病证结合大鼠帕金森病模型构建初探_梁建庆
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病证结合大鼠帕金森病模型构建初探
梁建庆1，何建成2
（1甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 730000；2上海中医药大学基础医学院，上海 201203）
摘要：目的：建立一种稳定的、可操作性强的病证结合大鼠帕金森病（PD）模型，以满足研究药物对PD治疗评价的需求。方法：采用6-羟基多巴胺脑部立体注射法构建PD动物模型，同时设立正常对照组、假手术组、模型组、药物（复方地黄方）组，从病因、症状、客观指标、药物反证等方面对PD大鼠模型进行综合判断，验证该模型的中医证候属性。结果：模型组大鼠的神经行为学、氧化应激、TH mRNA及蛋白、阳性细胞等指标与正常对照组比较，差异均有统计学意义（P <0.01）。药物组可明显改善大鼠的主观症状和上述客观指标，差异有统计学意义（P <0.01）。结论：6-羟基多巴胺大鼠PD模型的中医证候属性是风阳内动证。
关键词：病证结合；动物模型；帕金森病；大鼠；复方地黄方
基金资助：国家自然科学基金面上项目（No.81573899）, 上海市科委新药开发研究项目（No.12401900302），甘肃省科技厅课题（No.1010RJZA176），甘肃省中医药管理局科研课题（No.GZK-2010-47）
Analysis on the establishment of combination of disease and syndrome rat model with
Parkinson’s disease
LIANG Jian-qing 1, HE Jian-cheng 2
( 1School of Basic Medicine Science, Gansu University of Chinese Medicine, Gansu 730000, China; 2School of Basic Medicine
Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China )
Abstract: Objective: To establish a steady and simplify combination of disease and syndrome rat model with
Parkinson’s disease (PD), and meet the demand of drug study on treatment and evaluation of PD. Methods: The animal PD model was established by brain stereotaxic injection with 6-OHDA. The rats were divided into normal control group, sham operation group, model group and drug group. The PD model and its syndrome property were validated by a synthetic judgment from the aspects of etiology, symptoms, objective index, drugs counterevidence and so on. Results: The nerve etiology, oxidative stress, TH mRNA and protein and positive cell in model group were significantly different compared with the normal control group (P <0.01). Drug group could significantly improve the subjective symptoms and objective indexes of rats mentioned above, the difference was statistically significant (P <0.01). Conclusion: The TCM syndrome of PD 6-OHDA model rats was syndrome of internal stirring of wind yang.
Key words: Combination of disease and syndrome; Animal model; Parkinson ,
s disease; Rat
Funding: General Program of National Natural Science Foundation of China (No.81573899), The New Drug Research
and Development Project of Shanghai Science and Technology Committee (No.12401900302), Program of Department of Science and Technology of Gansu Province (No.1010RJZA176), Scientific Research Program of Administration of Traditional Chinese Medicine of Gansu Province (No.GZK -2010-47)
·论著·
通讯作者：何建成，上海市浦东新区蔡伦路1200号上海中医药大学基础医学院中医诊断教研室，邮编：201203电话（传真）：021-********，E -mail：hejc8163@https://www.wendangku.net/doc/ab10275951.html,
在帕金森病（Parkinson’s disease，PD ）的研究领域，缺乏病证结合动物模型的支撑阻碍了中医中药的干预研究。基于此，本研究拟构建病证结合大鼠PD模型，为今后PD领域的研究提供动物模型支撑。
材料
1. 动物 雄性SD大鼠，体质量180-200g，鼠龄38-40周，94只，由上海中医药大学实验动物中心提供，许可证号码：SCXK （沪）2008-0016。SPF级饲养。
2.药物和试剂 复方地黄方药物组成：熟地黄20g，白芍30g，钩藤15g，珍珠母15g，按照既定工艺煮成汤药，浓度为1.44g/mL，4℃冰箱保存备用，由上海中医药大学中药制剂实验室提供。6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA，批号：MKBP0832V）、阿扑吗啡（apomorphine，APO，批号：SLBF6369V）、抗坏血酸（批号：063K1082）：美国Sigma公司产品。考马斯亮蓝法蛋白定量测试盒（批号：20140520）、丙二醛（malondialdehyde，MDA，批号：20140531）、谷胱甘肽
当代医药论丛杂志https://www.wendangku.net/doc/ab10275951.html,
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（glutathione，GSH，批号：20140520）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px，批号：20140516）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，批号：20140518）检测试剂盒, 购自南京建成生物工程研究所。TotalRNAExtractor（Trizol，批号：SK1312）、AMV First Strand cDNA Synthesis Kit（批号：SK2445），购自生工生物工程上海（股份）有限公司。Anti-Tyrosine Hydroxylase[EP1533Y] 抗体（批号：ab75875），购自美国Abcam公司。HRP标记的羊抗兔IgG二抗（批号：HA1001），购自杭州华安生物技术有限公司。
3. 仪器 大鼠脑立体定位仪：RWD-68003型，深圳瑞沃德生命科技有限公司。微量进样器：5μL，上海第三分析仪器厂。秒表：926266，上海秒表厂。多功能酶标仪：Biotek Synergy 2，Gene Company Limited。荧光定量PCR仪：ABI 7500型，美国应用生物系统中国公司。电热恒温水浴箱：HHS-1型,上海跃进医疗器械厂。高速冷冻离心机：GTR16-2型，BECKMAN公司。化学发光成像系统：FC-M型，美国ProteinSimple。Western电泳仪：043BR41664，美国Bio-Rad公司。脱色摇床：TS-1型，江苏海门市其林贝尔仪器有限公司。恒温磁力搅拌器：81-2型，上海司乐仪器有限公司。超细匀浆机：F6/10，FLUKO（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）。移液器：Eppendorf公司。
方法
1. 病证结合模型制备 94只SD大鼠，其中16只为正常对照组，其余78只参与模型制备，PD模型的构建采用Ungerstedt U 等[1]所建立的经典公认方法。造模前按常规进行神经行为学测试，确认大鼠无异常旋转行为后，用3%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，剪去颅顶鼠毛，暴露头部皮肤，将其正确固定在大鼠脑立体定位仪上，用1%碘伏溶液在大鼠颅顶部手术区域常规消毒。然后在无菌条件下用手术刀沿正中线切开大鼠颅顶部皮肤，剥离骨膜，充分暴露前囟和后囟，保证大鼠前囟和后囟在同一水平线上。根据包新民等[2]编著的大鼠脑立体定位图谱，以前囟为标准参考点，确定右侧纹状体两点坐标：前囟后1.0mm，中线右侧旁3.0mm，硬膜下4.0/5.0mm。使用颅骨钻钻开颅骨，用10μL微量进样器将6-OHDA（溶于含0.2%维生素C的超纯水中，即称量药品抗坏血酸0.001g，溶于超纯水0.5mL中，浓度为3μg/μL）先后分别注入（以1.0mm/min速度缓慢进针，注射速度为1μL/min）右侧纹状体二点处，每点3μL，注射完毕后留针5min，然后以1.0mm/min速度缓慢退针。手术完毕后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，仔细缝合切口处骨膜及皮肤，肌肉注射庆大霉素7d，待动物苏醒后放回饲养笼中饲养。假手术组16只大鼠只注射0.2%维生素C的超纯水，正常对照组只捆绑动物，不作任何处理。造模10d后，以腹腔注射APO 0.5mg/kg诱发大鼠向健侧旋转，记录开始旋转至30min内的旋转圈数，以旋转圈数平均>7次/min者为合格的PD动物模型[3]。
造模成功大鼠32只，采用随机数字表法将32只大鼠分为模型组、药物组，每组16只。药物组给复方地黄方灌胃2mL；正常对照组、假手术组、模型组给予0.9%氯化钠溶液灌胃2mL。每日1次，连续治疗14d。大鼠在最后一次进行行为学评价后断头处死，在冰上分离右侧黑质，-80℃冰箱保存。
本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。
2. 病证结合动物模型的诊断标准 根据《中医内科学》中描述的颤震的证候表现及西医诊断标准确定[4-5]。
3. 客观指标测定
3.1 行为学评价 SD大鼠分别在成模期、治疗后2周给予腹腔注射APO 0.5mg/kg以诱发大鼠向对侧旋转，记录开始旋转至30min内总的旋转圈数，以进行APO诱导PD大鼠对侧旋转行为的评定。
3.2 氧化应激 取大鼠黑质，制备脑组织匀浆液，检测黑质中MDA、GSH、GSH-Px、SOD含量。按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书步骤进行操作。
3.3 TH mRNA 取大鼠黑质，提取总RNA，合成cDNA模板，进行荧光定量PCR反应。TH引物序列（Primer Premier 5.0软件设计）：正向：5’-GGA CGG CGA CAG AGT CTC AT-3’，反向：5’-AGC TTC CGA CGC TGG CGA TA-3’，扩增片段为512bp。引物β-actin：正向：5’-TGT CCC TGT ATG CCT CTG GT-3’，反向：5’-TTG ATG TCA CGC ACG ATT TC-3’，扩增片段为217bp。PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃延伸7min。相对定量2法分析各个样本目的基因的表达变化。
3.4 TH蛋白 取大鼠黑质，Western blot法检测TH蛋白表达。检测步骤是：蛋白质抽提、BCA法蛋白浓度测定、电泳、半干转膜、免疫反应、化学发光法显影，用AlphaView图像分析软件对扫描图像的目标条带进行灰度分析，各目的条带与β-actin 的灰度值比值为目的蛋白的相对表达量。
3.5 TH阳性细胞 取大鼠进行灌注固定, 分离黑质，并浸于含20%蔗糖的PBS液中（4℃）过夜。用冰冻切片机作50μm的连续切片，作TH免疫组织化学染色。每张切片在光镜高倍镜下随机取3个4mm2的视野，用IMS彩色图像分析系统进行TH阳性细胞计数。
4. 统计学方法 用SPSS 18.0统计软件分析，计量指标以x-±s 表示，采用t检验，组间比较采用方差分析。计数资料用χ2检验，以P<0.01为差异有统计学意义。
结果
1. 各组大鼠行为学变化 见表1。与正常对照组、假手术组成模期比较，模型组大鼠出现异常旋转行为，差异有统计学意义（P<0.01）；治疗后药物组与模型组比较，旋转圈数有显著性差异（P<0.01）。
2. 各组大鼠氧化应激指标的变化 见表2。与正常对照组、假手术组比较，模型组MDA明显升高，GSH、GSH-Px、SOD
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明显下降（P <0.01）；药物组与模型组比较，MDA、GSH、GSH -Px、SOD差异均有统计学意义（P <0.01）。
3. 各组大鼠TH mRNA的变化 见表3。与正常对照组、假手术组比较，模型组TH mRNA明显下降（P <0.01）；与模型组比较，药物组可明显改善TH mRNA的表达（P <0.01）。
表3 各组大鼠TH mRNA的变化（x -±s ，n =10）组别TH mRNA 正常对照组0.7788±0.0125假手术组0.7988±0.0115模型组0.1153±0.0105**△△药物组
0.4962±0.0241▲▲
4. 各组大鼠TH蛋白的变化 见表4，图1。与正常对照组、假手术组比较，模型组TH蛋白明显下降（P <0.01）；与模型组比较，药物组可明显改善TH蛋白的表达（P <0.01）。
表4 各组大鼠TH蛋白的变化（x -±s ，n =10）组别TH/β-actin 正常对照组 1.003±0.021假手术组 1.008±0.025模型组0.105±0.022**△△药物组
0.703±0.017
▲▲
1 2 3 4
+￡-actin
59KD 42KD
图1 各组大鼠黑质TH蛋白印迹图
注：1.正常对照组；2.假手术组；3.模型组；4.药物组。
1 2 3 4
TH β-actin 59KD 42KD 5. 各组大鼠TH阳性细胞的变化 见表5，图2。与正常对照组、假手术组比较，模型组TH阳性细胞明显下降（P <0.01）；与
模型组比较，药物组可明显改善TH阳性细胞的表达（P <0.01）。表5 各组大鼠TH阳性细胞的变化（x -±s ，n =10，个/HP ）
组别TH阳性细胞正常对照组25.03±3.21假手术组24.08±3.25模型组 4.15±1.22**△△药物组
17.70±2.37▲▲
图2 各组大鼠黑质TH阳性细胞免疫组化染色表达图（×200）
正常对照组 假手术组
模型组 药物组
.
在正常对照组、假手术组的黑质均可见密集的TH阳性细胞，呈棕褐色，这些细胞体主要为圆形或卵圆形，少数为多边形；模型组黑质可见少量、稀疏的TH阳性细胞，呈棕褐色；而药物组黑质均可见较密集的TH阳性细胞，呈棕褐色, 细胞体亦主要为圆形或卵圆形，少数为多边形。
讨论
1. 病证结合动物模型的造模依据
1.1 模拟病因 将神经毒剂儿茶酚胺的羟基化衍生物6-OHDA立体注射于大鼠右侧纹状体，可被多巴胺（dopamine，DA）能神经元末梢或胞体的膜转运体主动摄取到细胞内，经氧化生成神经毒物如羟自由基和醌类物质，有效导致DA神经元变性坏死，使黑质-纹状体通路DA释放减少，从而导致基底神经节调节功能的紊乱，符合PD患者中脑黑质的病理变化[6]。
鉴于6-OHDA不能通过血脑屏障，需立体定向注入大鼠脑内，目前多采用黑质致密部、纹状体、中脑腹侧被盖区、前脑内侧束单点或双点注射法来制作单侧损毁PD模型[7-15]。6-OHDA微量注射到纹状体会导致DA能神经元出现进行性和逆行性的变性坏死，神经退行性变假说认为PD发病的病理是投射到纹状体的DA能神经纤维末端先于黑质致密部DA能神经元死亡，所以6-OHDA注射的PD模型更接近于人类PD的发病过程[16]。
因此，表2 4组大鼠氧化应激指标的变化（x -±s ，n =10）组别
MDA （nmol/mgprot ）
GSH （mg/gprot ）GSH -Px （U/mgprot)SOD （U/mgprot ）正常对照组 4.48±0.327.65±0.37642.60±61.70166.27±12.46假手术组 4.45±0.227.87±0.30633.99±62.27179.20±10.63模型组13.89±0.28**△△ 3.75±0.33**△△137.00±12.19**△△99.87±11.96**△△药物组
7.68±0.39▲▲
5.88±0.34▲▲
421.62±40.46▲▲
133.65±13.47▲▲
表1 各组大鼠旋转圈数变化（x -±s ，n =16）组别成模期治疗后正常对照组0.000.00假手术组0.000.00模型组254.38±34.63**△△257.34±31.29**△△药物组
249.40±32.27
196.10±34.19▲▲
注：与正常对照组同期比较，**
P <0.01；与假手术组同期比较，△△
P <0.01；与模型组同期比较，▲▲
P <0.01。下表同。
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本研究选用右侧纹状体2点注射法造模。
1.2 模拟症状 按照病证结合动物模型的诊断标准，对照模型组大鼠的临床症状，我们可以推断PD模型大鼠的证候属性。APO是强效DA受体激动剂，给造模大鼠腹腔注射诱导后，可与注射侧纹状体内大量增加的DA D2受体结合，并使受体出现超敏现象，引起大鼠向健侧旋转[6]，伴情绪易激惹，肢体震颤。客观指标，大鼠毛发干枯，大便干燥呈粒状，小便量少色黄，显微舌象是红舌。平均每只大鼠饮水量45mL/24h综合症状体征，中医解释为药邪（6-OHDA）内侵，斫伤肝肾阴液，继发水不涵木，风阳内动，筋脉失养，出现异常旋转，情绪激惹，肢体震颤，口渴，毛枯，便干色黄，红舌等。证明该模型的证候属性是风阳内动证，相当于西医的PD。
1.3 客观指标 研究证明，DA能神经元含有神经递质DA，DA在代谢过程中会产生OFR，容易使DA能神经元处于氧化应激状态，极易产生氧化损伤[17]。TH是DA合成的限速酶，TH蛋白由两部分构成，N-端为调节区域，C-端为催化活性区，其所有的活性催化残基都位于其C-端的330个氨基酸中[18]。如前所述，TH在DA的合成调节中发挥着重要作用。在人体内，一部分DA 存在于黑质纹状体系统中，当TH的质或者量发生变化都会干扰L-DOPA的生物合成，导致PD的发生[19]。这就表明，PD患者处于氧化应激状态，TH表达量显著减少为该病的显著特征。
本实验结果表明，与正常对照组、假手术组比较，模型组大鼠出现异常旋转行为，存在显著性差异（P<0.01）；药物组与模型组比较，可明显改善旋转行为（P<0.01）。与此同时，各组氧化应激指标（MDA、GSH、GSH-Px、SOD）、TH mRNA、TH蛋白、TH阳性细胞也遵循这一演变趋势。显示风阳内动证PD大鼠的证候物质基础是行为学障碍，氧化应激指标及TH的改变，而复方地黄方可改善这些指标的良性表达。
1.4 药物反证 复方地黄方由熟地黄、白芍、钩藤、珍珠母组成，方中熟地黄性温味甘，归肝肾经，善补益肾精、滋阴养血、固本培元，故为君药；白芍性味苦酸微寒，归肝脾经，养肝血、滋肝阴、柔肝气，为养血濡筋、缓急止颤之良药，为臣药；钩藤甘凉，入肝心经，功效熄风定惊，为佐药；珍珠母性味咸寒，归肝心经，可滋阴潜阳、定惊止颤、养血舒筋，柔肝与熄风两者兼顾，滋阴与养血并疗，乃平肝潜阳之要药，为使药。上述诸药合用，可补益肝肾、滋阴熄风。根据“方证相应，以方测证”的理论，复方地黄方的适应证应是风阳内动证。药物反证, 复方地黄方灌胃后PD大鼠的临床症状及客观指标明显改善。以方测证，6-OHDA大鼠PD模型的中医证候属性是风阳内动证。
2. 病证结合动物模型的评价 20世纪60年代邝安堃教授发现过量肾上腺皮质激素可诱发小鼠呈现类似中医阳虚症状以来，证候动物模型的探索历程已走过了整整50年[20]。笔者采用对疾病动物模型进行辨证建立病证结合动物模型。该病证结合动物模型具有疾病和证候的双重特征，为PD动物模型首次提供了证候物质基础。通过以方测证，进一步证实该模型的合理性，对这一领域的研究进行了有益的探索。
参 考 文 献
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本文由当代医药论丛杂志提供https://www.wendangku.net/doc/ab10275951.html,