流式细胞仪培训手册

BD FACSCalibur流式细胞仪

FACS101 Handbook

本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。

如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。

如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载。

一、BD FACSCalibur基本结构

仪器本体：

1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。

2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射

以BD FACSCalibur 基本型为例

FSC Diode 只收488 nm波长散射光

SSC PMT 只收488 nm波长散射光

FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）

FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）

FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）

3. 仪器面板：

仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。

流速控制：

LO：样品流速：12 l /min

MED：样品流速：35 l /min

HI: 样品流速：60 l /min

功能控制：

RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿

色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。）

STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率

自动降低。

PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲

入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器恢

复STANDBY状态。

4. 储液箱抽屉：

在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤

器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之

位置。

鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3

小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖

上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。

废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪

器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。

鞘液过滤器：m过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净

的。

气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘

液筒添加鞘液时，需要减压。

空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。

5. 上样品区：

上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 Sample

Injection Tube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 Tube Support Arm、和

液滴存留系统 Droplet Containment System。

进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套

管，是液滴保留系统的一部分。

支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：

位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。

液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。

Macintosh计算机与打印机：

准备您的细胞样品

1.理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/m l一般实验只需 ml的样品。

2.细胞样品务必放至BD FALCON 352052 试管中，否则无法上机。

3.上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞可使用附滤网BD FALCON

试管 (Cat. 或35-55 m的尼龙筛网。

4.供流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原

荧光染色的方法大致有两种：直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本

公司网站下载染色方法bdb/

直接免疫荧光染色

Lysed - No - Wash Procedure

Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27

Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure

Leukemia and Lymphoma Procedure 1

Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay

间接免疫荧光染色

滴定抗体浓度

常用试剂

5.如因特殊因素无法下载上述实验方法，请e-mail：或。

二、开机、关机标准操作

FACS Calibur 开机

1.开启细胞仪电源。

2.开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。

3.开启计算机。

4.确认鞘流液筒有八分满的FACS Flow，确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。

5.将废液倒掉，并在废液筒中加入200 ml 家用漂白水 (废液筒容量为4L)。

6.将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。

7.排除液流管路与过滤器中的气泡。

8.取下样品管，执行 PRIME 功能两次。

9.使用1ml PBS，HIGH RUN 两分钟。

10.可开始分析样品。

FACS Calibur 关机

关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。

1.将样品支持架左移，取 2 ml FACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器的真

空系统抽取约 1 ml 的液体。

2.将样品支持架回正，按 HI RUN，然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。

3.按 Standby，取下样品管，执行 PRIME功能两次。

4.取 2 ml dH2O，重复上述步骤1-3。

5.注意最后只留约1 ml dH2O 在试管中。

6.按 STANDBY 五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护

雷射光源。）

7.倒掉废液，并回填 200 ml漂白水。

8.将减压阀放在「VENT 漏气」位置。将鞘流液筒充填至八分满。

9.退出软件“File”“Quit”(如有对话选项，选择“Don‘t save”)。确认退出

计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。

10.关闭计算机。“Special”“Shutdown”。

三、上机分析流程

建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。

（1）Negative Control（不加任何抗体）。

（2）CD3-FITC（FL1 单染）。

（3）CD19-PE（FL2 单染）。

（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。

Calibur 开机

1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。 *秘技1：如顺序相反，仪器和计算机之间无

法建立正常通讯，无法执行“connect to cytometer”。解决之道，两者都关

机、然后以正确方式重开。

2. 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向

调在VENT位置（箭头方向）。

3. 仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。 *秘技2：将减压阀方向调

在加压（向前）位置。减压阀如在VENT（箭头方向）位置，按RUN功能键时

将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检查是否失压），正常为绿色显示。

开启CellQuest 软件、编辑实验文件

4.在苹果菜单下点击CELLQuest 启动软件。桌面会出现一’Untitled’ 实验文

件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。

5. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大

小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框。

6. 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition (收取) ，确认

X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击

Multicolor Gating（收取样品时，门内细胞将出现颜色）。点击OK。此时实

验文件会出现FSC/SSC散点图。

7. 说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显

示两个独立参数的相互关系。在图中，横坐标X轴为为荧光1强度的相对值，

单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用

者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设

为FSC-H 1024、SSC-H 1024；第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、

FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：

细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，

FL3：PerCP红色荧光）。

8. 从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，

在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024，Y轴：FL2-H 1024。点击OK，

FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。

9. 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它

设定在（x，y）＝（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。

建立仪器和计算机之间通讯

10. 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer，此时会出现Acquisition

Control 对话方框。如果无法选择Connect to Cytometer，参考秘技 #1。如

果没见到Acquisition Control 对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择

Show Acquisition Control。

仪器设置文件

注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件

（Instrument settings），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值

（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps -- Threshold -- Compensation。

11. 检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现

Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN

（线性放大），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。

12.从Cytometer菜单中选择Threshold，出现 Threshold 窗口在Threshold 窗

口：确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。

13. 从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其

拖至空白区。

上样品、设置仪器

14. 使仪器处于High RUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认

Acquisition Control 窗口中 Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据)，点击

Acquire。

调节FSC/SSC探测器（电压）

15. 观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00，可调节 Amp Gain

从—使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小

细胞，将FSC电压设置于E01）。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。

调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其

它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Acquisition Control 窗口

中的Pause。

Gating 圈选

细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射与侧方散射的二维位图，即散射光图谱（Scatter Plot），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。

16. 在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域

（如下图）。分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates → Region

list，以鼠标点选R1，再按Delete键删除R1区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。

17. 选取希望Gate的FL1/FL2散点图，从Plots菜单中选择Format dot plot。在出

现的对话方框内，将No Gate 改选 G1=R1。点击OK。

调节FL1、FL2的探测器（电压）

18. 点击Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中调节

FL1、FL2的电压，使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之

100--101处。

19. 在Threshold 窗口，适当地提高FSC阈值>52，以去除碎片或低阶噪音。唯需注

意不要切掉主要细胞族群。

20. 点击Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去阴性对照管，关闭

Detector/Amps、Threshold窗口，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。

调节荧光补偿

说明：最适化的最后一步是调节光谱重迭。（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是2色样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿）。

21. High RUN，换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中的

Acquire。调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。补偿

调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕，点击Acquisition

Control窗口中的Pause。

22. 移去单染CD3，换上单染CD19-PE管。点击Acquisition Control窗口中的

Restart。调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。

23. 最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击Acquisition Control窗口中的

Restart，确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时，点击

Acquisition Control窗口中的Pause、Abort。

24.移去样本管，换上dH2O管，让仪器暂且处于Standby状态。关闭

Compensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。

收集实验数据

决定储存细胞总数

25. 预设之「储存细胞总数」为10000。如需修改，从Acquire菜单中选择

Acquisition & Storage，并在出现的窗口功，确认「Collection Criteria」从

10000 of All，再点击OK。

26.找个档案匣准备储存数据。从Acquire 菜单中选择Parameter Description，

出现Parameter Description对话方框。点击Folder，并在随后出现之对话方

框，选择「Your Folder」或新建活页夹，点击此对话方框的Select ’Your

Folder’。

27. 命名即将储存之文件名：点击Parameter Description对话方框的File，出现

文件名编辑窗口。在Custom Prefix中：输入文件名，点击此对话方框的

OK。日期为最常用之文件名系统。

28. Optional：如有需要，可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。如

P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。输入参数名会存入实验档案

中，显示在图谱上。

计数器Counters

29. 从Acquire 菜单中选择Counters. 窗口会显示样品分析速率、与总数进度。收集实验数据

30. 你可以开始收集实验数据了。HIGH RUN，将第一管样品放到检测区，在

Acquisition Control窗口中，将 Setup 改成 Setup，此时CellQuest会自动

显示 Your Folder：为资料文件名。点击“Acquire” 便可启动样品之分析测

定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件，并会以

“嘟”声告知，CellQuest会自动升幂附加档名成。等待下一指示。

31. 你可以换上下一管样品，点击“Acquire” 启动样品之分析测定与数据储存。

可继续分析直到所有检品都分析完毕。

实验数据之储存与备份：

32. 不建议长期使用硬盘储存数据数据，可考虑以烧光盘（如配有 CD-RW）、口

袋硬盘（Flash Drive）来备份大量实验数据，以免占用原有硬盘的内存，影响

数据处理速度。可将备份后之数据，拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机

分析。

33. 确认所有档案皆己备份后，以鼠标圈选欲删除数据，将其拖拉至Trash筒。退出软件

34. 检品分析完毕后，记得从屏幕上方File指令栏选择Save As，储存实验文

件，以备日后使用，不需每次重新编辑。

35. 从屏幕上方Cytometer 指令栏，选择Instrument Setting，出现Instrument

Setting窗口。点系print打印此次实验条件，可贴入实验笔记留底，再点击

Save以储存此一实验的仪器条件，供日后再使用。点系SAVE后会出现文件保

存对话方框，选择文件目录及文件名（例：Your Folder：/Your Setting1），

点击Save。点击Done。

36. 检品分析完毕后，用鼠标从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取Disconnect to

Cytometer 以断绝计算机与仪器间之联机。之后如不分析数据，您可退出软件

“File”“Quit”(遇有选项永远选择“Don‘t save”)，进行关机程序。

管路清洗

37. 以2 ml 10％漂白水取代样品，将样品架置于左位以外管吸除约1 ml，再将样

品架置于中位 HI RUN 十分钟。改用 2 ml DI water。重复上述程序，样品架

上留约1 ml DI water。按STANDBY五分钟。

关主机、关计算机

四、数据分析

FCS list mode数据文件：

说明：FCS list mode数据文件是流式细胞仪的标准格式档案（）。该文件含有从流式细胞仪收取的平均10,000个细胞数的资料，含有4~6个参数。一般软件无法打开list mode数据文件，需藉助如CellQuest, WinList, WinMDI, 等Flow 分析软件，才可开启、绘图、并进行分析统计。

开启一CellQuest实验文件

1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一’Untitled’ 实验文件，可点击

实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。

散点图之统计分析（双色）

2. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，然后拖动对角线至适当大

小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot对话框。

3. 在Dot Plot方框中，Plot Source应预设为Analysis，可点击 Select File 钮，并

用随后之方框来开启预存之 Sample Files，它们的路径位于Mac HD：BD

Applications：CellQuest Folder：Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录，找到档案后，点击 Open来开启 NORM001 档案。X 与 Y 参数项会出现默认值—FSC-H 256 与 SSC-H 256，在Color方框中点击Multicolor Gating，确认无误之后，点击 OK 便完成了一个 NORM001 的 FSC /SSC散点图。

4. 工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor 移至FSC/SSC散点图上，并沿着淋巴球

聚落周边画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域的界定，我们将

以此区域来圈选淋巴细胞。(如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates →

Region list，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)

5. 从Plots菜单中选择Dot Plot可复制一个同样大小的散点图，屏幕上会出现一

Dot Plot 对话方框。点击X Parameter 钮来显示 NORM001 档案中所有的参数

项 (FSC, SSC, FL1, FL2) 将 X 参数项改成「FL1-H 256 Gamma-1」，Y 参数项改成「FL2-H 256 Gamma-2」。从Gate输入栏中将 NoGate 改成G1= R1。

6. 点击 OK 便完成了一个以 G1 圈选的 FL1/ FL2 散点图，可将复制图移至原图右

方。NORM001 档案为本组实验之阴性对照组，我们将以之来界定阴性与阳性之

界限。

7. 从屏幕左列工具板中，选取 Quadrant Marker 工具，然后在 FL1/ FL2 散点图中

心处点击并拖曳至定点，一般而言是紧挨着阴性细胞聚落。

8. FL1/ FL2 二维散点图现在被区隔出四个象限，欲计算各象线中细胞的数据数据，从

屏幕上方Stats菜单中选择Quadrant Stats。可以得到该图之四象限统计结果。

UL：左上象限，UR：右上象限，LL：左下象限，LR：右下象限

打印报告、输出统计数值

9.从屏幕上方File菜单中选择Print One，可以打印工作中实验文件。

10. 点选四象限统计表，从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数

值至Excel档案。在出现方框中命名档案，并决定欲存放档案匣，点击Save。

开启其它List Mode Data

11.如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文

件中所有图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择

Next Data File，软件会自动以新档案来替换现有档案，您只要确认圈选范围、与Quadrant Marker 的位置是否恰当，即可打印报告、或输出统计数值。

12. 对于存在不同档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有

图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Change

Data Files，并在随后出现之对话方框，选择所在新目录与欲分析档案。点击

OPEN。可调整圈选区域，Quadrant Marker阴阳界限，软件会重新计算、统计

报告。

13. 常规使用之实验文件 (内含散点图、圈选区格、四象限分界、以及统计报告)，我

们建议您将它另存新档 File – Save As，以备后需，分析其它档案便轻而易举。直方图之统计分析（单色）

1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一’Untitled’实验文件，可点击

实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。

2. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，然后拖曳对角线至适当大

小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot对话框。

3. 在Dot Plot方框中，Plot Source应预设为Analysis，可点击 Select File 钮，并用

随后之方框来开启预存之 Sample Files，它们的路径位于Mac HD：BD

Applications：CellQuest Folder：Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录，找到档案后，点击 Open来开启 NORM001 档案。X 与 Y 参数项会出现默认值—FSC-H 256 与 SSC-H 256，在Color方框中点击Multicolor Gating，确认无误之后，点击 OK 便完成了一个 NORM001 的 FSC /SSC散点图。

4. 工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor 移至FSC/SSC散点图上，并沿着淋巴球聚

落周边画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域的界定，我们将以

此区域来圈选淋巴细胞。(如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates →

Region list，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)

5. 从Plots菜单中选择Histogram，屏幕上会出现一 Histogram 对话方框。点击

Select File 钮，再点击 Open来开启 NORM001 档案。

说明：直方图（Histogram）表明一个参数与细胞数量之间的关系，在图中，横坐标X轴为荧光或光散射强度的相对值，单位是道数（channel number），纵坐标Y轴则通常表示细胞出现的频率，即相对细胞数。

6. 点击 Parameter 钮来显示 NORM001 档案中所有的参数项，将参数项改成「FL2-

H 256 Gamma-2」。从Gate输入栏中将 No Gate 改成G1= R1，点击 OK 便完

成了一个以G1圈选的 FL2直方图，图形的 X 轴为橙黄色荧光强度，Y 轴为细胞频率，NORM001 档案为本组实验之阴性对照组，我们将以之来界定阴性与阳性之界限。

7. 从屏幕左列工具板中，选取 Histogram Marker 工具，然后在图的左缘处点击并拖

曳至定点，一般而言是阴性信号的右缘。放开鼠标后即完成Marker 1(M1)。重复前述步骤以增画另一Marker，一般而言 M2 始自 M1 的右缘，终于图的右界。

8. FL2 直方图现在被区隔出两个区域，欲计算各区域中细胞的数据数据，可从 Stats

指令栏中选择 Histogram Stats。

打印报告、输出统计数值

9.从屏幕上方File菜单中选择Print One，可以打印工作中实验文件。

10. 点选四象限统计表，从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数

值至Excel档案。在出现方框中命名档案，并决定欲存放档案匣，点击Save。

开启其它List Mode Data

11. 如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文

件中所有图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择

Next Data File，软件会自动以新档案来替换现有档案，您只要确认圈选范围、与Quadrant Marker 的位置是否恰当，即可打印报告、或输出统计数值。

12. 对于存在不同档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有

图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Change

Data Files，并在随后出现之对话方框，选择所在新目录与欲分析档案。点击

OPEN。可调整圈选区域，Markers界限，软件会重新计算、统计报告。

13. 常规使用之实验文件 (内含散点图、圈选区格、四象限分界、以及统计报告) ，我

们建议您将它另存新档 File – Save As，以备后需，分析其它档案便轻而易举。

五、错误信号、疑难排除

仪器状态（Status）：

在CELLQuest菜单位于Cytometer菜单中。用来在收取的任何时候查看流式细胞仪的运行状态，以利解决仪器运行中出现的问题。

状态：显示仪器运行模式

Not Ready：激光器正在预热、鞘液桶空、废液桶满。

Ready：样本管放置在进样区，且支撑臂位于中位，样本管加压，仪器在RUN 状态。

Standby：仪器在Standby 状态、或仪器在Run 状态而无样本管在进样区

上、或支撑架位于侧位、或样本管未完全加压。Standby时仪器的雷

射电源降低。

常见故障排除程序

样品试管上不去

误用不适合的试管。（请用BD Falcon 352052）

试管支持架需调整。旋转调整试管支持架（顺时钟向下、逆时钟向上）。

Bal Seal 磨损。（汰换 Bal seal）

仪器处于N0T READY状况

检查以下情况：

鞘液筒中的鞘液是否用完。

废液筒中的废液是否已装满。

开机需要5分钟时间预热。

鞘液筒的液面检测器连接是否松动、或未连接。

仪器处于STANDBY状况（仪器失压）

如果仪器未加压，上样管放好后，虽然控制面板处于RUN模式，但仪器仍未能达到READY状况，此时仪器仍处于STANDBY状况。这可能是由于鞘液筒盖漏气、压力阀未加压，样本管不能被加压等原因造成的压力问题。此时，样本不能良好地进入流动室，无法检测。

此时，检查以下情况：

压力阀未加压。

鞘液筒是否漏气（盖紧鞘液筒盖）。

样本管是否有破损。

上样针上的Bal seal是否己磨损。

鞘液筒上的蓝色接头是否连接好。

仪器讯号噪声过高

鞘液过滤器中有气泡，仪器记录了气泡产生的信号，造成了噪声数据的干扰。气泡还可以改变样本流，造成检测结果不理想；此时，仪器需要做PRIME，排除液路中的气泡干扰。如果鞘液筒吸干了，应该重新装满鞘液，然后先取下样品管进行5-10次PRIME，再换上3ml dH2O上样管HI RUN 30分钟，待鞘液流中的气泡排除之后，再进行样本测定。

计算机屏幕上见不到细胞显示

检查以下情况：

如果仪器一直处于STANDBY状态，则检查System Status。

如果STATUS窗日显示READY，则检查样本管中细胞浓度是否够，上样前

是否混匀了。

检查实验的Instrument Settings是否正确。

检查阈值是否设置过高，导致无法检测目标细胞群。

检查CELLQuest软件Cytometer目录下的Status窗口，是否己被更新。如果未更新，说明仪器与计算机之间的通讯发生了故障，此时，应关闭计算机

和FACSCalibur，重新打开仪器，继续实验。

PRIME仪器液流，去除流动室中可能存在的气泡。若流动室中存在气泡，可能使样本流的位置偏离激光束，导致无细胞信号。

加样针有鞘液反流

检查以下情况：

检查上样针外管是否安好，可以将外管旋下，向上推动，重新拧紧。

更换上样针上部的O型胶环。

检查液流保存系统的真空帮浦是否工作。如果样本管支撑架位于旁位时，听不到真空帮浦的工作声音，可能是真空帮浦停了，关闭FACSCalibur，再启动；移开支撑架时，如果马达仍然不动，请致电BD客户服务部门寻求帮

助。

实验文件1：2 Color ACQ

一、流式细胞仪技术参数

一、流式细胞仪技术参数 1 工作条件： 1.1 电源要求: 220V (±10%)、50-60HZ 1.2 环境温度:16-30℃ 1.3 湿度：20-80% 2 用途：免疫分析、淋巴细胞亚群分析；细胞周期分析、凋亡分析；感染分析、肿瘤细胞分析；多重细胞因子分析等。 3 技术规格和参数 3.1 激发系统： 3.1.1 激发光源：405nm紫色固态激光器、488nm蓝色固态激光器和640nm红色固态激光器，固定光路，空间立体激发。 3.1.2 激光塑形：自动的多棱镜塑形系统，光斑大小：9x65um椭圆形光斑 3.1.3 流动室规格：180x430μm 3.2 荧光收集和检测 3.2.1 光胶耦合物镜，数值孔径1.2，大面积收集发射荧光。 3.2.2 每一激发激光对应一个独立检测单元，光胶耦合物镜自动分开汇集每一激光激发的发射荧光进入相对应检测单元，避免光谱交叉。 *3.2.3 配备1个独立八角型全反射检测系统、2个独立三角型全反射检测系统 3.2.4 光学检测系统内部采用全反射检测光路系统，荧光信号到达检测器只经过一个长通滤光片，信号能量损失最小。 3.2.5 检测系统依次优先检测易衰减的长波长信号，保证弱信号灵敏度。 *3.2.6 共计12个信号检测器，包括10个光电倍增和和2个散射光探测器。 3.2.7 荧光通道组合：405nm紫色激光器对应3个检测通道，滤光片包

括450/50nm、 525/50nm、 605/40 nm；488nm蓝色激光器对应4个检测通道滤光片包括530/30nm、 575/25nm、695/40nm、780/60 nm； 640nm 红色激光器对应3个检测通道，检测滤光片包括：670/30nm、712/21nm、780/60 nm。通道之间最低光谱交叉，滤光片带有智能芯片，直接插拔，自动识别。 *3.2.8 荧光检测灵敏: FITC<100MESF，PE<50MESF(提供英文原版参数)；CFDA检测结果FITC<5MESF，PE<5MESF（提供检测报告）。 *3.3 样本分析速率：>32,000个细胞/秒(提供英文原版参数)。 3.4 变异系数：全峰宽CV<3% *3.5 采用正压上样系统，非注射泵或蠕动泵。样本残留量<0.2%。 3.6 最小样本量：≤30ul 3.7 检测颗粒大小：0.5-50μm 3.8 数字信号处理：18bit动态范围，符合IEEE 32bit浮点分辨率。3.9 脉冲处理系统:能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度,可区分多倍体细胞、粘连细胞。 3.10 可溶性蛋白分析：具备多重可溶性蛋白分析功能，包括：细胞因子、炎症因子、趋化因子等；可达单管数十重分析，包括：多重定量及动力学分析。 *3.11 液流车：独立液流车，避免振动影响仪器主机光路和液流；自动控制所有压力、鞘液、清洗液等，大体积液体储备保证长时间、稳定工作；鞘液桶20L，废液桶10L，清洗液桶5L，关机液桶5L。开关机自动清洗液路，正常状态鞘液消耗<1.10 L/h，待机状态鞘液消耗<1 mL/h。 3.12 配置淋巴细胞亚群自动分析软件，无需手动设置，实现淋巴细胞亚群分型的全自动化。 3.13 主软件：Windows系统，原版专业化流式数据收集及处理软件, 可按用户需求设置条件进行数据分析和报告。 3.14 临床自动软件：标配临床自动软件，拥有具CFDA认证的4色及6

【基础科学】BD FACSCALIBUR流式细胞仪操作手册(共27页)

BD FACSCalibur流式细胞仪 FACS101 Handbook 本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。 如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。 如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载。 一、BD FACSCalibur基本结构 1.1仪器本体： 1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。 2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射 以BD FACSCalibur 基本型为例 ?FSC Diode 只收488 nm波长散射光 ?SSC PMT 只收488 nm波长散射光 ?FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） ?FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） ?FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）

3. 仪器面板： 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制： LO：样品流速：12 μl /min MED：样品流速：35 μl /min HI: 样品流速：60 μl /min 功能控制： ?RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） ?STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 ?PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器 恢复STANDBY状态。 4. 储液箱抽屉： 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。

流式细胞仪细胞分选的操作步骤

细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞

BD流式细胞仪原理与典型故障分析

Instrumentation and Equipments 仪器与设备, 2018, 6(3), 95-98 Published Online September 2018 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/a88185626.html,/journal/iae https://https://www.wendangku.net/doc/a88185626.html,/10.12677/iae.2018.63015 BD Flow Cytometer Principle and Typical Malfunction Analysis Xiusheng Qiu*, Caihui Zeng, Liting Zhang The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou Guangdong Received: Aug. 23rd, 2018; accepted: Sep. 11th, 2018; published: Sep. 18th, 2018 Abstract Flow cytometry is a device for automatic cell analysis and cell separation. In this paper, the prin-ciple of BD flow cytometry is introduced, and the common faults of flow cytometry are described. After analysis, the troubleshooting process is described in detail. Flow cytometry instrument equipment failure can be divided into liquid road faults, hardware failure, software failure, and all three cases. Only by accumulating in use can we fast judge the fault, and quickly solve the problem. Keywords Flow Cytometer, Principle, Malfunction Analysis BD流式细胞仪原理与典型故障分析 丘秀生*，曾彩辉，张丽婷 中山大学附属第三医院，广东广州 收稿日期：2018年8月23日；录用日期：2018年9月11日；发布日期：2018年9月18日 摘要 流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置，已经渐渐成为生物科学重要的分析仪器。本文介绍了BD流式细胞仪的原理，并对流式细胞仪常见的典型故障做了阐述，进行分析后，并对故障的排除过程进行了详细的阐述。流式细胞仪维中设备故障可分为液路故障、硬件故障、软件故障和三者兼具的情况，只有在使用过程中不断积累，才能快速判断故障，并迅速的排除。 *通讯作者。

流式细胞仪上机培训手册(仅供参照)

流式细胞仪上机操作培训手册 一、样本处理 以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例 1)取样。取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC； 2)编号。根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管： a)1号管：相应同型对照； b)2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管； 3)加样。用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记 好的流式管底部； 4)洗涤。加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min； 5)染色。弃上清，加入100 μl PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流 式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。） 6)洗涤。加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min； 7)重悬。弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测(可选择BD FACSCanto II或BD Accuri C6)。 （注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。）8）试验结果分析。（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。参考值：

二、上机检测 BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪 1 打开流式细胞仪电源 2 启动计算机，打开软件登录 3 确保软件连接到流式细胞仪 必要时，点击Cytometer > connect 检查液体水平 1 启动流式细胞仪后，检查液体水平 低液面水平或者废液桶满都用红色指示。

2 如果液流车未自动开启，选择Cytometer > Fluidics Startup。 3 当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。 检查气泡 1 在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。

流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 Annexin V 检测细胞凋亡

A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12?75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8?C保存。 3. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为 10?，使用时，用稀释为1?浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料： Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D） PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X） Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）PI（Cat. No. 66211E）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）7-AAD（Cat. No. 34321X） 6. FACS流式细胞仪：上样检测。 7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管： Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤 1.取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1?Binding Buffer缓冲液制成1?106 细胞/ml的悬液。 3.Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。 4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料： 1阴性对照-- 2单阳1 AV-FITC - 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（20?C ~25?C）避光处放置15分钟。

流式细胞仪操作规程

FACSCalibur流式细胞仪操作规程 一、编号：YQ0606 二、标题：FACSCalibur流式细胞仪操作规程 三、关键词：流式细胞仪操作规程 四、目的：保证流式细胞仪的安全及有效操作 五、背景知识：流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 六、原理 待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过A/D转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双

BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册

B D F A C S C a l i b u r流式细胞仪 FACS101Handbook 本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。 如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。 如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载。 一、BDFACSCalibur基本结构 1.1仪器本体： 1.电源开关：在BDFACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。 2.光学系统：BDFACSCalibur基本配有一支波长488nm的氩离子雷射 以BDFACSCalibur基本型为例 ?FSCDiode只收488nm波长散射光 ?SSCPMT只收488nm波长散射光 ?FL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545nm） ?FL2PMT荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606nm） ?FL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围（波长>650nm） 3.仪器面板： 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制： LO：样品流速：12?l/min MED：样品流速：35?l/min HI:样品流速：60?l/min

功能控制： ?RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） ?STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 ?PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME结束，仪器恢 复STANDBY状态。 4.储液箱抽屉： 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter，及空气滤网Airfilter。请注意气路减压阀VENTTOGGLE之位置。 ?鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖 上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。 ?废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。 ?鞘液过滤器：0.22?m过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。 ?气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。 ?空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。 5.上样品区： 上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 SampleInjectionTube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 TubeSupportArm、和液滴存留系统DropletContainmentSystem。 ?进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。 ?支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。 液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组 成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启 动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支 撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当 支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时， 让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到 STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到 流动室中。

性控冻精使用技术手册

第一部分性控技术和性控冻精的概况 一、性控技术的概念和在畜牧业生产中的重要意义 性别控制：通过人为的干预使雌性动物繁殖出人们所期望的性别后代的一种繁殖新技术。奶牛XY精子分离技术是指将公牛的精液根据精子自身X染色体和Y染色体的DNA含量不同，把这两种类型的精子通过物理方法、计算机技术等进行有效的分离，将X精子分装冷冻后，用于牛的人工授精，使母牛怀孕的技术，母牛率可以达到90％以上；根据精子自身X、Y染色体中DNA含量的不同而有效分离的冻精就叫性控冻精。从经济效益来讲，该技术的应用将直接为奶农带来更多的获得良种母牛机会，增加了奶农的收入。 其重要意义在于： 1、产母犊效益提高良种母犊出生数量，使良种奶牛的繁育数量呈几何速度增长，加速牛群改良和更新，迅速达到良种化规模养殖，增加规模效益。 2、充分利用现有优质种公牛和高产奶牛的遗传潜力母牛一生能产6～7胎，平均可以留下3头母牛，采用性控冻精使高产奶牛一生可以产6～7头优质母牛。 3、提高生产性能加速低产奶牛的改良步伐，迅速扩大良种奶牛群，产奶性能得到快速提升，产奶效益不断增加。 以上三点都说明在使用性控冻精后可以显著的提高奶牛养殖的经济效益，同时与胚胎工程技术的结合可以使奶牛的品种改良一步到位。 二、性控冻精在我国应用的重要性和在国内的应用及效果 由于我国奶牛的品种质量较差，平均单产达不到 3500公斤/头，远低于世界平均单产5500公斤/头的水平，更达不到以色列、美国等奶业发达国家奶牛单产的一半。因此从我国实际情况分析，全国各地对良种牛的需求量非常大。奶牛是单胎动物，自然状态下，一头母牛一年只能繁殖一胎，终生平均也只能提供3头左右的母牛后代。由于奶牛自然繁殖率低，繁殖速度慢，年增长速度仅为15%，使得国内现有高产、良种奶牛扩繁速度受到很大限制；若从国外大批引进良种奶牛不但成本高，而且受到国外牛源和国家检疫的限制；因此，高产纯种奶牛的缺乏成为目前我国奶业快速发展的主要瓶颈。奶牛XY精子分离技术是目前最先进、最经济的良种繁育技术，X精子分离纯度已达到90%以上，分离后受胎率和常规冻精相当；这样意味着如果得到一头良种母牛犊，采用传统的冻精配种，则需要4剂精液，花费二年的时间；而采用性控冻精，只需要2剂，花费一年的时间。XY精子分离技术不论从繁育的成本还是从良种扩繁速度上考虑，都是畜牧业良种繁殖改良技术上的一场革命。 该产品已经在全国22个省市进行了广泛的推广和使用，以可信的质量和受胎率、母牛率在同类产品中最好（下表为部分抽样统计结果）得到了各级政府部门和养殖户（场）的称赞和认可。

流式细胞仪入门手册

流式细胞仪入门 -----导航篇 二OOO年四月

目录 前言 第1章综述 第2章液流系统 第3章散射光信号及荧光信号 3.1 散射光信号 3.2 荧光信号 第4章光电系统 4.1 光平台 4.2 光学滤片 4.3 信号探测器 4.4 阀值 第5章数据分析 5.1 数据采集及显示 5.2 设门 5.3 细胞亚群的数据分析 5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选 6.1 分选 第7章激光器及光路校正 7.1 激光器的工作原理 7.2 光路校正 第8章答案

序论 学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。 本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。

第一章综述 流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。 流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下： 液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。 光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。 电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。 单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。

流式细胞仪临床应用手册

流式细胞仪临床应用手册 案场各岗位服务流程 销售大厅服务岗： 1、销售大厅服务岗岗位职责： 1)为来访客户提供全程的休息区域及饮品; 2)保持销售区域台面整洁; 3)及时补足销售大厅物资,如糖果或杂志等; 4)收集客户意见、建议及现场问题点； 2、销售大厅服务岗工作及服务流程 阶段工作及服务流程 班前阶段1）自检仪容仪表以饱满的精神面貌进入工作区域 2）检查使用工具及销售大厅物资情况，异常情况及时登记并报告上级。 班中工作程序服务 流程 行为 规范 迎接 指引 递阅 资料 上饮品 （糕点） 添加茶水工作1）眼神关注客人，当客人距3米距离侯客迎询问客户送客户

注意事项 15度鞠躬微笑问候：“您好！欢迎光临！”2）在客人前方1-2米距离领位，指引请客人向休息区，在客人入座后问客人对座位是否满意：“您好！请问坐这儿可以吗？”得到同意后为客人拉椅入座“好的，请入座！” 3）若客人无置业顾问陪同，可询问：请问您有专属的置业顾问吗？，为客人取阅项目资料，并礼貌的告知请客人稍等，置业顾问会很快过来介绍，同时请置业顾问关注该客人； 4）问候的起始语应为“先生-小姐-女士早上好，这里是XX销售中心，这边请”5）问候时间段为8:30-11:30 早上好11:30-14:30 中午好 14:30-18:00下午好 6）关注客人物品，如物品较多，则主动询问是否需要帮助（如拾到物品须两名人员在场方能打开，提示客人注意贵重物品）； 7）在满座位的情况下，须先向客人致

待； 阶段工作及服务流程 班中工作程序工作 要求 注意 事项 饮料（糕点服务） 1）在所有饮料（糕点）服务中必须使用 托盘； 2）所有饮料服务均已“对不起，打扰一 下，请问您需要什么饮品”为起始； 3）服务方向：从客人的右面服务； 4）当客人的饮料杯中只剩三分之一时， 必须询问客人是否需要再添一杯，在二 次服务中特别注意瓶口绝对不可以与 客人使用的杯子接触； 5）在客人再次需要饮料时必须更换杯 子； 下班程 序1）检查使用的工具及销售案场物资情况，异常情况及时记录并报告上级领导； 2）填写物资领用申请表并整理客户意见；3）参加班后总结会； 4）积极配合销售人员的接待工作，如果下班

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.

（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通

流式细胞仪临床应用手册

目录

第一部分流式细胞术简介 1流式细胞术定义 流式细胞仪是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器，为生物医学与临床检验学发展提供了最强有力的工具。 流式细胞分析技术(flowcytometry，FCM)又称流式细胞术，是20世纪70年代发展起来的一种快速、准确、客观的检测技术，它能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞或微球的多项物理及生物学特性--在极短的时间内高速分析上万个甚至是几十万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，对其加以定性定量分析，还可以对特定群体加以分选。目前，流式细胞术已经广泛用于临床应用与基础研究，在免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等医学与生命科学所有领域内发挥着重要的作用。 2流式细胞仪工作原理 制备成单细胞悬液的标本或单个微粒在上样前进行荧光染色。流式细胞仪检测到上样管后，产生一定的气体压力将待测样本压入流动池。同时鞘液（不含细胞或微粒的缓冲液）在仪器产生的高压作用下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与样本流形成一定的角度，形成一个圆形的鞘液流，包围着细胞或微粒高速流动，使待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，逐个地通过流式细胞仪的激光聚焦区（流动池），从而被检测到，并发出散射光及荧光等多种光学信号。光学信号通过光电信号转换器及电子信号处理系统采集及分析后，最后以图形的形式将数据结果显示在电脑屏幕上。 3流式细胞仪的主要结构 光学系统，液流系统，信号处理及放大系统，计算机系统。

4流式细胞仪检测信号 散射光信号：FSSS 荧光信号：FL1FL2FL3FL4… 5流式结果数据分析 6流式细胞仪检测样品 可用于流式细胞仪检测的样本种类多样，包括各种细胞（如外周血、骨髓、细针穿刺、灌洗液、实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等；血清、血浆、培养上清、细胞裂解液等。 如果检测样本为实体组织时，我们可以用物理化学（天然，机械研磨/消化）等方法将其制备成单细胞悬液5×105－1×107cells/ml ，并在上机前用300目筛网过滤。 7流式细胞仪检测范围 细胞结构 细胞功能 单参数直方图分析 双参数点图分析 双参数点图分析 双参数等高图分析 双参数密度图分析 三维图分析

8. Attune NxT流式细胞仪标准操作规程

Attune NxT流式细胞仪标准操作规程 一、启动Attune NxT流式细胞仪 1、依次打开电脑主机电源、显示器及仪器电源。电脑用户名为INSTR-ADMIN， 密码为INSTR-ADMIN（全部大写）。 2、双击Attune软件图标，用户名为admin，密码为password1（全部小写）。 3、检查仪器内四个液体容器，清空“waste”桶中的废液，确认“Focusing fluid”、 “Wash solution”和“Shutdown solution”三个桶中的液体量是否满足实验要求（液面较高）。 4、点击startup，等待机器启动，整个过程大约需要3分钟。仪器指示灯显示为 绿色，软件左下角出现绿色对勾即为启动完成。 5、点击performance test，在2mL鞘液中滴入3滴performance tracking beads， 混匀后上机，点击Run Performance test。Performance test每天运行1次。这个过程大约耗时3分钟。 二、检测样品 1、点击new experiment新建一个实验，选择tube或plate实验，输入实验名称， 采用默认的Workspace和仪器设置参数，输入Tube Groups和Tube Samples 的数量，点击OK。 2、双击软件右侧Experiment下的Compensation，在弹出的对话框中选择相应的 荧光通道，点击OK。 3、双击UC后上样，点击Run，并调节电压，电压调好后点击Record，依次将 每个单染色的样本上样，并点击Record记录其荧光信号。 4、荧光补偿调好之后双击sample，上样后点击Run即可得到样本的荧光信号。 根据需要建立散点图并建门。 三、关闭Attune NxT流式细胞仪 1、确认”wash solution”和”shutdown solution”桶中液面高度至少在桶高的一半以 上，清空“waste”桶。 2、点击shutdown，选择Quick、Standard或Full，样品管内加入3ml 10% bleach 液，点击next启动关机程序，此时请勿关闭软件或者终止shutdown过程，关

BD_FACSCalibur流式细胞仪操作手册

BD FACSCalibur流式细胞仪 一、BD FACSCalibur基本结构 1.1仪器本体： 1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。 2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射 以BD FACSCalibur 基本型为例 FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光 FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）

3. 仪器面板： 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制： LO：样品流速：12 μl /min MED：样品流速：35 μl /min HI: 样品流速：60 μl /min 功能控制： ?RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） ?STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 ?PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器 恢复STANDBY状态。 4. 储液箱抽屉： 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。

流式细胞仪操作方法

一、样品制备 1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells， 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)

流式细胞仪使用方法

流式细胞仪的使用方法及相关资料 仪器名称：流式细胞仪 生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法： 一．开机程序 1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。 2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。 4．如果需要打印，打开打印机电源。 5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。 6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。 7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。 做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。 二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。 2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。 3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。 三．用CELLQuest进行仪器的设定和调整 1．从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。 2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。3．从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1，2，3，4获得此四个对话框。 4．在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周