实验八 DNA定量分析

实验八DNA定量分析

一、原理

在DNA分子操作过程中，DNA浓度是一个非常关键的因素，例如要对DNA进行酶切、PCR、测序等操作都需要DNA进行定量。常用DNA定量方法有两个，一个是紫外光谱分

析法，另一个是EB荧光分析。

紫外光谱分析：其原理基于DNA(或RNA)分子在260nm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状双链、单链之间的转换，也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来正。该法的特点是：准确，简便，但需要紫外分光光度计。

EB荧光分析：EB也就是溴化乙锭，是一种荧光染料，它能插人DNA或RNA的碱基对平面之间而结合于上。—旦EB结合在DNA分子上，它就能在紫外光的激发下产生桔黄

色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB的量与DNA分子长度和数量成正比，因此荧光强度可以表示DNA量的多少。这种方法的优点是简单，经济，若结合凝胶电泳还同时分析出DNA的纯度。缺点是准确性较低。

二、方法

(一)应用紫外分光光度法定量分析DNA

1．用TE或蒸馏水对待测DNA样品进行稀释

2．用TE或蒸馏水作为空白，在紫外分光光度计上测定DNA烯释液的260nm、280nm

310nm光密度值(OD值)。

3．通过计算确定DNA浓度或纯度

DNA浓度汁辑：公式为：

单链DNA(ssDNA):[DNA]＝33X(OD260一OD280)X稀释倍数

双链DNA(dsDNA)：[dsDNA]＝50X(OD260一OD280)X稀释倍数

单链RNA(ssRNA):[ssRNA]=40X(OD260-OD280)X稀释倍数

(二)应用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法进行DNA定量分析

1．用含0．5μ/ml的EB的l％TAE(或TBE)琼脂糖凝胶制备微型水平电泳凝胶2．凝胶凝固后，对待测样品及标准DNA进行递度稀释。

3．把稀释的DNA样品液及标准DNA(0．1～0.5μ)分别与加样缓冲液混匀,然后将混合液加在新制备的凝胶的点样7孔内。

4.以30mA稳流方式或100V稳压方法电泳，直到溴酚蓝达到胶的3／4处。

5．紫外灯厂观察，肉眼可见样品的最高稀释度，含DNA80ng左右，相片上最后可见稀释度含DNA20ng左右。同时与标准DNA对照，就可确定出待测样品的浓度。

(三)用溴化乙锭斑点定量法对DNA浓度进行快速估测

1．用TE缓冲液配制DNA标准液：Oμg／ml、lμg／ml、2．5μg／ml、5μg／ml、7．5μg／ml、10μg/ml和20μg／ml。

2.吸取标准DNA及样品4μl分别点在塑料膜上，每个样品一个点，则分别向每个样品中加入4μl1μg／ml溴化乙锭。混匀。

3．将塑料膜置于紫外分析仪上照相，通过与标准溶液的荧光进行比较，估测未知DNA 的浓度。

三、试剂和仪器

1．已知浓度的标准DNA样品

2．EB贮存液(10μg／ml)

3.5XSDS加样液

甘油50％，SDSo．5％,溴酚蓝0.1，二甲氢苯0.1%。

4．琼脂糖

5．TE缓冲液

6．ddH2O

7．TAE缓冲液

50X浓缩贮存液

Tris121g

冰醋酸29.6ml

0．5mol／L EDTA,pH8．0

EDTA Na2·2H2O18.61g

ddH2O80ml

用NaOH调pH值至8.0(约需NaOH2g),然后定容至100ml。

9．紫外分光光度剂

10．电泳仪

11．潜水式微刑水平电泳槽

12．透射式紫外分析仪

四、说明

1．紫外分光光法测定浓度时OD310值是背景，若盐浓度较高，OD310值也高。此外230nm光吸收反映了样品被酚或尿素污染的程度。而325nm的光吸收则提示有特殊物质污染或比色杯太脏。

2．OD260/OD280对DNA而言，其值大约为1.8～1.9,高于1.9则可能有RNA污染，低于1.8则可能有蛋白质污染。

3．OOD260/OD280对RNA而言，其值大约为1.9～2.0。