Western-blot汉恒生物

Western-blot实验步骤

一、SDS-PAGE胶的制备

将玻璃板洗干净晾干备用，将玻璃板进行装配加紧，按照配方配制不同浓度的分离胶，将配置好的分离胶加入玻璃夹层，体积大约2/3，再加入饱和正丁醇压平分离胶，进行液封，待凝固。大约30min后待分离胶与饱和正丁醇出现明显分离线，倒出上层正丁醇，用去离子水冲洗，然后用滤纸吸干残余的去离子水。按照配方配制浓缩胶，加入浓缩胶，插入梳子，大约30min待凝固。

二、蛋白凝胶电泳

取出PAGE胶，上推胶板以免漏液，放入电泳槽，加入电泳缓冲液，轻柔缓慢拔出梳子，以免破坏胶孔，然后将电泳液补满，到没过底玻璃板即可。

诱变后的菌液10000rmp,1min离心，倒掉上清，按1：1加入2*上样缓冲液，在95度煮5min。按照既定的上样顺序进行点样，（样本浓度、体积尽量保持一致）。两侧加入蛋白分子量Marker，在泳道两侧加入10ul保护蛋白（即普通的蛋白样本），以防止电泳时出现边缘效应。对应正负极盖上盖子，将电压调至80V进行电泳，气泡出现表示电泳开始。当蛋白样品电泳至下层分离胶时，暂停电泳，将电压调至120V继续电泳，待目的蛋白电泳至分离胶三分之二处停止电泳。

三、转膜

将裁减掉右上角的PVDF膜泡入甲醇中待用，倒入预冷的转膜缓冲液，将转膜夹和海绵完全浸入缓冲液中，

放置滤纸（需完全浸湿），确保滤纸与海绵之间无气泡，

将电泳完的凝胶玻璃板取出，按照蛋白Marker切割目的蛋白所在区域的凝胶，将目的蛋白凝胶置于滤纸上，并用转膜缓冲液润湿，将浸泡完甲醇的PVDF膜置于凝胶之上（膜的右上角对应凝胶的右上角），赶出PVDF膜与凝胶之间的气泡，盖上润湿的滤纸，放置时不要引入气泡，合上转膜夹，将转膜夹对应正负极放入转膜槽（黑对黑，白对红），放入冰盒，灌满转膜液，对应正负极盖上盖子。在冰浴条件下，将电流调至200mA进行转膜（30-80kd,60min，80-120kd,100min).

四、考马氏亮蓝染色

取出配置好的考马氏亮蓝G250于培养皿中待用，转膜完成后在转膜缓冲液中取出PVDF膜，此时膜上蛋白Marker清晰，胶上无明显蛋白Marker，表明转膜完全。剪去无蛋白区域，剪去膜的右上角，以确定膜的方向。将膜置于TBST 中清洗，然后将膜置于染色液中，置于摇床摇动3-5min。然后用蒸馏水重复漂洗2-3次，直至出现清晰条带（如条带清洗整齐则表明之前的western-blot步骤成功）。置于TBST中重复清洗来2-3次（摇床摇动），直至染液退去。

五、封闭

将PVDF膜取出放入预先配置好的脱脂牛奶（5%），室温缓慢摇动1h

六、抗体孵育

将配制好的一抗倒入抗体孵育盒，将封闭完的PVDF膜用TBST清洗一遍后置于一抗中，一抗4度冰箱或冷库缓慢摇动过夜，过夜后将孵育了一抗的PVDF膜置于TBST中重复清洗3次，每次10min（摇动）。将配置好的二抗倒入抗体孵育盒中，将PVDF膜置于二抗室温缓慢摇动1h

七、显色

试剂盒，将PVDF膜控干（夹住在滤纸上停留一会）之后平铺于一次性PE手套上，将显色液均匀涂在PVDF上，避光孵育2min，显影。

八、去除一抗二抗（strip膜再生）

代谢相关疾病基因功能研究介绍

代谢相关疾病基因功能研究介绍 代谢是生物体内所发生的用于维持生命的一系列有序的化学反应的总称。常见的代谢性疾病有糖尿病、肥胖症、骨质疏松、痛风、脂质代谢紊乱以及甲状腺、垂体、肾上腺、性腺、甲状旁腺等疾病。 一、疾病模型 (一)糖尿病模型。糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素 分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。在对糖尿病的研究中，常见的模型 包括： 1.一型糖尿病模型 A药剂诱导型：①STZ (streptozocin), 链脲菌；②Alloxan,四氧嘧啶 B自发型：①NOD (non-obese diabetes)小鼠；②AKITA小鼠 2.二型糖尿病模型 A肥胖二型糖尿病模型 ①db/db小鼠 ②ob/ob 小鼠 ③Zucker fatty大鼠 ④ZDF (Zucker diabetic fatty) 大鼠 ⑤果糖（fructose）长期饮食的二型糖尿病动物模型 ⑥果糖短期饮食+低剂量STZ一次投药 B瘦型二型糖尿病模型 GK(Goto-Kakizaki )大鼠 (二)肥胖症模型。肥胖症是一组常见的，古老的代谢症群。当人体进食热量多于消耗热 量时，多余热量以脂肪形式储存于体内，其量超过正常生理需要量，且达一定值时 遂演变为肥胖症。在对肥胖的研究中，常见的模型有： 1.谷氨酸钠(MSG)诱导的肥胖动物模型 新生小鼠或大鼠皮下注射MSG可诱导其产生肥胖。脂肪堆积是MSG肥胖动物的主要表现,其体脂在2周龄时即显著增加,一直增加到4月龄时。在30～90d时即已形成脂肪肝。 2.金硫葡萄糖(GTG)致肥胖模型 给成年小鼠腹腔注射GTG可诱导其产生肥胖, GTG所诱导的肥胖,被人们普遍认为系下

关于在生物科技有限公司的实习报告

关于在生物科技有限公司的实习报告 关于在生物科技有限公司的实习报告2015-04-24 03:00:22 关于在生物科技有限公司的实习报告如下文 关于在**生物科技有限公司的实习报告 2011级生物技术及应用班1102040135 谢-金-辛 1实习目的和意义： 学校的目的： 让我们在工厂里品尝到从未有过的苦头，也将学校里学到的理论知识和实验操作技能灵活地应用于寒假实习工作中。

对我们成长的意义： 使我们明白在学校学到的东西要拿到社会上来用是远远不够用的，也不能解决一切问题。来到社会进行实习工作后，才理解社会为什么不像在学校那样单纯、简单。但是，对于科研方面在学校就要求比较复杂，而工厂的生产就讲就越简单越好，尽量节约科研的成本。 2实习单位的情况简介： **生物科技有限公司： 位于南宁市江南区吴圩明阳工业园，公司主要从事速生杏鲍菇培育，现将建成一间种菇房，面积约1200平方。 他们的主营产品、服务、类型、成就： 速生杏鲍菇。该企业的虽然属于股份制有限责任公司，但是它却是拥有1000 万

元注册资金的种苗生产型行业。那公司法人代表张生新负责用50名员工就开动了公司基础建设和初步运作。该公司在南宁市江南区吴圩镇出生于2012年4月5日。 3实习的工种和岗位： 实习的岗位： 在半个月的实习工作中，40%的时间里我是一名培养基配制员，50%的时间内我在进行的是隔菌盖的组装工作，还有10%的时间是用于干杂活。 多样的工种： 接种员主要负责将试管里的菌种接入装有培养料的瓶中，并要求严格按照技术规程操作甲醛对接种室进行周期性循环杀毒灭菌。灭菌锅操作员主要负责受污染菌瓶的处理和无菌接种工作前的操作

生物技术科技项目建议书

项目建议书 项目领域：生物技术 项目名称：移植排斥反应的预测、诊断试剂盒的开发生产单位：陕西瑞奇生物科技有限公司

一、基本信息 1.项目负责人基本情况 姓名胡军性别男出生年月1962.10 学历研究生学位博士获得最终 学位院校 第四军医 大学 所学专业移植免疫学现从事专业移植免疫学职称讲师职务/ 主要工作经历1982-1989年，在河南省确山县卫生防疫站从事流行病防治工作。 1989-1992年，在第四军医大学微生物学教研室病毒及其免疫专业读硕士学位。 1992-1996年在第四军医大学微生物学教研室从事病毒及其免疫和移植免疫的研究工作。 1996-1999年，在第四军医大学西京医院心血管病研究所移植免疫学专业读博士学位。 1999-2001年在第四军医大学西京医院心血管病研究所从事移植免疫学研究。 2001年至今，从事生物技术产品的开发研究，主要从事移植免疫学产品的开发工作。 主要工作成绩 从事过的主要重大项目情况、研究成果和获知识产权情况（不限字数） 1、军队重大课题《心肺联合移植临床研究》2002.05-2005.12 主要参加者。项目进展顺利。 2、《心脏移植临床与基础研究》项目的主要参加者，已获得陕西省科技进步一等奖。 3、已获得国家发明专利一项，已申请的发明专利一项，准备申请的专利两项。

2.项目基本信息 项目内容摘要（限500字）：器官移植排斥反应预测、诊断产品的开发生产器官移植是临床上发展最迅速的一个领域，据权威机构预测，到二十一世纪中叶，外科手术的一半都将是器官置换。世界上已有70多万人接受了器官移植，而且这个数字还在以每年5万多例的速度增加，但临床上对器官移植病人的选择及移植后排斥反应的无创诊断、监测手段等尚未建立起来；这严重制约了器官移植的发展和水平的提高。 本项目把基因工程技术和传统免疫学方法及新建立的免疫学方法结合起来，制备世界通用的HLA抗原标准细胞，为器官移植前的供、受体搭配，移植后排斥反应的预测、诊断提供快捷、敏感、特异、可靠、无创的科学检测方法，该方法目前已用于临床心脏移植的排斥反应的诊断，经过大量的临床活检对照有很好的一致性，该方法的最佳反应条件也已基本建立，目前只需制备出通用检测试剂盒生产所需的原材料即可进行产品的大规模生产。该项目的成功填补了世界器官移植领域的空白，对急性排斥反应的早发现、早诊断、早治疗，明显提高移植患者的生存质量，延长存活期限均具有革命性的重要作用。不但具有广泛的社会效益，而且还具有巨大的经济效益。该试剂盒的出现会大力推动器官移植领域的发展，终将使全球器官移植的总体水平有明显提高。 本项目原材料的制备使用的技术是目前最先进的基因工程技术；其所用的混合淋巴细胞培养方法是目前免疫学专家公认的，反映机体细胞免疫状态最好的体外模型；所用的混合淋巴细胞反应抑制试验是我们近期才新建立的一个细胞免疫学检测的新方法，并已申请专利，故本项目产品短期内被其他更先进的技术和方法所取代的可能性不大。所使用的主要原材料和主要技术均立足国内，采购渠道通畅。 器官移植排斥反应预测、诊断、监测领域在世界上属于一个尚未开发的领域,尚未有与排斥反应诊断有关的试剂盒推出, 我们申请国内外专利后可保护20年。目前排斥反应预测试剂盒已获国家发明专利，正在申请美、日、德、英、印五国的专利；排斥反应诊断试剂盒已申请国家发明专利。本产品的出现将抢占全球器官移植领域产品的至高点。 本项目产品以出口为主，市场约4-5亿美元/年（市场上无同类竞争产品）。预计总投资约5000万元人民币，首期投资需1000-1500万元人民币。投资到位后18-24个月可具备批量投产条件，生产能力为年产80万套，投产一年后年产150万套。届时，年销售收入20亿元人民币，税收3亿元人民币，净利润8亿元人民币。产品上

汉恒生物 荧光素酶实验原理

汉恒生物 荧光素酶检测服务 汉恒生物科技（上海）有限公司 地址：上海浦东新区蔡伦路150号1号楼

psiCHECK2---miRN A与其靶点相关分析,包括miRNA靶基因验证(参考案例二A和B)、lncRNA (参考案例三)与circRNA (参考案例四)吸附miRNA 验证等。需要把miRNA 潜在结合靶点克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR区域，然后与待测miRNA共同转染细胞内测定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase （hLuc+）作为校正内参校正不同样品之间转染的转染效率。 pGL3-Basic---用于转录因子结合位点与启动子活性分析。把待分析启动子区段构建到F-Luciferase上游，和转录因子共转染分析F-Luciferase活性即可反应启动子的活性高低。该质粒通常需要结合持续性表达R-Luciferase的载体作为内参以校正不同样品之间转染的转染效率(参考案例一)。 两种常用载体类型极其应用场景 技术线路 学术、技术团队根据顶级学术论文真实案例协助方案设计 根据实验目的确定设计方案 采用汉恒HB-Infusion TM 无缝克隆策略，提高载体构建效率 根据实验目的确定设计方案 独家定制的转染试剂和病毒转导 系统确保基因转导效率 根据实验目的确定设计方案 顶级商品化检测试剂盒和强大高 效的检测仪器 根据实验目的确定设计方案 详实的原始数据，细致的结果分 析，清晰的实验结论 根据实验目的确定设计方案

LncRNA转录因子结合位点与启动子活性分析 论文来源: Wang, P ., et al. (2014). "The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation." Science 344(6181): 310-313. 本文是曹雪涛实验室在2014年发表在Science上一篇研究性论文。作者通过芯片鉴定出DC (树突状细胞)发育相关的一个lncRNA，命名为lnc-DC。同时高通量测序也发现了这条差异lncRNA的存在。进而作者通过Northern Blot验证了这条lnc-DC。由于lnc-DC极其特异和稳定地高表达在DC发育过程的某一时期，所以作者假设lnc-DC可能是和表观遗传学调控事件相关的。为了验证这一假设，作者通过染色体免疫沉淀结合测序的技术-CHIP-seq和qPCR发现lnc-DC的转录起始位点（TSS）附近富集了Pol II、H3K4me3和H3K27ac等蛋白（下图A），提示DC发育过程中表观遗传学变化与lnc-DC的转录增强事件相对应。进而作者通过序列分析发现在lnc-DC的转录起始位点附近（+44-+50）存在一个经典的PU.1结合位点。作者假设PU.1参与了lnc-DC的特异性表达。于是作者设计了如下实验进行了进一步的验证（下图B）。 作者把lnc-DC的启动子区段（-1447-+223）及其不同的突变体版本分别克隆到F-Luciferase表达框上游，然后和转录因子PU.1表达质粒或者空载体（Vector）共同转染到模式细胞系HEK-293T，通过测量荧光强度的变化间接反应转录活性的高低。最终证明转录因子PU.1通过经典结合位点（+44-+50）介导了lnc-DC在DC发育过程中的特异表达。 LncRNA通过吸附miRNA调控靶基因mRNA的表达 (ceRNA) 论文来源: Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147(2): 358-369. 作者通过表达分析发现了一条肌肉发育相关的lncRNA---lnc-MD1.前期功能研究发现lnc-MD1可以调控肌肉分化的时间。信息学分析发现这条肌肉特异的lncRNA上包含36个miRNA的结合位点。如果只考虑肌肉发育相关的miRNA和基因，36个候选miRNA里面只剩下miR-133和miR-135。作者通过荧光素酶实验进行了验证。首先作者把野生型及其缺失miR-133和miR-135结合位点的Lnc-DC1克隆到进R-Luc的3’UTR，然后分别与表达miR-133和miR-135前体的质粒共同转染到细胞进行荧光素酶活性检测（下图A和B）。证明lnc-MD1缺失存在miR-133和miR-135的结合位点。 进一步的信息学预测，miR-133和miR-135分别靶向两个基因- MAML1 和 MEF2C。同样，作者还是通过荧光素酶实验进行验证。研究者把MAML1 和 MEF2C的3’UTR （WT）和miRNA结合位点缺失突变体（-mut）分别克隆在RLuc表达框的下游，然后和miRNA过表达载体共转染细胞进行酶活测定。结果显示miR-133和miR-135确实分别靶向了MAML1 和 MEF2C两个基因（下图C）。最后的模型是lnc-MD1通过ceRNA机制吸 附miR-133和135，正向调控了MAML1 和 MEF2C的表达，参与调控肌肉发育。 经典应用案例二

生物科技有限公司章程

生物科技有限公司章程 依据《中华人民共和国公司法》（以下简称《公司法》）及其他有关法律、行政法规的规定,并制定本章程。 第一章公司的名称和住所 第一条公司名称：上海生物科技有限公司章程 第二条公司住所：上海市虹口区四川北路85号xx室 第二章公司经营范围 第三条公司经营范围：生物制品专业领域内的技术开发、技术咨询、技术服务、技术转让、仪器仪表、化工原料及产品（除危险品）、机电设备、家用电器、建筑材料的销售。（涉及行政许可的，凭许可证经营） 公司经营范围中属于法律、行政法规或者国务院决定规定在登记前须经批准的项目的，应当在申请登记前报经国家有关部门批准。 第三章公司注册资本 第四条公司注册资本：人民币 1000 万元； 第四章股东的姓名或者名称、出资方式、出资额和出资时间第五条股东的姓名（名称）：王某 出资额：1000万元 出资方式：认缴 出资时间： 第六条公司成立后，应当向股东签发出资证明书。 第五章公司的机构及其产生办法、职权、议事规则第七条公司股东会由全体股东组成，是公司的权力机构，行使下列职权： （一）决定公司的经营方针和投资计划； （二）选举和更换执行董事、非由职工代表担任的监事，决定有关执行董事、监事的报酬事项； （三）决定聘任或者解聘公司经理及其报酬事项； （四）审议批准执行董事的报告； （五）审议批准公司监事的报告； （六）审议批准公司的年度财务预算方案、决算方案； （七）审议批准公司的利润分配方案和弥补亏损方案； （八）对公司增加或者减少注册资本作出决议； （九）对发行公司债券作出决议； （十）对公司合并、分立、解散、清算或者变更公司形式作出决议； （十一）修改公司章程； （十二）为公司股东或者实际控制人提供担保作出决议。 对前款所列事项股东以书面形式一致表示同意的，可以不召开股东会会议，直接作出决定，并由全体股东在决定文件上签名、盖章（自然人股东签名、法人股东盖章）。 第八条首次股东会会议由出资最多的股东召集和主持，依照公司法规定行使职权。

生物技术公司商业计划书(doc 29页)

大连XXX生物技术有限公司 商业计划书 [指定联系人]：XX [职务]： [电话号码]：0411-******* 0411-191-648**** [电子邮件]：jx-bba@**.net [地址]：大连市中山区独立街**号**大厦*座****室 [国家、城市]：中国大连 [邮政编码]：116001 [网址]： 保密须知 本商业计划书属商业机密，所有权属于大连XXX生物技术有限公司。其所涉及的内容和资料只限于已签署投资意向的投资者使用。收到本计划书后，收件人应即刻确认，并遵守以下的规定：1）若收件人不希望涉足本计划书所述项目，请按上述地址尽快将本计划书完整退回；2）在没有取得大连XXX生物技术有限公司的书面同意前，收件人不得将本计划书全部和/或部分地予以复制、传递给他人、影印、泄露或散布给他人；3）应该象对待贵公司的机密

资料一样的态度对待本计划书所提供的所有机密资料。 本商业计划书不可用作销售报价使用，也不可用作购买时的报价使用。 商业计划编号：授方： 签字： 公司： 日期： 目录 摘要 第一章：公司介绍 一、公司概述 二、公司经营方针和发展战略 三、企业人员及开发能力 第二章：产品介绍 一、微生物净水剂 二、微生物肥料 第三章：市场分析 一、市场容量分析 二、市场竞争地位分析 第四章：公司融资计划 一、融资方案

二、公司融资需求与投向 三、风险分析 四、退出机制 第五章：财务预测 第六章：结论 摘要 大连XXX生物技术有限公司属技术开发导向型企业，主要致力于生物菌剂、生物农药、生物有机肥和生物水质净化剂等产品的研制、开发、技术转让、联合生产销售。公司致力于充分发挥科研开发、技术创新能力，不断推进科研成果的产业化，从而

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

自噬监测——LC3双标腺病毒(完整版)

自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 1 自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 背景： 自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating ）”的现象，凋亡是“自 杀（Self-killing ）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白， 但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指 膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包 裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与 溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳 态和细胞器的更新。目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略 和手段有：通过western blot 检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体 的形成；在荧光显微镜下采用GFP （-RFP ）-LC3等融合蛋白来示踪自 噬体形成以及降解。近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们 汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流) 的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指 示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对 酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检 测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了 细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利 器。

mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作 收到病毒后的处理 （一）、腺病毒的储存 1、腺病毒采用冰袋运输。 （1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进 行分装； （2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱 保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。 2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病 毒滴度10%）。建议不要在-20℃下长期保存。如果病毒储存时间 超过6个月，应该重新测定病毒滴度。 3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小 包装病毒产品（购买时请提出）。 （二）、腺病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞 用PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于 实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释， 并尽快用完。 感染目的细胞 2

××生物技术公司商业计划书

××生物技术有限公司 商业计划书 保密须知 本商业计划书属商业机密，所有权属于××生物技术有限公司。其所涉及的内容和资料只限于已签署投资意向的投资者使用。收到本计划书后，收件人应即刻确认，并遵守以下的规定：1）若收件人不希望涉足本计划书所述项目，请按上述地址尽快将本计划书完整退回；2）在没有取得大连施倍得生物技术有限公司的书面同意前，收件人不得将本计划书全部和/或部分地予以复制、传递给他人、影印、泄露或散布给他人；3）应该象对待贵公司的机密资料一样的态度对待本计划书所提供的所有机密资料。 本商业计划书不可用作销售报价使用，也不可用作购买时的报价使用。 商业计划编号：授方： 签字： 公司： 日期： 目录 摘要 第一章：公司介绍 一、公司概述 二、公司经营方针和发展战略 三、企业人员及开发能力

第二章：产品介绍 一、微生物净水剂 二、微生物肥料 第三章：市场分析 一、市场容量分析 二、市场竞争地位分析 第四章：公司融资计划 一、融资方案 二、公司融资需求与投向 三、风险分析 四、退出机制 第五章：财务预测 第六章：结论 摘要 ××生物技术有限公司属技术开发导向型企业，主要致力于生物菌剂、生物农药、生物有机肥和生物水质净化剂等产品的研制、开发、技术转让、联合生产销售。公司致力于充分发挥科研开发、技术创新能力，不断推进科研成果的产业化，从而实现创造生态文明的宗旨。公司目前的

主要产品是生物水质净化剂和施倍得系列生物肥，都是以高科技为基础的、符合绿色生态的生物产品。 公司拥有一批团结、务实、高效、具有很强开拓精神的领导集体，他们在对科技的理解和把握上，在市场开发、公司管理上，在产品研发、经营销售、公共关系等方面具有高超的知识和丰富的经验，他们的坚强领导确保了公司的长远发展。 ××生物肥是公司成立后首先完成中试、形成生产规模的获国家发明专利的产品。该产品共计投入研制费用120万元，现已实现了产业化，每年可实现“原菌液”产值500万元，利润250万元。目前可满足10家以上大型肥料生产厂的生产需要，生产施倍得生物肥100万吨以上。公司采用联合生产的合作方式，即公司提供原菌液、专用肥配方、成套设备清单并负责技术指导和协调市场销售。目前在东北已有四家施倍得生物肥厂生产专利产品“施倍得牌系列生物”，设计生产能力8万吨，推广面积200万亩。 该公司微生物净水剂项目是国家农业部“948”计划项目，公司共投入研制经费150万元，其中75万元来源于国家无偿提供的科技型中小企业技术创新基金，40万元来源于地方政府无偿提供的配套资金，公司自筹35万元。现阶段该项目已完成室外池塘养殖初试，并已开始后续研发和中试。预计2002年5月中试结束，2002年7月之前确定产业化建设方案。为了完成中试，实现进一步产业化推广，需要继续投入160万元。目前公司总资产300万元，流动资金60万元，资金缺口100万元需要进行融资。

逆转录病毒试用装操作手册

汉恒逆转录病毒操作手册 一、逆转录病毒的试用装分装与储存 1.收到汉恒生物逆转录病毒产品后，请先对逆转录病毒产品进行分装处理，建议20-50μl/管。如1-2天内使用，则留足够量病毒4℃保存，余下逆转录病毒置于-80℃长期保存。 2.病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。 3.反复冻融会降低逆转录病毒滴度：逆转录病毒滴度越低，冻融对滴度的影响越大，108IU/ml的逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异，第3次冻融开始，每冻融一次滴度降低约10%；滴度107IU/ml滴度逆转录病毒，从第2次冻融开始，每次冻融病毒滴度下降10%-15%。 二、逆转录病毒试用装实验策略与关键知识点 1.逆转录病毒感染策略：逆转录病毒本身的病毒滴度不高，感染细胞时病毒消耗量较大，试用装体积较小，建议使用96孔板进行MOI梯度感染测试。逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转，因此逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞，然后将细胞放大化培养。而不是直接大量感染。 注意：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用腺病毒感染。 2.逆转录病毒感染关键知识点 1）细胞准备：由于试用装体积有限，请使用96孔板准备细胞，逆转录病毒感染细胞前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%～60%间为宜。 2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。 逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。MOI一般以3：10：30：100的比例递增进行梯度摸索，一般的细胞基础逆转录病毒感染MOI 可从3为开始，即设立4个常规的MOI摸索，即3，10，30，100。 3)助转剂polybrene的选择：实验证明，polybrene可提高逆转录病毒对大部分细胞的感染效率，但polybrene 有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，polybrene最常用的工作浓度为5～8μg/ml。 4）MOI对应病毒体积的换算（非常重要） 感染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2计算）×MOI=病毒个数；则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。

某生物技术有限公司商业计划书

XXXXXX生物技术有限公司商业计划书

目录摘要 第一章：公司介绍 一、公司概述 二、公司经营方针和发展战略 三、企业人员及开发能力 第二章：产品介绍 一、微生物净水剂 二、微生物肥料 第三章：市场分析 一、市场容量分析 二、市场竞争地位分析 第四章：公司融资计划 一、融资方案 二、公司融资需求与投向 三、风险分析 四、退出机制 第五章：财务预测 第六章：结论

摘要 XXXXXX生物技术有限公司属技术开发导向型企业，主要致力于生物菌剂、生物农药、生物有机肥和生物水质净化剂等产品的研制、开发、技术转让、联合生产销售。公司致力于充分发挥科研开发、技术创新能力，不断推进科研成果的产业化，从而实现创造生态文明的宗旨。公司目前的主要产品是生物水质净化剂和XXX系列生物肥，都是以高科技为基础的、符合绿色生态的生物产品。 公司拥有一批团结、务实、高效、具有很强开拓精神的领导集体，他们在对科技的理解和把握上，在市场开发、公司管理上，在产品研发、经营销售、公共关系等方面具有高超的知识和丰富的经验，他们的坚强领导确保了公司的长远发展。 XXX系列生物肥是公司成立后首先完成中试、形成生产规模的获国家发明专利的产品。该产品共计投入研制费用120万元，现已实现了产业化，每年可实现“原菌液”产值500万元，利润250万元。目前可满足10家以上大型肥料生产厂的生产需要，生产XXX生物肥100万吨以上。公司采用联合生产的合作方式，即公司提供原菌液、专用肥配方、成套设备清单并负责技术指导和协调市场销售。目前在东北已有四家XXX生物肥厂生产专利产品“XXX牌系列生物”，设计生产能力8万吨，推广面积200万亩。 该公司微生物净水剂项目是国家农业部“948”计划项目，公司共投入研制经费150万元，其中75万元来源于国家无偿提供的科技型中小企业技术创新基金，40万元来源于地方政府无偿提供的配套资金，公司自筹35万元。现阶段该项目已完成室外池塘养殖初试，并已开始后续研发和中试。预计2002年5月中试结束，2002年7月之前确定产业化建设方案。为了完成中试，实现进一步产业化推广，需要继续投入160万元。目前公司总资产300万元，流动资金60万元，资金缺口100万元需要进行融资。

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

汉恒生物-micorRNA研究整体策略

microRNA整体解决方案汉恒Th物技术服务手册

microRNA研究总体策略 功能模型芯片筛选 芯片结果的QPCR验证 过表达和抑制miRNA实验及功能分析 靶基因Th物信息学预测及内源性分析 靶标蛋白的内源性和外源性验证 3’UTR靶标回复实验（rescue实验） 研究实例 8

选用有功能差异对比的样本，进行mir 芯片筛选 （mir-array ），筛选出变化明显的mir 。 现在主流的芯片平台是 Agilent 和Affymetrix ， Agilent 只检出成熟体，而 Affy 的芯片前体和成熟体 皆 检出，假阳性率较高， 但 Affy 的容量相比 Agilent 的 大很多。 汉恒Th 物（Hanbio ） 提 供Agilent 和 Affymetrix 平 台的 mirarray 筛选服务及后 续 的芯片数据分析及靶基因 聚类分析。 mir 进行 QPCR 验证，挑选出丰度高且变化显著的mir （以下简称mir- X ）。 Mir 的QPCR 验证最首选的当然是Life 的Taqman 系列探针和kit 权威，但价格极其昂贵。与之相比，特定引物SYBR 法检测mir 价 格适中，但误差率较高。 1

汉恒Th物（Hanbio）特有一步反转技术，特异性好，简单易用。汉恒已开发出针对不同种属mir的miRNA快速检测技术 MiRQeasy，与市面一般的mir引物相比，信号更单一，且操作极其简便。汉恒独有MiRTeasy一步法反转录试剂，一次性转录，兼顾了专一性和通用性。 过表达和封闭miRNA实验及功能验证 原则： 与mir变化相反的处理是否取缔功能表型的变化，而同向mir变化处理是否能模拟出功能表型变化。比如我们发现mir-X在细胞某种诱导分化后升高，则诱导时取缔这种升高是否会抑制分化，而单单升高该mir 能否模拟出细胞分化表型。 1）初筛选： 选取出若干芯片与QPCR验证变化一致，且组织表达丰度较高的Mir，运用Mimics（过表达）和inhibitor（封闭）分别在 细胞中过表达和封闭特定的mir，观察细胞功能的变化。 注：Mimics和inhibitor表达时程很短，一般72-96小时，所以一般只作为初筛。 2）m i r与A n t i-m i r的克隆高表达：Mir过表达：从miRbase上调出pri-mir序列，直接克隆pri- mir至表达载体。

中国生物技术股份有限公司简介

中国生物技术股份有限公司简介 中国生物技术股份有限公司（以下简称中生股份）隶属于中国医药集团总公司，下辖北京、长春、成都、兰州、上海、武汉六个生物制品研究所以及北京天坛生物制品股份有限公司，是我国历史最为悠久的从事疫苗和血液制品研究及生产的专业机构，是集科研开发、生产、经营为一体的中国最大的生物技术企业集团。目前，集团资产总额85.5亿元，主营业务年销售收入超过50亿元，是全球第四大疫苗生产商。 中生股份的发展史代表了中国生物制品发展史，先后研制生产了中国最早的牛痘、霍乱、伤寒、狂犬病疫苗及白喉抗毒素等制品，分离出中国第一株青霉素菌种。新中国成立以来，中生股份所属各生物制品研究所一直承担着预防、控制、消灭传染病用生物制品的生产供应任务，为中国消灭天花，消除脊髓灰质炎本土病例，控制麻疹、白喉、百日咳、流行性乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、乙型肝炎流行等传染病的流行做出了重大贡献。 中生股份拥有强大的产业化能力，在六大主要城市建有生产基地，拥有近百条符合GMP标准的生产线，可生产各类预防、治疗、诊断用生物医药产品200多种，其中国家一、二类新药24种，在中国可以生产的预防26种病毒和细菌感染的41种疫苗中，我们可生产预防24种病毒和细菌感染的34种疫苗。是全国疫苗、血液制品生产品种最多、产量最大的生物制品生产企业。

中生股份尽全力为国家免疫规划服务，承担了80%以上的国家免疫规划用疫苗的生产任务。同时，充分发挥科技优势，致力于重大疫情防控制品的研究、生产与装备技术升级，在抗击“非典”、抗震救灾和应对全球蔓延的甲型H1N1流感疫情做出了重要贡献。 中生股份科研实力雄厚，拥有一批包括中国工程院院士在内的生物技术专家团队，有国家食品药品监督管理局新药审评专家70多名，国家自然科学基金委员会评议专家10多名，享受国家政府津贴专家170多名。中生股份还是国家第一批博士、硕士研究生学位授予单位，拥有1个博士点、5个硕士点、5个博士后工作站，1989年－2010年累计培养硕士研究生632人，博士研究生47人。 中生股份科研成果丰硕，承担国家863计划、“十一五”科技支撑计划等多项重点项目，有十余项研究项目填补国内空白，多项成果拥有自主知识产权，有26项成果获国家科技进步奖一、二等奖，180余项获省部级奖励。2008年，被国家科技部、国务院国资委、中华全国总工会命名为国家首批“创新型企业”。 中国生物技术股份有限公司服务说明 (一).供货及运输要求 1、采购周期：按采购人计划。 2、供货时间：合同签订后分批交货，具体供货数量、时间要按照合同或采购人的要求。

生物技术有限公司商业计划书范文

生物技术有限公司商业计划书范文 摘要 大连xxx生物技术有限公司属技术开发导向型企业，主要致力 于生物菌剂、生物农药、生物有机肥和生物水质净化剂等产品的研制、开发、技术转让、联合生产销售。公司致力于充分发挥科研开发、技术创新能力，不断推进科研成果的产业化，从而实现创造生态文明的宗旨。公司目前的主要产品是生物水质净化剂和xxx系列生物肥，都是以高科技为基础的、符合绿色生态的生物产品。 公司拥有一批团结、务实、高效、具有很强开拓精神的领导集体，他们在对科技的理解和把握上，在市场开发、公司管理上，在产品研发、经营销售、公共关系等方面具有高超的知识和丰富的经验，他们的坚强领导确保了公司的长远发展。 第一章公司介绍 一、公司概述 大连xxx生物技术有限公司于2000年2月经大连高新技术产业园区工商行政管理局核准，在大连国家高新技术产业园区注册成立。企业登记类型为有限责任公司，注册资本为50万元。本公司是依托 北京大学技术物理系、中科院微生物肥料研究所、大连水产学院养殖系、大连轻工学院生物工程系等科研院所而组建起来的高新技术企业，是集科研、开发、生产经营于一体的实业公司，有国内著名的生物、水产、土肥、化工等方面的专家顾问组为企业的技术后盾，专门从事

生物领域高新技术项目的研制开发和生产。公司现有人员36人，其 中专业技术人员32人，占员工总数的88.9%。 二、公司成立的背景 农业是国民经济的基础产业，农业的发展情况关系到国民经济 的全局，同时，农业生产周期性长，受客观环境 * 比较大，因此国 家对农业的发展非常重视，对从事农业科技研究、开发、生产经营等公司的审查和批准往往也要经历一个较长的过程。大连xxx生物技术有限公司正式注册成立之前，早在1997年就开始从事相关农业科技 等方面的研究和开发工作。 高附加值农业、水产养殖业是大连地区、辽东半岛最重要的农业、渔业发展方向。长期以来，化肥的使用使土壤酸化、板结、肥力下降，对农业生产产生了不利 * ，在这种情况下，在正式注册成立 之前，公司就与北京大学合作开发了xxx系列生物肥，此产品的问世为解决上述问题提供了一条有效的渠道。同时，由于近海水质的不断恶化致使水产养殖业损失巨大，因此，公司研究人员在大连水产学院研究成果的基础上，开发出了一种绿色生物制品——生物水质净化剂。xxx生物肥、生物水质净化剂的研制开发、生产、使用对农、渔业的发展具有深远的意义，这些项目也有着巨大的市场前景。在这一背景下，大连xxx生物技术有限公司于2000年2月成立了。 三、公司的经营方针和发展战略 公司的经营方针和发展战略为：依托科研机构，集中专家智慧，开发绿色工程，造福人类社会;内引外联，建设跨国集团，强强合作，

westernblot详细图解详细版.docx

Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

汉恒生物实例分享-一步法构建同源重组载体

一步法构建同源重组载体 王海艳 （中国农业大学） 同源重组载体构建需要分别克隆目的片段两端的同源臂（长度~1kb），并与Marker基因进行连接。传统的构建方法是两段同源臂分别克隆构建到目的载体，费时费力。在本例中，本人已经成功应用汉恒生物科技（上海）有限公司的HB-Infusion TM无缝克隆试剂盒，将同源臂及Marker基因一步成功构建到载体上，现将实验过程及结果分享如下： 1. 目的片段引物的设计 用NEBbuilder（https://https://www.wendangku.net/doc/a83695850.html,/watch?v=8_-t5xtJ3y8），或snapgene，genomecompiler等软件，将三个目的片段的基因序列、线性化载体的基因序列按照软件使用说明依次填入，将自动生成所需要的引物序列（如下表）。将引物提交华大基因进行合成。 引物序列列表 2. 目的片段的扩增 反应体系 DNA(248ng/uL) 1uL Forward Primer (10uM) 2uL Reverse Primer(10uM) 2uL

ExTaq premix 25uL DDW 20uL Total 50uL （注：此步反应中的酶最好用高保真酶，以免产物出现错配）PCR反应程序 95℃4min 95℃30s 65℃30s 72℃1~2.5min 72℃10min 将扩增到的PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收并用Nanodrop 测量核酸浓度。 图1. 三个目的片段凝胶电泳结果 3. 载体的线性化 酶切： Plasmid 2ug 34cycles

SacI 2uL XbaI 2uL 10×M buffer 5uL DDW39uL Total 50uL 37℃酶切4h后，用1%凝胶电泳进行分析，并用Axygen凝胶回收试剂盒进行胶回收。 图2. 载体酶切及胶回收实验结果 A：质粒；B：质粒酶切产物；C：目的片段胶回收产物。 4. 冰上融化并且充分混匀HB-infusion TM Master mix，配制反应体系 将各个片段按照说明书的要求计算用量并配制反应体系，如下表所示： 片段 碱基对数 （bp）浓度 （ng/uL) OD260/280 所需mol数 所需质量 （ng） 所需体积 (uL) 3'-flank 1000 129.5 1.84 0.2 130.00 1.00 5’-flank 1000 141.4 1.89 0.2 130.00 0.92 Marker fragment 2518 184.9 1.88 0.2 327.34 1.77 Lineared vector 2875 95.2 1.85 0.1 186.88 1.96 HB-infusion MIX 10 DDW 4.34 Total 20