曲古抑菌素_Trichostatin_A对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的
畜牧兽医学报 2008,39(11):149321498
A ct a V eteri nari a et Zootechnica S i nica
曲古抑菌素(T richostatin)A对猪卵母细胞体外
成熟及孤雌胚胎发育能力的影响
刘 晓1,2,潘登科13,陈扣扣1,3,冯 冲1,3,张卫红1,3,
郑茂恩1,4,龙 川1,冯书堂1,杨博辉23
(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室,
北京100193;21中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,兰州730050;
31甘肃农业大学,兰州730070;41云南农业大学,昆明650201)
摘 要:曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)是一种组蛋白去乙酰化抑制剂,用TSA处理鼠核移植胚胎可显著提高胚胎的囊胚率。检验TSA对猪卵母细胞体外成熟以及孤雌胚胎发育的影响。在猪卵母细胞体外成熟液及胚胎培养液中添加TSA,比较不同浓度TSA对卵母细胞成熟的影响,不同浓度TSA对孤雌胚胎发育能力的影响以及TSA处理不同时间对孤雌胚胎发育能力的影响。结果发现:(1)5nmol/L TSA处理对卵母细胞体外核成熟无显著影响,却显著提高了卵母细胞孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率(P<0105);(2)50nmol/L TSA处理显著提高了孤雌胚胎的卵裂率及囊胚率(P<0105);(3)50nmol/L TSA处理24h能显著提高胚胎的卵裂率及囊胚率(P<0105, 8211%±216%和3714%±311%)。结果表明TSA对猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎发育具有显著的促进作用。5nmol/L的添加量对卵母细胞的体外胞质成熟具有促进作用;胚胎培养基中添加50nmol/L TSA处理24h 能提高孤雌胚胎的发育能力。
关键词:猪;TSA;卵母细胞;体外成熟;孤雌胚胎
中图分类号:S82813 文献标识码:A 文章编号:036626964(2008)1121493206
E ffect of T richostatin A on in vit ro Maturation of Porcine Oocyte and
Development of Parthenogenetic Embryo
L IU Xiao1,2,PAN Deng2ke13,C H EN K ou2kou1,3,FEN G Chong1,3,ZHAN G Wei2hong1,3,
ZH EN G Mao2en1,4,LON G Chuan1,FEN G Shu2tang1,YAN G Bo2hui23
(11T he Key L aboratory of Farm A ni m al Genetic Resources an d Utili z ation of M i nist ry
of A g ricult ure,I nstit ute of A nim al S cience,Chi nese A ca dem y of A g ricult ural S ciences,
B ei j i ng100193,Chi na;21I nstit ute of A ni m al S cience and V eteri nary Pharm aceutics,Chi nese
A cadem y of A g ricult ural S ciences,L anz hou730050,Chi na;31Gansu A g ricult ural U ni versit y,
L anz hou730070,Chi na;41Yunnan A g ricult ural U ni versit y,Kunmi ng650201,Chi na)
Abstract:Trichostatin A(TSA)is an inhibitor of histo ne deacetylase1It is reported t hat treat2 ment of mouse somatic cell nuclear2t ransferred oocytes wit h TSA significantly increased t he blas2 tocyst rate1The present st udy was designed to examine t he effect of TSA on t he mat uratio n of porcine oocytes and develop ment of part henogenetic embryo s i n vit ro1We evaluated t he concen2 t ration of TSA to oocyte mat uration,t he concent ration of TSA to part henogenetic embryo,treat2 ment duration of TSA to part henogenetic embryo i n vit ro1The mat uration oocytes to t he meta2
收稿日期:2007211227
基金项目:国家“863”项目(2006AA02Z113);中国农业科学院科技经费项目资助
作者简介:刘 晓(19812),女,硕士研究生,主要从事猪胚胎生物技术研究,E2mail:hebeilx2005@1631com
3通讯作者:潘登科,助理研究员,博士,主要从事胚胎生物技术研究,E2mail:pandengke@yahoo1com1cn;杨博辉,副研究员,主要从事动物遗传育种与繁殖研究,E2mail:Yangbh2004@1631com
畜 牧 兽 医 学 报39卷
p hase II(M II)stage cult ured wit h5nmol/L TSA was not significantly different from t he TSA2
free t reat ment,meanwhile5nmol/L TSA t reat ment supported a higher cleavage and blastocyst develop ment rate(P<0105);The part henogenetic embryo expo sured in50nmol/L TSA suppor2
ted a higher cleavage and blastocyst develop ment rate(P<0105)1The part henogenetic embryo exposured in50nmol/L TSA for24h supported a higher cleavage and blastocyst develop ment
rate t han t he ot hers(P<0105,8211±216%and3714311%)1The data demonst rated t hat treat2 ment of porcine oocytes and part henogenetic embryo s wit h TSA significantly imp roved t he i n
vit ro blastocyst p roduction15nmol/L TSA t reat ment enhanced t he oocytes mat uration i n vit ro,
and50nmol/L TSA2t reat ment for24h following oocyte activation resulted in more efficient de2 velop ment of part henogenetic embryo.
K ey w ords:porcine;t richostatin A;oocyte;mat uration i n vit ro;part henogenetic embryo
曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)是一种组蛋白去乙酰化转移酶(Histone deacetylase, HDACs)抑制剂。DNA与组蛋白是染色质的主要成分。染色质结构与基因活性密切相关,通过组蛋白乙酰化和去乙酰化来修饰染色质的结构,在DNA复制、基因转录及细胞周期的调控等方面有重要作用。组蛋白乙酰化松弛染色质,与转录活化正相关;脱乙酰化则和转录抑制相关。利用TSA处理供体细胞改变组蛋白表观遗传修饰提高克隆胚胎的发育能力早已有报道,Enriqht等[1]用TSA处理供体细胞得到了较高的囊胚率。
卵母细胞成熟及胚胎发育包含了染色体的浓缩与去浓缩、同源染色体分离、基因组重新程序化等复杂过程[2]。与DNA非特异性结合的组蛋白修饰在这一过程中发挥着重要的作用。TSA作为一种HDACs抑制剂可能会对卵母细胞成熟和胚胎发育产生一定影响。K ishiqami等[3]发现5～50nmol/L TSA处理激活小鼠克隆胚胎10h,显著提高了囊胚发育率。牛、兔、猪上也均有相关报道,Akagi等[4]用5～50nmol/L TSA处理牛的克隆胚15h,未发现囊胚发育率提高,但50nmol/L处理组的囊胚总细胞数要显著高于其他组;Xu等[5]发现5nmol/L TSA处理兔的克隆胚胎,未能提高胚胎的囊胚发育率,却显著提高了囊胚的总细胞数;Zhang等[6]用50nmol/L TSA处理猪激活后的克隆胚胎19～24 h,显著提高了囊胚发育率。这些研究结果不一致,原因可能在于不同物种组蛋白的乙酰化过程存在不同的模式进程,或源于剂量与作用时间的影响。
目前,关于TSA处理卵母细胞的报道很少,仅见Akiyama等[7]用TSA处理小鼠卵母细胞获得了较高的囊胚发育率。因此,研究比较了TSA的不同浓度和不同处理时间对猪卵母细胞成熟以及孤雌胚胎发育的影响,为提高猪体细胞克隆胚胎的发育效率提供参考。
1 材料与方法
111 试验材料
所有化学试剂均购自Sigma公司;卵母细胞体外成熟(I n vit ro mat uration,IVM)及胚胎培养耗材分别为NUNC,Greiner(German)公司产品。
112 主要溶液
TSA用DMSO作为溶剂配制溶液,浓度为25 mmol/L;抽卵液PVA2DPBS为添加了011%(质量体积比)聚乙烯醇(PVA)无钙的PBS缓冲液;卵母细胞体外成熟(IVM)液为无BSA的NCSU23 (Nort h Carolina State U niversity23)添加10%(体积比)猪卵泡液(Porcine follicular fluid,p FF),10 ng/mL表皮生长因子(Epidermal growt h factor, EGF),10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hC G)和10IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG);融合/激活液由0128mol/L甘露醇,011mmol/L氯化钙, 011mmol/L氯化镁,015mmol/L H EPES以及0101%PVA组成;胚胎培养基为PZM3(含013% BSA);011%透明质酸酶。
113 试验方法
11311 猪卵母细胞体外成熟(IVM) 从屠宰场取母猪卵巢,放入30～35℃含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中,5h内运回实验室。用配有18G针头的20mL注射器抽吸卵巢表面直径2～6mm的卵泡,经PVA2DPBS洗涤3遍后挑选卵丘包裹3层以上,致密且胞质均匀的卵丘细胞2卵母细胞复合体(Cumulusoocyte complexes,COCs),再用IVM培
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11期刘 晓等:曲古抑菌素(Trichostatin )A 对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响
养液洗涤3遍。将洗涤好的COCs 转入IVM 培养液中培养。COCs 在39℃,5%CO 2,100%湿度的CO 2培养箱中IVM 42～44h 后,用011%透明质酸酶脱去包裹在其周围的卵丘细胞,选择卵周隙明显,细胞膜完整,且排出第一极体的卵母细胞备用。11312 卵母细胞孤雌激活 取上述脱去卵丘的M Ⅱ卵母细胞,用激活液洗涤3遍。再将卵母细胞转移到已经铺满激活液,电极宽度为015mm 的融合槽(B TX ,U SA )中,用CF 2150B (BL S )细胞融合仪施加2个112kV/cm ,100μs 的直流脉冲(DC )诱导激活。洗涤后将卵母细胞转移到PZM3+10μg/mL 细胞松驰素B (Cytochalasin B ,CB )的液滴内作用4h ,然后转移到培养液PZM3中,48和168h 观察并统计胚胎发育的卵裂率(图1)和囊胚率(图2)
。
11313 囊胚细胞染色计数 取出第7天的囊胚,在
含317%多聚甲醛的DPBS 中洗涤3遍后固定5
min ,将固定后的囊胚转移到含10μg/mL Ho 2echst33342(Bisbenzimide )的DPBS 中,避光室温孵育6～7min ,染色结束后,将囊胚转移到载玻片上,
尽量少带液体,再加2μL 甘油于液滴上。用凡士林/石蜡在其四角点四个柱,盖上盖玻片,体式显微镜下轻轻压盖玻片,用指甲油封片。然后在Olym 2p us 荧光显微镜下紫外光激发,观察细胞计数(图3)
。
图3 孤雌激活后168h 囊胚总细胞计数 400×Fig 13 B lastocyst total cell after activation 168h 400×
114 试验设计
11411 不同浓度TSA 对猪卵母细胞成熟的影响
将COCs 培养在添加不同剂量TSA (0、5、50nmol/L )的NCSU23成熟培养液中,培养44h 后脱去周围的卵丘细胞,挑选排出第一极体的M Ⅱ卵母细胞,统计核成熟率。不同试验组得到的卵母细胞进行孤雌激活,48和168h 观察并统计各组的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数。11412 不同浓度TSA 对于孤雌胚胎发育能力的影响 将COCs 培养在NCSU23成熟培养液中,培养44h 后脱去周围的卵丘细胞,挑选排出第一极体的M Ⅱ卵母细胞,孤雌激活后,培养在添加不同剂量(0、25、50、75、100nmol/L )TSA 的PZM3培养液中培养24h ,再转入PZM3中,48和168h 观察并统计各种处理的孤雌胚发育率。
11413 TSA 不同作用时间对于孤雌胚胎发育能力的影响 将COCs 培养在NCSU23成熟培养液中,培养44h 后脱去周围的卵丘细胞,挑选排出第一极体的M Ⅱ卵母细胞,孤雌激活后,在添加了50nmol/L TSA 的PZM3中分别培养4、24、36h ,再
转入PZM3中继续培养,48和168h 观察并统计各种处理的孤雌胚发育率。115 统计分析 数据以统计软件SAS 的G L M 过程进行分析,Duncan ’s 检验方法判定处理间的差异显著性,当P <0105时差异显著。
5
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2 结 果
211 不同浓度TSA对猪卵母细胞成熟的影响
体外成熟液中加入TSA培养44h后,对卵母细胞体外成熟的影响见表1。与对照组相比,卵母细胞核成熟随添加浓度的增加而下降,50nmol/L TSA处理显著降低了核成熟率,退化率上升,孤雌激活后的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数显著下降(P<0105)。添加5nmol/L TSA对卵母细胞核成熟无显著影响,孤雌胚的卵裂率和囊胚率显著提高(P<0105,8317%±310%vs17415%±211%; 4817%±217%vs13419%±314%)。
表1 TSA对卵母细胞体外成熟的影响
T able1 E ffect of trichostatin A on m aturation of porcine oocyte in vit ro
TSA浓度/(nmol/L) Concentration of TSA
培养卵数
No.of oocytes
cultured
MⅡ期卵母细胞数
(%±SE)
No.of MⅡ
oocytes
卵裂数(%±SE)
No.of embryos
cleaved
囊胚数(%±SE)
No.of
blastocyst
囊胚总细胞数
Total cell number
of blastocyst
0686403(60.6±2.5a)325(74.5±2.1b)133(34.9±3.4b)62.4a 5704400(58.1±3.7a)358(83.7±3.0a)205(48.7±2.7a)59.0a 50670165(26.1±3.0b)107(64.4±1.2c)30(16.5±2.4c)32.5c 同一栏内上标不同字母表示差异显著(P<0105),下表同
Values with different superscripts letters within a column are significantly different(P<0105),the same as below
212 不同浓度TSA对孤雌胚胎发育能力的影响
卵母细胞孤雌激活后,用不同浓度(0、25、50、75、100nmol/L)的TSA作用24h,孤雌胚的卵裂率和囊胚率见表2。与对照组(0nmol/L)相比,25、50nmol/L TSA两处理组的卵裂率均有增加;浓度增加到75nmol/L以上时有下降趋势。添加50 nmol/L TSA时,囊胚发育率显著高于其它组(P< 0105)。
表2 不同浓度TSA对孤雌胚胎发育能力的影响
T able2 E ffect of concentration of trichostatin A on the development of porcine parthenogenetic embryo
TSA浓度/(nmol/L) Concentration of TSA
培养胚胎数
No.of embryos cultured
卵裂数(%±SE)
No.of embryos cleaved
囊胚数(%±SE)
No.of blastocyst
0477267(59.9±8.9bc)133(28.9±9.6bc)
25481319(67.8±6.7ab)168(33±7.5b)
50472328(68.6±5.9a)230(44.9±6.7a)
75434260(61.6±6.2bc)100(21.93±5.0c)
100479271(59.0±2.8c)90(20.14±3.3c) 213 TSA作用不同时间对于孤雌胚胎发育能力的
影响
卵母细胞孤雌激活后,50nmol/L TSA处理孤雌胚胎的时间对其发育的影响见表3。与对照组相比,TSA处理24h能显著提高胚胎的卵裂率以及囊胚率(P<0105,8211%±216%vs17510%±411%;3714%±311%vs12910%±210%),但是随着作用时间的进一步延长,胚胎发育率下降。3 讨 论
研究在猪卵母细胞的体外成熟及胚胎培养液中分别添加组蛋白去乙酰化抑制剂TSA,发现TSA 处理对猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎发育的影响具有时间和剂量的依赖性。5nmol/L的添加量对卵母细胞的体外胞质成熟具有促进作用;胚胎培养基中添加50nmol/L TSA、作用24h能提高孤
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11期刘 晓等:曲古抑菌素(Trichostatin)A对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响
表3 TSA作用不同时间对胚胎发育能力的影响
T able3 E ffect of duration of trichostatin A treatment on the development of porcine parthenogenetic embryo
TSA处理时间/h Duration of TSA treatment
培养胚胎数
No.of embryos cultured
卵裂数(%±SE)
No.of embryos cleaved
囊胚数(%±SE)
No.of blastocyst
0245175(75.0±4.1b)69(29.0±2.0b) 4250199(76.6±2.3b)88(32.3±2.8b) 24280235(82.1±2.6a)107(37.4±3.1a) 36200140(71.3±4.8b)54(28.3±2.9b)
雌胚胎的发育能力。
目前,关于卵母细胞成熟阶段添加TSA的研究报道很少。Tang等[8]报道卵母细胞成熟过程中,组蛋白乙酰化影响染色体的构象,有利于减数分裂的有序进行。研究发现TSA处理影响了卵母细胞的核成熟,提高了孤雌胚胎的发育能力,然而降低了囊胚的总细胞数,这与Akiyama等[7]的结果相似: TSA处理小鼠卵母细胞获得了较高的囊胚发育,但是产生的后代导致了高比率的异倍体。原因可能在于卵母细胞成熟过程中,组蛋白的乙酰化水平及其程度并不是持续不变的[9]。Endo等[10]检测了组蛋白赖氨酸H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12在猪卵母细胞体外成熟过程中的乙酰化变化,发现GV期所有的赖氨酸都是高度乙酰化的,一直持续到第一次细胞分裂的前中期,在中期的时候H3K9、H4K5发生完全去乙酰化。因此,卵母细胞成熟过程中TSA的持续作用影响了卵母细胞的核成熟。TSA的持续作用产生的一些负面影响或许可以通过调整作用时间来削弱。
最近Li等[11]发现TSA处理小鼠克隆胚胎的囊胚与体内囊胚在组蛋白去乙酰化酶(Hdac1,2, 3)、组蛋白乙酰转移酶(CB P、PCA)及DNA甲基化酶Dnmt3b有着相似的基因表达模式。TSA处理胚胎明显上调了SOX2及cMyc在囊胚阶段的转录,以及基因的甲基化降低可能是TSA提高胚胎发育能力的原因。
组蛋白乙酰化作为一种染色质的表观修饰,可以通过改变染色质结构而使DNA易于接近转录因子,进而影响基因的转录。研究中TSA处理猪孤雌胚胎,诱发的组蛋白过乙酰化使基因处于转录活性状态,乙酰化的染色质更易受到调节蛋白的影响,从而使得卵裂率上升,但如果作用的时间持续过长,则会产生不利的影响。试验中TSA处理36h,导致了发育率的下降,可能与胚胎基因组活化前的转录抑制状态有关,晚期转录抑制状态的形成对于胚胎发育是必须的,这是因为在合子型基因激活发生时,染色质发生广泛的重构,所有基因的启动子都易于结合转录因子,此时只要某个基因的转录因子存在,它就能转录。而转录抑制状态的功能是抑制那些随机基因的转录,形成一种有利于胚胎发育的基因表达模式。组蛋白乙酰化水平的异常会破坏正常的基因表达模式,使基因组激活时不该表达的基因表达,影响了正常发育[12]。研究结果也表明,TSA 的作用时间应截至在胚胎发育的22细胞之前,否则将影响其后的正常发育。
50nmol/L的TSA处理在卵母细胞成熟期以及胚胎发育期产生截然不同的结果:促进了孤雌胚胎的发育,却降低了卵子的核成熟。可能是两个阶段对于乙酰化的要求程度不同,或者卵母细胞处理44h的作用时间过长,尚需进一步的深入研究。总之,利用TSA处理卵母细胞和孤雌胚胎,提高了猪胚胎的发育能力,为TSA处理克隆胚提高胚胎的发育率提供了佐证[13]。
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动物疫情快递
老挝发生炭疽
2008年10月20日,老挝向OIE通报了炭疽疫情。疫情始于2008年6月13日,于7月5日得到确诊。病原是炭疽杆菌,此次疫情是临床病例,根据临床症状和实验室检测作出诊断,国家动物卫生中心(国家实验室)的细菌学检查结果为阳性。疫区位于占巴塞省Bachieng的Kaenglay村,易感动物是散养的牛、羊,有易感牛71头,病例5例,死亡2例,未予销毁;有易感羊11头,病例2例,死亡2例,未予销毁。感染来源尚不清楚。老挝采取的控制措施有检疫、国内限制移运、染疫场区消毒,未禁止免疫,对动物进行了抗生素治疗。老挝上一次发生炭疽是2002年。
荷兰发生蓝舌病
2008年10月27日,荷兰向OIE通报了蓝舌病疫情。疫情始于2008年9月10日,于10月24日得到确诊。病原是6型蓝舌病病毒,此次疫情是临床病例,根据临床症状和实验室检测作出诊断,英国Pirbright 实验室(OIE参考实验室)的PCR结果为阳性。疫区分布于上艾瑟尔省Oldenzaal村、Heeten村、L utten2 berg村以及海尔德兰省Barchem村的养殖场,易感动物是牛,Oldenzaal村有易感牛52头,病例1例;He2 eten村有易感牛150头,病例1例;L uttenberg村有易感牛3头,病例1例;Barchem村有易感牛143头,病例1例,均未出现死亡,均未销毁。感染来源尚不清楚。荷兰采取的控制措施:控制节肢动物、检疫、国内限制移运、筛查、区域化、浸洗/喷雾等,未禁止免疫,对动物进行了治疗。
(摘译自O IE网站) 8941
甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外成熟的影响
甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外成熟的影响【摘要】目的：观察甲氧滴滴涕(MXC)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响. 方法：实验组小鼠未成熟卵用7.25, 14.5，29 mg/L MXC 不同浓度培养液培养；对照组小鼠未成熟卵直接用合成人输卵管培养液培养，两组培养时间均为24 h. 观察各组生发卵泡破裂(GVBD)和第一极体(PB1) 的形成, 出现PB1的卵母细胞视为核成熟. 结果：培养24 h时，卵母细胞GVBD发生率7.25 mg/L MXC组为80.4%，14.5 mg/L MXC组为78.8%，29 mg/L MXC组为78.4%，与对照组的86%相比较并没有明显改变. 培养过程中不同浓度MXC试验组GVBD发生较同期对照组相比较也没有明显延迟. 但在培养液培养24 h时PB1的排出率7.25 mg/L MXC组为52.8%，14.5 mg/L MXC组为44.4%，29 mg/L MXC组为22%，明显低于对照组的71.2%，差异具有统计学意义(P<0.05). 结论： MXC对体外培养的小鼠卵母细胞GVBD发生没有影响，但能抑制其卵母细胞的核成熟. 【关键词】甲氧氯；卵母细胞；体外研究; 细胞培养技术 【Abstract】AIM: To investigate the effect of Methoxychlor (MXC) on in vitro maturation of mouse oocytes. METHODS： The oocytes in experimental groups were cultured in hunan tubal fluid(HTF) medium supplemented with 7.25，14.5，29 mg/L MXC and the oocytes in the unexposed control group were
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用 杨彩荣 魏延昌张 岩郑可佳 李 宁严云勤* (东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室，哈尔滨150030) 摘要哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ，mTOR)是一种Ser/Thr 激酶，属于PIKK 超家族，对调节细 胞周期、蛋白质合成等具有重要作用，是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器，但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以小鼠卵母细胞为研究对象，采用免疫荧光为主要研究方法，对mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达进行研究，并通过mTOR 的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin ，RAPA )对卵母细胞进行处理，对mTOR 在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究．结果显示：小鼠卵母细胞成熟过程中，生发泡(germinal vesicle ，GV )期mTOR 主要集中在核膜处表达，生发泡破裂(germinal vesicle breakdown ，GVBD )后mTOR 伴随染色体分布，第二次减数分裂中期(second metaphase ，M Ⅱ期)mTOR 伴随纺锤体分布；雷帕霉素处理后，小鼠卵母细胞的成熟受到抑制，且这种抑制作用具有浓度依赖性，同时其mTOR 的表达部位和形态也发生变化．研究表明，在小鼠卵母细胞成熟过程中，mTOR 在各个时期的表达及分布具有阶段特异性，并对小鼠卵母细胞GVBD 的发生和第一极体的排放都具有重要作用． 关键词雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，小鼠卵母细胞，雷帕霉素，免疫荧光学科分类号 Q2 DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00446 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,36(10):1334~1339 https://www.wendangku.net/doc/a58866945.html, 研究报告 Research Papers *通讯联系人. Tel:0451-********,E-mail:yanyunqin@https://www.wendangku.net/doc/a58866945.html, 收稿日期：2009-07-23，接受日期：2009-09-04 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)结构与功能上高度保守，是一种存在于哺乳动物细胞中的Ser/Thr 激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase ，PIKK)家族成员．mTOR 信号通路可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号[1～3]，通过其下游的靶蛋白核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6kinase 1，S6K1)和蛋白质翻译起始因子eIF4E 结合蛋白1(eIF4E binding protein 1,4EBP1)调控蛋白质的翻译，加快细胞G1期/S 期的转换，促进细胞生长和增殖，抑制细胞凋亡[4～6]．mTOR 信号通路紊乱与肿瘤的形成及细胞的恶性转化密切相关[7]． 雷帕霉素(rapamycin ，RAPA ，RPM)是一种大环内酯类抗生素和免疫抑制剂，它进入体内后与胞浆受体FKBP12结合形成复合物，此复合物能够结合在mTOR 蛋白羧基端的FRB 结构域内，形成三元复合物，使得mTOR 的激酶催化域失去接近并磷酸化下游靶蛋白的能力，从而抑制mTOR 的生物学功能[8～10]． mTOR 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的研究较少，且大多集中在海星、海胆等动物中[11,12]， 而在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以往的研究表明，mTOR 与一些蛋白质的合成有关[12]，而特定蛋白质的合成对卵母细胞成熟具有重要的作用，因此我们推测，mTOR 可能在哺乳动物卵母细胞成熟过程中有重要作用．所以本研究以小鼠卵母细胞为研究对象，观察了mTOR 在卵母细胞成熟各个阶段的表达及分布情况，同时通过雷帕霉素的处理观察mTOR 对卵母细胞成熟的重要作用，为进一步探索mTOR 在小鼠卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据． 1材料与方法 1．1 实验材料 本实验选用昆明白品系6～8周龄性成熟雌鼠，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心． 1．2 主要试剂 α-MEM 购自Gibco 公司；雷帕霉素购自江苏碧云天生物技术研究所；孕马血清(pregnant mare
猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究
猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究* 朱秀萍1，蒋伟娟2，艾晓杰1，徐动1，朱淑文1 1上海交通大学农业与生物学院，上海 (200240) 2上海市兽医卫生监督所，上海 (200335) E-mail：xpzhu@https://www.wendangku.net/doc/a58866945.html, 摘要：本研究对不同体外成熟培养时间的猪卵母细胞进行盲吸法去核及利用脱羧秋水仙碱(DC)和放线菌酮(CHX)的化学诱导法去核效率进行了比较研究。结果显示，用盲吸法去核，体外成熟培养（IVM）39-41h组卵母细胞去核率与IVM 36-38h组差异显著（P<0.05），与42-44h 组差异不明显（P>0.05），但三组显著高于IVM45-48h组（P<0.05）。化学诱导法去核结果表明，IVM 42-44h组去核率最高，但与IVM 39-41h组差异不显著（P>0.05），其他各组间均差异显著（P<0.05）。在相同的体外成熟培养时间内，盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率要高。本实验证明：猪卵母细胞IVM在39-44h内去核率较高，且盲吸法去核效率高于化学诱导去核。 关键词：猪卵母细胞，盲吸法去核，化学诱导去核，去核率 中图分类号：Q 968.1 1 前言 近年来，体细胞核移植在多种哺乳动物获得成功，相继产生克隆羊、牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡子和大鼠，为生命科学、医学制药等诸多领域提供了一个崭新的研究手段。卵母细胞核物质的去除是克隆技术成败的关键环节之一，卵母细胞的体外成熟是决定克隆胚胎能否最终发育成正常个体的关键。去核效率的高低与卵母细胞所处的成熟时期及采用的去核方法有密切关系。因此掌握卵母细胞体外成熟时间，快速而准确的去核，对提高去核成功率有重要意义。 目前动物克隆中普遍使用是机械去核法（盲吸法），该方法对细胞的机械损伤较大、耗时、技术要求高。如何既能完全去掉卵母细胞的核，又不致对细胞造成更大的损伤是研究者们一直在探索的问题。“化学诱导去核法”去核首次建立于小鼠卵母细胞，用脱羰秋水仙碱（DC）处理激活的卵母细胞，使染色体和极体牢固结合，然后用诱导第二极体排出的放线菌酮(CHX)处理卵母细胞，成功得到克隆小鼠[1~3]。Yin等把该法也应用于猪卵母细胞的去核[4]。在我国，杜卫华等首次利用化学诱导去核法用于小鼠卵母细胞的去核研究[5]，但对体外成熟培养的猪卵母细胞化学诱导去核研究目前国内尚未见报道。 本研究使用盲吸法和化学诱导去核对不同成熟培养时间的猪卵母细胞进行去核，旨在确定最佳的去核时间；建立猪卵母细胞化学诱导去核方法；同时，通过两种方法的去核效率的比较，为克隆技术研究中卵母细胞去核这一关键环节提供理论依据。 2 材料和方法 2.1 猪卵母细胞的采集 实验所用卵巢均来自于上海市闵行区纪王镇屠宰场屠宰的初情期前小母猪。将获取宰场屠废弃的猪卵巢，置于37℃灭菌生理盐水中，2h内送回实验室。以生理盐水清将卵巢洗两次 *本课题得到上海市科委国际交流项目（015407005）的资助。
曲古抑菌素A预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子的影响
曲古抑菌素A预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子的影响 王雅枫夏中元*袁泉刘恋赵博 武汉大学人民医院麻醉科湖北武汉430060 [摘要] 目的探讨曲古抑菌素A (TSA)预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子的影响。方法Balb/c小鼠随机分为3组(n=10)，假手术组(S组)，缺血再灌注组(IR组)，TSA预处理组(TSA组)。采用MCAO法缺血1h，再灌注24h 建立脑缺血再灌注模型，TSA组在建立脑缺血再灌注前连续3d腹腔注射TSA 5mg/kg。取脑组织，光镜下观察病理学结果，ELISA法检测TNF-α，IL-1β，免疫组化检测Bcl-2，Bax，Caspase-3，TUNEL法检测细胞凋亡。结果与S组相比，IR组病理学损伤严重，TNF-α，IL-1β，Bax，Caspase-3，TUNEL增高，Bcl-2降低(P<0.05)；与IR组相比，TSA组病理学损伤减轻，TNF-α，IL-1β，Bax，Caspase-3，TUNEL降低，Bcl-2升高(P<0.05)。结论曲古抑菌素A预处理通过抑制炎症因子和凋亡因子的表达，减少细胞凋亡，从而减轻脑缺血再灌注损伤。[关键词] 曲古抑菌素A，炎症因子，凋亡因子，脑缺血再灌注损伤 The Preconditioning Effect of Trichostatin A in Cerebral Ischemia Reperfusion Injury on Inflammatory factors and Apoptosis factor Wang Yafeng, Xia Zhongyuan,Yuan Quan, Liu Lian, Zhao Bo Department of Anesthesiology, Renmin Hospital of Wuhan University, 430060, China [Abstract]Objective to evaluate the preconditioning effect of Trichostatin A in cerebral ischemia reperfusion injury on inflammatory factors and apoptosis factor. Methods Three groups mice(n=10), sham group (S); ischemia reperfusion group (IR); ischemia reperfusion and pretreated with TSA group (TSA). The model of ischemia reperfusion group was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO). TSA, 5mg/kg, was intraperitoneally given for 3 days before MCAO. The histopathology was detected by HE staining, TNF-α, IL-1βwere examed by ELISA; Bcl-2, Bax, Caspase-3 were detected by immunohistochemical, the apoptosis was detected by TUNEL. Results When compared with S group, histopathology, TNF-α, IL-1β, Bax, Caspase-3, TUNEL were increased, Bcl-2 were decreased in IR group (P<0.05); compared with IR group, histopathology, TNF-α, IL-1β, TUNEL were decreased, Bcl-2 were increased in TSA group (P<0.05). Conclusion TSA has a protective effect in cerebral ischemia reperfusion by decreasing the expression of inflammatory factors and apoptosis factor, reducing the apoptosis. [Key words] Trichostatin A, inflammatory factors, apoptosis factor, cerebral ischemia reperfusion injury 脑缺血再灌注损伤是指经治疗后缺血脑组织再度获得血液供应，然而损伤程度并没有好转反而进一步加重的现象，称之为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemic reperfusion injury，CIRI)[1,2]。其具有高发病率、高致残率及高致死率的特点，是严重威胁人类健康的疾病之一[3]。 脑缺血再灌注后，机体组织的自我修复是研究的热点之一。胶质细胞在中枢神经系统中发挥着支持神经元、分泌神经营养因子及免疫应答等重要功能[4,5]。 *通信作者: 夏中元, Email: 基金项目: 国家自然科学基金()，湖北省自然科学基金(2017CFB267)
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》 王子玉自编 南京农业大学动科院 2005年8月
实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验 一、实验目的 熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。 二、实验器材和材料 1. 器材及药品 体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。 操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。 2．实验动物： 3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。 三、实验内容 1.小鼠的超数排卵 注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。 注射方法 皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。皮下注射时防止药液从针孔处逸出。 腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。注射针头宜选用小号细针头。注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。 2.卵巢的采集方法 在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。
小鼠卵母细胞的孤雌激活
卵母细胞的孤雌激活 将体外成熟卵母细胞（COCs要提前脱卵丘）分别用M2液及含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液洗3遍，然后将卵母细胞置于含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液中培养2.5小时，之后转入不含SrCl2的无糖CZB液中继续培养3.5小时，即在激活处理6小时后观察原核统计激活率。为了维持孤雌激活胚胎的二倍性，激活液和6小时检查原核前短期培养的培养液中均添加5μg/ml的CB。 激活的判定：2原核或2-细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活；卵质膜破裂者判断为死亡；胞质分裂一次或多次但不出现原核者判断为碎裂（fragmentation）。本实验将碎裂卵均归为未激活卵。对照组为未经激活处理，但与激活组培养相同时间的卵母细胞。每次实验，只有当对照组卵母细胞无一激活时，实验组数据才有效。 实验原理：利用氯化锶抑制第二极体的排出 实验用品：培养12小时并老化12小时，即24小时后的卵【要提前脱卵丘】，透明质酸酶，M2操作液，10摩尔每毫升的氯化锶，含钙CZB, 孤雌激活实验步骤 1,，第一天上午杀鼠取卵，培养卵。假设只有一个培养孔的卵，一个孔里最好有20至30个卵，留置第二天孤雌激活。 2,，第二天上午，算好时间，用紫外线照射两个培养孔，15分钟后加液，一个孔里放激活液，【激活液的组成是CB加氯化锶加无钙CZB】，
配置激活液的方法问师兄。另一个孔里放培养液【含钙的CZB】。3，注意激活液不能预热太长时间，CB热时间长会影响效果，【君佐师兄的加法是无钙CZB450微升加上氯化锶50微升平衡20分钟，然后加上氯化锶做滴平衡20分钟就可以放卵了】，在配置激活液时最后应该用枪打一打，好充分混匀。至于放培养液的孔可以以后考虑，激活需要6个小时。把握好时间，脱卵丘后就马上激活。同时预热上需要的药品，包括M2，含钙的CZB，再照上两个中平皿。 4，开始做时先用透明质酸酶处理培养的卵1至3分钟，脱卵丘。再用M2洗3至4遍，再用激活液洗3至4遍，再移入含有激活液的培养孔中。移入培养箱中激活6个小时。 5，假设上午9点做完，下午3点就可以观察。激活的判断方法是2原核或2细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂者判断为死亡。胞质分裂一次或多次，但不出现原核者判断为碎裂，本实验将碎裂卵均归为未激活卵。 6，将激活成功的卵母细胞用含钙的CZB培养液洗5至6遍，再转移如含钙CZB的培养孔中培养，理论上48小时后就可以看到4细胞期，此时再转入含糖含钙CZB胚胎培养液中培养，即可以到达囊胚期。
卵细胞成熟过程
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 卵子发生 原始卵泡 初级生长卵泡 次级生长卵泡 成熟中的卵泡 成熟卵泡（滤泡）和成熟卵 卵母细胞和卵泡细胞的关系 卵的结构 细胞核 染色体 核仁 细胞质 色素 皮层颗粒 环层板 卵黄 卵的类型 卵膜 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 动物成熟的雌性生殖细胞，亦称卵子。一般呈球形或椭球形，较大，多不能活动。它除具有一般细胞所共有的细胞核、细胞质、细胞器和质膜外，还有一些专供受精后发育所需的营养物质。以哺乳类为例，性成熟后，在神经和激素调控下自卵巢中排出的成熟卵，其外有透明带和放射冠包围，在透明带和质膜之间为充满液体的卵周隙（图1）。 卵（动物） 卵子发生
在性成熟之前卵巢皮层中有相当数量的卵原细胞。卵原细胞是在胚胎时期原始生殖细胞迁移到生殖嵴内分裂繁殖而产生的。卵原细胞之间存在着细胞间桥，所以发育的同步化程度较高。但同步化只限于这一时期，卵原细胞转变为初级卵母细胞时，细胞间桥消失，彼此分开，这点与精子发生不同。哺乳类在胎儿出生前或出生后不久，卵原细胞全部发育为初级卵母细胞。在个体性成熟之前初级卵母细胞不生长。性成熟后卵巢皮层中的、被卵泡细胞包围着的初级卵母细胞在激素刺激下生长，细胞核进行DNA复制,然后进入成熟分裂的前期变化。生长到一定的体积后，初级卵母细胞进行第一次成熟分裂，产生一个次级卵母细胞和第一极体；次级卵母细胞再进行第二次成熟分裂，产生卵子和第二极体。这些变化都是在卵泡中进行的(图2)。卵子和卵泡的发育大致可以划分为： 卵（动物） 原始卵泡尚未开始发育的卵泡，位于卵巢的皮层，由一个卵原细胞和外围一层扁平的卵泡细胞组成，数量很多，但在各类动物中差别很大。 初级生长卵泡卵泡细胞由扁平变为立方形，从一层增殖为几层，卵母细胞也开始增大，细胞核发生一系列成熟分裂前期的变化，产生大量核液，形似球状；在卵母细胞周围开始出现透明带。在透明带中有从卵母细胞和卵泡细胞的表面伸出的微绒毛，它们相互接触，构成卵泡细胞给卵母细胞输送物质的通道。 次级生长卵泡卵泡不断增大，外围的卵泡细胞有几层到十几层，在卵泡细胞之间出现充满透明液体的不规则腔隙，其中的液体即卵泡液。这时卵母细胞也长到最大的体积，并为一层较厚的透明带所包裹。 成熟中的卵泡卵原细胞过渡到卵母细胞，已长到最大体积，并准备成熟分裂；它周围的腔隙逐渐合并越来越大，卵泡仍可继续生长。 成熟卵泡（滤泡）和成熟卵此时体积到达最大限度。初级卵母细胞渐位于卵泡一侧，向腔内突出，仍为卵泡细胞包围，此即卵丘。人的卵泡直径可达1厘米,并从卵巢表面突出。卵泡中的卵母细胞已完成第一次成熟分裂并停止于第2次成熟分裂的中期，等待排卵（图3）。
小鼠体外受精标准化程序
小鼠体外受精标准化程序 雌鼠（8－10周龄）体外促排卵: 1.4点左右腹腔注射尿促性素针剂(10U/只),； 2.48hr后腹腔注射绒促性素针剂(10U/只); 培养液预平衡: 雌鼠注射绒促的当天，准备如下液体 1.Quinn’s 1023（HEPES-HTF培养基）：使用时添加10％SPS，共 5ml； 2.Quinn’s 1020：使用时添加10％SPS，共5ml； 3.Quinn’s 1026：使用时添加10％SPS，共2ml； 以上液体配置后，HEPES-HTF培养基需要拧紧离心管口，Quinn’s 1020与Quinn’s 1026则半旋口，均放置于CO2培养箱内，孵育过夜。 卵子的获得： 1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1020做四个微滴的三个培养皿，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用； 2. 于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与35mm的平皿中； 3. 用颈椎脱臼法处死促排卵雌鼠，取其卵巢及输卵管于上述平皿中； 4. 在解剖显微镜下，用1ml空针剖开小鼠输卵管的壶腹部，即见粘附有大量颗粒细胞的卵子粘液团流出，用拉过的巴斯德吸管吸取置于预先孵育的10％SPS Quinn’s 1020微滴中； 5. 反复冲洗2-3次后，将卵子转入新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微
滴中孵育。 精子的获得： 1.于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与 35mm的平皿中； 2.用颈椎脱臼法处死雄鼠，取其附睾上体尾部，除去脂肪与血迹后， 置于上述平皿中； 3.在解剖显微镜下，用1ml空针剖开附睾上体尾部，稍加震荡后即 见成团精子游出； 4.用拉过的巴斯德吸管吸取后轻轻加入到含2ml 10％SPS Quinn’s 1020液的离心管底部，放入CO2培养箱内使精子上游15-25min； 5.吸取上游液于另一离心管中，室温3000rpm离心15min； 6.小心吸取沉淀，加入到另一含1ml 10％SPS Quinn’s 1020液的圆 底管中，混匀，置于CO2培养箱内备用。 体外受精： 1. 用处理过的精液做几个50μl左右的微滴，盖油，吸取各卵子粘液团分别放置于各微滴中，置于CO2培养箱内受精5－6hr； 胚胎培养： 1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1026做10－15个微滴，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用； 2. 用拉过的巴斯德吸管分别吸取受精卵，于新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微滴中反复吹打数次后，转入预平衡的10％SPS Quinn’s 1026微滴中，培养并观察分裂情况；
大鼠体外受精技术研究进展
大鼠体外受精技术研究进展 张春燕1, 2，刘丽均2，徐平2，芮荣1* 1南京农业大学动物医学院，南京210095； 2中国科学院上海实验动物中心，上海201615 摘要：目前，体外受精技术在多种哺乳动物已取得成功并获得广泛应用。大鼠由于其本身的特殊性，体外受精及随后的胚胎培养一直比较困难，国内关于大鼠体外受精方面的研究更是少有报道。文章主要从卵母细胞体外培养、精子获能、受精、受精卵体外培养及胚胎移植等方面着手，对国外大鼠体外受精的研究现状作一简要综述。 关键词：大鼠；体外受精；胚胎培养；胚胎移植 体外受精（IVF）是指在体外环境完成精卵结合的过程。体外受精研究的深入开展，不仅加深了人们对受精机制的认识，也为动物繁育、治疗人类不孕症提供了有力的手段。目前，该项技术在小鼠、兔、山羊、猪和牛等动物及人类已日趋成熟，并得到广泛应用；但在国内少有大鼠体外受精的报道。现将该领域的研究现状作一综述，以供参考。 1. 大鼠体外受精研究简史 事实上，大鼠是较早用于体外受精研究的实验动物之一。早在1968年，Toyoda 和Chang 就开始了大鼠体外受精技术的研究，但只能使去除透明带的卵子和精子在体外受精[1]。1973年，Miyamoto和Chang利用从交配雌鼠子宫内收集的精子进行体外受精时发现，子宫内收集的精子可以使透明带完整的卵子受精[2]。从而用实验证明，以前的体外受精之所以不成功，关键是精子在体外培养时没有获能，不具备穿过透明带使卵子受精的能力。1974年，Toyoda 等研制出适合于大鼠精子体外获能的培养液，由此逐步建立起大鼠体外受精技术[3]。 近年来，研究者在精子获能液、胚胎培养液及提高体外受精胚胎质量方面做了大量研究，目的是尽量模拟体内受精和胚胎发育环境，探索大鼠体外受精的最适条件，以提高其胚胎体外生产效率。 2. 研究方法及进展 完整的体外受精技术包括：卵母细胞的体外成熟（IVM）；精子获能；体外受精；早期胚胎培养和移植。而胚胎移植结果仍是鉴定体外受精胚胎质量的最有效证据。 2.1 卵母细胞的来源与体外成熟 2.1.1收集卵巢未成熟卵母细胞 哺乳动物的卵巢上有大量未成熟、处于不同发育阶段的卵母细胞，这部分卵母细胞需经IVM培养后，方可用于体外受精。获得卵巢卵母细胞的方法主要有两种：（1）机械分离法－利用穿刺针将卵巢表面的卵泡刺破，释放出卵母细胞；或是采用切割法，将整个卵巢切碎后收集卵母细胞。穿刺法采卵数量少，切割法获卵数较多，但切割法会产生更多裸卵或造成卵丘细胞损伤。（2）胶原酶消化法－该方法主要用于腔前卵泡卵母细胞的分离。 大鼠大卵泡（直径>350um）卵母细胞的体外培养，通常使用含15％灭活血清的MEM (Eagle’s Minimum Essential Medium)作为培养液，培养12 h后检查成熟发育情况，以生发泡破裂或第一极体排出作为成熟的判断标准。 *通讯作者，Email：rrui@https://www.wendangku.net/doc/a58866945.html,。
小鼠胚胎培养方法的探究
小鼠胚胎培养方法的研究 摘要 目的：探讨小鼠早期胚胎在不同的体外培养液中生长发育的状况，从而寻找胚胎培养的最佳培养体系，为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据，以提高临床体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）的成功率。 方法：配制不同的培养液，对１００例小鼠超排卵共取卵子１６７８枚，分别在不同的培养液中进行体外授精，并将２一细胞鼠胚放入各组培养液中进行培养，其中，血清组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清：卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％人卵泡液；蜕膜细胞条件培养液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％条件培养液：血清加卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％人卵泡液：血清加条件培养液组为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％条件培养液。每日在显微镜下观察小鼠胚胎的发育情况，分析受精率、卵
山西医科大掌 裂率、卵裂速度及桑椹胚与囊胚形成率，采用ｘ２分割检验进行统计分析。 结果： 一、１、小鼠胚胎在蜕膜细胞条件培养液中有７２．９％发育到８．细胞期，６６．０％发育到桑椹胚，６１．６％形成囊胚，３２．１％胚胎孵化。而对照组有４３．６％发育到８．细胞期，３０．９％发育到桑椹胚，１９．１％到初级囊胚，５５％孵化的胚胎。两组比较有显著性差异。２、卵泡液的胚胎有７１．３％到８．细胞期，５８８％发育到桑椹胚，５０．Ｏ％形成囊胚，２５７％孵化。与对照组比较有差显著性异。３、血清组有５３，４％发育到８．细胞期，４０．５％到桑椹胚，２９．３％形成囊胚，仅有７．８％孵化。与对照组无显著性差异。 二、鼠卵在不同培养液中受精率无显著性差别，而对于卵裂率和优质胚胎的形成率，鼠卯在蜕膜细胞条件培养液组和卵泡液组中均与对照组有显著性差异，而血清组与对照组比较无差异。鼠胚在蜕膜细胞条件培养液和卵泡液中培养发育速度快，碎片率明显低于对照者。 三、小鼠早期胚胎在卵泡液组、蜕膜细胞条件培养液组
鼠胚实验在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用_王辉田
文章编号：1003－6946（2015）02－115－05 鼠胚实验在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用 王辉田，李涛，黎伟豪，欧建平 （中山大学附属第三医院生殖医学中心，广东广州510630） 【摘要】目的：检测新建体外受精实验室培养体系的可靠与否，是否符合人类胚胎体外培养的要求。方法：对昆明白小鼠进行超促排卵，手术获取昆明白小鼠雌雄配子进行体外受精和体内受精的胚胎；并进行体外培养观察两组鼠胚的受精率、2-细胞率、囊胚率及采用密度梯度离心法和上游法两种精液处理方法对小鼠体外受精胚胎发育情况的影响。结果：进行了30个周期的体内受精体外培养实验，共获卵1136枚；进行了35个周期的体外受精实验，共获卵1486枚。体内受精组获得的受精率（93.13?1.46）%和2-细胞率（94.52?1.67）%高于体外受精组的受精率（84.39?2.87）%和2-细胞率（87.80?3.21）%，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。密度梯度离心法处理精液后，其受精率（90.32?3.14）%和2-细胞率（88.54?2.28）%高于上游法的受精率（76.46?2.35）%和2-细胞率（82.67?2.62）%，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：小鼠卵母细胞体内受精和体外受精后均有高的成胚率，体内受精后进行体外培养优于体外受精后培养，采用密度梯度离心处理精液实施体外受精优于上游法，鼠胚实验可对新建胚胎培养室的培养体系进行评估。 【关键词】鼠胚实验；体外受精；质量控制；胚胎培养 中图分类号：Ｒ332文献标志码：A 通讯作者：欧建平，Email：oujianping@hotmail．com 于被患者接受。操作简便、设备要求相对较低，具备超声介入条件的基层医院均可以推广。 研究认为，聚桂醇注射液主要是使绒毛附着处肌层血管闭塞，故主要适用于病灶累及肌层，子宫肌层连续性尚存在的CSP患者［9］。CSP处肌层菲薄，行B 超监护下胚囊清除术联合清宫术，可将不可视的清宫术变为相对可视的，减少子宫穿孔及残留。 本技术开展时间尚短，查阅文献联盟（万方数据库），国内外尚未见聚桂醇硬化剂广泛用于CSP治疗的报道。尚有诸多问题值得进一步探讨：瘢痕部位血供恢复情况，聚桂醇使用的最高剂量、最佳浓度，胚囊清除术联合清宫术的最佳时机，再次妊娠时子宫下段的伸展情况等尚需进一步随访观察。但超声介入下注入聚桂醇硬化剂治疗CSP成功率高，未出现明显副反应以及并发症，符合CSP治疗的原则，即最大限度地保留了女性的生育功能，不失为临床治疗CSP的又一适合部分女性患者和疗效满意的治疗方案，可供借鉴。 参考文献 ［1］张淑珍，童水娟，寿坚．超声介入下注射硬化剂治疗剖宫产子 宫切口妊娠10例初探［J］．现代实用医学，2014，26（3）：274－ 275． ［2］徐栋，李明奎，徐佳英，等．超声造影指导下聚桂醇硬化治疗子宫切口妊娠的临床价值［J］．中国超声影像学杂志，2014，23（2）： 162－164． ［3］蔡薇，杨太珠，罗红，等．剖宫产后瘢痕处妊娠经阴道超声图像分析的临床意义［J］．实用妇产科杂志，2009，25（10）：622－ 624． ［4］郑艳，徐春丽．聚桂醇400临床应用进展［J］．药学进展，2012，31（2）：190－192． ［5］邓新粮，何小丽，肖松舒．剖宫产术后子宫切口部位妊娠保守治疗16例疗效分析［J］．实用妇产科杂志，2008，24（6）：372－373．［6］陈春林主编．妇产科放射介入治疗学［M］．北京：人民卫生出版社，2003：393－395． ［7］邵华江，马建婷，徐丽萍．剖宫产瘢痕妊娠治疗方法与疗效综合分析［J］．中华医学杂志，2012，92（31）：2191－2194． ［8］汪芳，石珍，朱亚飞，等．高强度聚焦超声治疗子宫切口妊娠临床分析［J］．中国超声医学杂志，2013，29（2）：177－179． ［9］倪雪君，谢阳桂，吴超，等．超声引导下瘤内注射聚桂醇硬化治疗子宫肌瘤的临床研究［J］．南通大学学报（医学版），2012，32 （5）：414－415，封2． （收稿日期：2014-10-12；修回日期：2014-12-15）