免疫组化实验步骤及配方
免疫组化实验步骤及配方 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
免疫组化步骤
1.多聚甲醛灌流取材，多聚甲醛后固定，30%多聚糖溶液沉糖;
2.冰冻切片（1d-14d 脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRG d=10μm）
3.0.01M PBS洗 10min×3次;
4.1N HCL 暴露抗原 30min；
5.去离子水洗，0.01M PBST洗 10min×3次；
6.3%双氧水(0.01M PBS配制)洗10min，灭活内源性HRP；
7.0.01M PBST洗 10min×3次；
8.5%-10%血清封闭30min（0.01M PBST 配制）；
9.一抗过夜，一抗用PBST稀释；
10. 0.01M PBS洗 10min×3次，二抗3孵育小时；
11. 0.01M PBS洗 10min×3次，HRP-亲和素3小时；
12. 0.01M PBS洗 10min×3次，DAB显色 12-18min。
免疫组化常用试剂配制
1. 0.1M PB: 14.5g Na
2HPO
4
·12H
2
O
500mL H
2
O
NaH
2PO
4
·2H
2
O
2. 0.1M PBS : 500mL 0.1M PB 45g NaCl
3. 0.01M PBST: 100mL 0.01M PBS 10滴 Triton X-100
4. IN HCL: 盐酸：水=1：10
5. 4%多聚甲醛： 13.6g KH
2PO
4
3.6g NaOH
40g 多聚甲醛
1000mL H
2
O
注：1). 需要60°C加热溶解，过滤使用；
2).多聚甲醛每次比需要多称10g，以弥补后面过滤的损失；
3).现将多聚甲醛溶于1000mL水中，然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛
的助溶剂NaOH，待NaOH和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH
2PO
4
，溶后过滤备
用。
液：以0..1M PB配制，DAB浓度%，H
2O
2
浓度%。
注：1). H
2O
2
临用时再加；
2).用DAB染后用0.01M PB洗。
7. 30%蔗糖： 150g 蔗糖
500mL 4%多聚甲醛注：可同时沉糖后固定。
8.封闭液：10%山羊血清（做免疫荧光时另加%BSA）。