丝断裂为成串的节孢子 3灰绿色，绒毛状，表面有绿色的孢子孢子圆球形，呈绿色 孢子大小(μm)：3.03～4.26 分生孢子梗顶端膨大，表面的产孢瓶体上成链的分生孢子
丝状真菌简介
丝状真菌简介 丝状真菌- 概述 霉菌并不是一个生物分类学的名称，而是丝状真菌的通称，意即“发霉的真菌”。 丝状真菌的菌丝呈长管、分枝状，宽度2～10微米，可不断自前端生长并分枝，无横隔壁，具多个细胞核，并往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是丝状真菌。丝状真菌常用孢子的颜色来称呼，如黑霉菌、红霉菌或青霉菌。 丝状真菌- 菌落特征 A、形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的形状。 B、菌落和培养基间的连接紧密，不易挑取，菌落正面与反面的颜色、构造，以及边缘与中心的颜色、构造常不一致。 C、菌丝有营养菌丝和气生菌丝的分化，而气生菌丝没有毛细管水，故它们的菌落必然与细菌或酵母菌的不同，较接近放线菌。
丝状真菌- 菌丝 丝状真菌 构成丝状真菌营养体的基本单位是菌丝。菌丝是一种管状的细丝，把它放在显微镜下观察，很像一根透明胶管，它的直径一般为2~10微米，比细菌和放线菌的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。 类型 根据菌丝中是否存在隔膜，可把菌丝分成两种类型： 无隔膜菌丝：菌丝中无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含有多个细胞核。这是低等真菌（即鞭毛菌亚门和接合菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝类型。 有隔膜菌丝：菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝体由很多个细胞组成，每个细胞内有1个或多个细胞核。在隔膜上有1至多个小孔，使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互沟通。这是高等真菌（即子囊菌亚门和半知菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝类型。 菌丝变态 丝状真菌 为适应不同的环境条件和更有效地摄取营养满足生长发育