Inoue法制备化学感受态细胞及注意事项

1试剂的配制

⑴5mol/L的KOH: 10mL

称取KOH（南京化学试剂有限公司）2.8055g 加无菌的Mill-Q水至10mL

⑵0.5mol/L的PIPES pH:6.7

称取PIPES固体（进口Sigma）3.775g 加无菌的Mill-Q水至25 mL

用5mol/L的KOH调pH至6.7 并过滤除菌。

⑶Inoue转化缓冲液的配制：500mL

试剂需要量/500mL 终浓度

MnCl2.4H2O（国药集团化学试剂有限公司） 5.44g 55mmol/L

CaCl2.2H2O （AMRESCO） 1.1g 15 mmol/L

KCl（南京化学试剂一厂）9.325g 250 mmol/L PIPES(0.5mol/L, pH:6.7) 10mL 10 mmol/L

H2O 补水至500 mL

过滤除菌4℃冰箱存放备用

2 .DH5a化学感受态细胞的制备

⑴第一天划平板：DH5a从-80℃冰箱冻存管划线至LB平板，37℃培养箱培养，约12hrs.

⑵第二天接种子瓶：从平板挑单clone至种子瓶20mLLB Media中,37℃，220rpm摇床过夜.

⑶第三天接子瓶：从种子瓶吸取一毫升DH5a种子菌液至子瓶中，25℃，220rpm摇床培养，约6～7hrs.

⑷测OD：待OD值约为0.6时开始制作(离心机事先预冷)

①将培养好的菌液转移至灭菌的50mL离心管中，置于冰上10min至菌液冰冷.

②4℃,2500g离心10min.

③弃上清，将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体．

④向５０ｍＬ离心管中加约１６ｍＬ的Ｉｎｏｕｅ转化缓冲液，重悬细菌沉淀（轻轻

重悬，不要用振荡器或吹吸混匀）。

⑤4℃,2500g离心10min。

⑥弃上清，将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体．

⑦每管各加入５ｍＬＩｎｏｕｅ缓冲液，轻轻悬浮。

⑧每管各加入３７５ｕＬＤＭＳＯ，混匀，冰上１０ｍｉｎ．

⑨每管１１０uＬ，快速分装并冷冻。－８０℃，备用。

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并

制备感受态细胞的实验报告

制备感受态细胞的实验报告 一、实验目的 掌握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。 二、实验原理 1.感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内， 使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 化学制备法： 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收

高效感受态细胞制备试剂盒

高效感受态细胞制备试剂盒 产品编号：SK9305/SK9306 包装规格：40支/200支 试剂盒组成 组分 SK9305，40支 SK9306，200支 BT Buffer F 10 ml 5 × 10 ml BT Buffer E 4 ml 5 × 4 ml 2个 10个 BT Media (1 Capsules for 50 mL) 操作手册1份1份 保存方法及注意事项 BT Media以胶囊的形式提供，请于室温密封干燥保存。BT Buffer F和BT Buffer E可于常温运输，收到后请于4°C保存，长期保存请置-20°C。 产品介绍 生工BT高效感受态制备试剂盒采用了一种简单而可靠的方法制备感受态细胞，由该试剂盒制备的感受态细胞在进行转化时无需经过热激步骤，对于Ampicillin抗性质粒而言，甚至连活化步骤都可以省略，感受态细胞和DNA混合后即可直接涂布，极大地简化了转化过程，提高了实验效率。用该试剂盒制备的大肠杆菌DH5α细胞使用pUC19质粒DNA转化，转化率可以达到107~109 cfu/μg DNA，对其他常用的工程菌株和质粒也同样适用。 产品特色 1. 感受态制备流程快速简单。 2. 转化过程无需热激。 3. 转化效率高达107~109 cfu/μg DNA。 4. 使用感受态专用培养基，最大化感受态效率。 5. 适合大量制备。 高效感受态细胞制备流程 自备材料：目标菌种、LB培养基及平板、离心机、50 ml离心管、冰等。 BT Media培养基准备：将一只胶囊投入50 mL蒸馏水中，高压灭菌即可。 准备工作：将BT Buffer F和BT Buffer E放冰上预冷，预冷低温离心机至4°C。 1. 用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线培养，置37°C培养箱中静置培养12~16 h待菌落生长至直径1~2 mm大 小。 2. 挑取一个生长正常的菌落，接种至10~15 mL液体LB培养基中，于37°C摇床充分振荡（≥ 250 rpm）培养12~16 h。 3. 取上述活化好的菌液0.5 mL接种至准备好的50 mL BT Media中，于37°C摇床充分振荡培养至菌液OD600 = 0.4~0.6。? 50 mL培养物请使用容量大于250 mL的锥形瓶，同时摇床转速超过250 rpm以保证充气充分。 ?使用较低的温度（18·26°C）培养细菌将使感受态效率进一步提高一个数量级，室温状态下菌液培养至OD600 = 0.4~0.6需要10~36 h。

(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备 标签： tr..,Ca..,co.. 分类：细胞技术> 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。 转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 （R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基

氯化钙法质粒转化

氯化钙法进行质粒转化 利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形。 仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴 药品试剂： 0.1 M CaCl2置冰浴中 2 M glucose： 取18 g glucose溶于水中，并调体积至50 mL，无菌过滤，分装后置-20℃贮存。 2 M Mg2+： 取20.3 g MgCl2·6H2O及24.65 g MgSO4·7H2O溶于水中，并调体积至100mL，无菌过滤的，分装小瓶置-20℃贮存。亦可以MgCl2完全取代MgSO4. SOB 液体培养基： 32 Methods in Biotechnology Vol 1 2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,高压灭菌，使用前加入2 M Mg2+，使最终浓度为10 mM. SOB 固体培养基：

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1. 5% Bactoagar,高压灭菌，倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM. SOC/Amp 固体培养基： SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin. SOC 液体培养基：SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）。 大肠杆菌菌株：JM109 #1~#5 接合反应液 方法步骤： 1）进行转形实验前16~20 h,自-70℃取出贮存的菌种，以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上，在37℃培养。 2）取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶（请记得加入Mg 2+）。另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入40 mL S OB中，于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计 3）收集菌液于离心管中，置冰浴中10~15 min. 4）以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。

感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)

感受态细胞的制备（DH5α） 一、准备工作 所有试剂、容器均需提前预冷。 1、实验器械 4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。 2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧） ① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。 ② SOB培养基（Super Optimal Broth） ③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。（装在50ml离心管，封口4度保存） ④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。

配制量 1 L 配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。 6.滴加NaOH小块，调节pH值至 7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至l L。 8.高温高压灭菌后，4℃保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。 LB培养基 配制量 1 L 配制方法 3.滴加固体NaOH，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4度保存。

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 ?1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液 体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； ? 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振 荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； ? 3、培养物于冰上放置20min； ? 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟； ?5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min； ? 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 μL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感 受态细胞悬液； ? 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置 12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右 高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下， 可保存半年至一年。

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）； 2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； 3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上 操作； 4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超 低温冷冻贮存备用（－70℃）。 注意事项 1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使 用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的 推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的 活菌数随时间延长而减少造成的）； 4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 （如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5 ．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能 大大降低细菌的转化效率； 6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；

感受态制备

3.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) 最终实验步骤： 1，从DH5α平板上挑取单菌落，于5ml LB培养基中过夜培养。 2，取100ul细菌加入10mL LB培养基中，以220转/分的速度约摇动3-5小时，使OD600在0.4~0.5之间。 3，冰预冷细胞约30min。 4，4℃离心4000rpm,15~20min,弃上清。 5，倒掉上清后，用2ml冰预冷的0.1M/L CaCl2悬浮细菌,在冰上放置30min。 6，重复4，5步骤两次 7，3000rpm离心10min，用400μl冰预冷的0.1M/L CaCl2轻柔重悬细菌。 8，每个1.5mL的Eppendorf 管分别放入100ul 细菌后，立即用于转化。如需长期保存则每管需含有15%的甘油 DH5a制备化学感受态细胞应该不是太麻烦，一般用CaCl2的方法，就是注意其中几点： 1.所用试剂必须是最高级别的，包括水，最好是Milli－pore级别的。 2.所用器皿，枪头，离心管，还有你的甘油等必须严格灭菌，因为你的培养基是不含Amp 的，再说，你的感受态细胞很脆弱。经不起大风大浪。 3.关键一点：步步不离冰。温度波动会影响到你的成功率。 4.离心后回融不要剧烈震荡，始终记住，感受态细胞的脆弱性。经不起折腾。经验人士告诉我可以用枪轻轻吹打。 5.保证你培养的大肠杆菌OD值在0.5左右。别让细胞长老了。 6.可以先在超低温冰箱中用离心管盒放一些乙醇（工业酒精即可）预冷，分装后将离心管插入超低温冰箱的乙醇中保存即可。 感受态制备的疑点： A）细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行； C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；

高效制备感受态

在科研实验中，为了获得纯的重组质粒DNA，需要允许外源DNA分子进入的细胞。经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。 基本制备步骤 1.从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。 2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3.于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 5.每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6.于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8.每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9.此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细

胞冻存于- 70

℃。 洁净是最重要的~ 无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。 涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复。 轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。 预冷是必要的。 整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。 关于感受态的制备方法~ 关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。

制备感受态细胞

用Hanahan方法制备感受态细胞——高效转化 DMSO DnD 溶液 转化缓冲液： 标准转化缓冲液：用于制备现用的感受态细胞 1M MES(pH6.3):将19.52过MES溶于80mL超纯水中，用KOH调节pH至6.3,用超纯水定容至100mL, 0.45um 孔径的滤膜过滤除菌，分成小份-20℃保存; 0.45um孔径的滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。 冻存缓冲液（FSB） 1M KAc:将9.82g KAc90mL的超纯水中，用2M的醋酸将pH调至7.5，并用超纯水定容至100mL,分装成小份保存于-20℃; 0.4um 滤膜过滤，分装并保存于4℃（在保存过程中，pH会降低至6.1-6.2，之后就稳定在这个水平） LB培养基 1．LB无抗培养基倒平板，划线培养大肠杆菌过夜; 2．挑取单菌落，接种至3mL的LB培养基中，37℃、250～300rpm/min培养6-8h； 3．将上述培养物接种至250mLLB培养基的1L三角瓶中，37℃振荡培养3h左右； 4．将培养物转移至无菌、预冷的离心管内，冰浴10min； 5．4℃2700g离心10min收集菌体； 6．弃去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体；

7．每50mL培养物加20mL预冷的TFB或FSB重悬菌体（轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀）,冰浴10min；8．4℃2700g离心10min收集菌体； 9．弃去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体； 10．每50mL培养物加4mL预冷的TFB或FSB重悬菌体； 11．现用：每4mL悬浮液加入140uL DnD溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴15min; 再加入140uL DnD溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴15min; 分装成小份至冰上保存； -70℃冻存：每4mL悬浮液加入140uL DMSO溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴15min; 再加入140uL DnD溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴; 迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞，贮存于-70℃备用。 制备感受态大肠杆菌的Inoue方法 ——制备超级感受态细胞 采用Inoue方法制备的大肠杆菌感受态细胞在效果很好时可以达到Hanahan法的转化效率，而在标准的实验室条件下，一般可达到1*108~3*108个转化子/ug质粒DNA。其优点在于不过分讲究细节，重复性更好，更有预见性。 缓冲液和溶液 DMSO(DMSO的氧化产物为二甲硫醚，是转化的抑制物，为避免这个问题，应使用高质量的DMAO) Inoue转化缓冲液（水的有机污染会降低转化效率，使用前预冷至0摄氏度） 0.5M的PIPES(pH6.7):15.1g PIPES溶于80mL水中，KOH调节pH至6.7后定容至100mL，0.45um孔径的滤膜过滤除菌，分成小份-20℃保存; Inoue转化缓冲液的配制： 0．45um孔径的滤膜过滤除菌，分装成小份-20℃保存 LB培养基 1．LB无抗培养基倒平板，划线培养大肠杆菌过夜; 2．挑取单菌落，接种至3mL的LB培养基中，37℃、250～300rpm/min培养6-8h； 3．将上述培养物接种至250mLLB培养基的1L三角瓶中，每瓶接种2~10mL，18℃中速摇床培养过夜；4．待其OD600达到0.55时，将培养物冰上预冷10min，同时离心机预冷至4℃； 5．4℃2500g离心10min收集菌体；

高效感受态细胞的制备

感受态细胞的制备 一、实验原理 受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。 本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。 二、材料及准备工作 一）材料准备

二)试剂配制 1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用） 蛋白胨 2.0g 酵母提取物 1.0g 氯化钠（NaCl） 2.0g 2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌） 蛋白胨2×1.0g 酵母提取物2×0.5g 氯化钠（NaCl）2×1.0g 琼脂粉2×1.5g 温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。 3、TSS液（100ml）（有效期2周） 聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10% DMSO 5ml 终浓度5%

MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/L LB 85ml 终浓度85% 去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用 注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000 4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用） KCl（2mol/L） 2.5ml CaCl2(1mol/L) 1.5ml MgCl2(1mol/L) 2.5ml 水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒） 5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml） 取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃ 保存备用 三）仪器设备 1、低温大容量离心机 2、恒温水浴锅 3、超净台 4、高压锅 5、37℃孵育箱 6、恒温摇床 7、制冰机 8、分光光度计

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布 人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889 一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm）储液：125mg/ml 0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。

四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。 一．农杆菌感受态细胞的制备 二．双元载体转化农杆菌EHA105 三．杆菌转化子的鉴定 A．农杆菌转化子的PCR鉴定 B．农杆菌转化子的酶切鉴定 关键词：农杆菌感受态细胞转化子 一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。挑单 菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH 2 PO 4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO 4,0.3 g/L Yeast extract,PH 7 .0）液体培养基中，220rpm， 28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中， 28℃,220rpm,振荡培养至OD 600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min, 去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl 2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min， 4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。 二．双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800μl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。

制备感受态细胞 氯化钙法

氯化钙法（Calcium Chloride） 本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞，所得感受态细胞可以获得5 x 106 到2x 107 转化克隆/微克超螺旋质粒DNA 材料（MA TERIALS） 缓冲液和溶液（Buffers and Solutions） （冰冷的）CaCl2?2H2O (1 M) 冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution, ice cold) 培养基（Media） 用于初始培养物培养的LB肉汤（L-broth for initial growth of culture） LB agar plates containing appropriate antibiotic 核酸（Nucleic Acids） 质粒DNA （Plasmid DNA） 或经过重组的质粒（recombinant plasmid） 方法 1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。 2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。 3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀。 5. 加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液，并轻微打匀。 6. 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。 7. 弃MgCl2-CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。 8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀。冰浴放置若干小时为最好。 9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。 10. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克)。细心混匀管中成份。于冰浴放置30到40分钟。 11. 把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。（此时不能摇动转化管） 12. 把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。 13. 向每只试管中加入500微升LB肉汤。37°C放置45到90分钟，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。 14. 转移适量体积（如果使用90毫米平板，一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有相应抗生素的LB-琼脂平板上。 15. 室温放置平板直到其上液体被吸收。 16. 于37°C倒置平板培养。转化克隆应该于12-16 小时区间出现

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理） 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100--1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。

实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化

实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化 【实验目的】 1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 【实验原理】 质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。 微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1．LB液体培养基: 参见附录 每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）: 配1L LB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。 每组制备LB平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。 3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。 4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。 5．1 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。 7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。 〈二〉器材 1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等 2. 高速冷冻离心机 3. 微量移液器等

感受态细胞制备

感受态细胞制备 实验目的 1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术； 2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法； 3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。 实验原理 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的 状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态, 如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0 C, CaCI2的低渗溶 液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 C短时 间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是CaCI2 能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化

学法高出1 到2 个数量级，达到1x108转化子每1 卩gDNA甚至1x109转化子每1卩gDNA所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围 广，感受态细菌可以在-70 C保存，因此被广泛用于外源基因的转化。 物理制备法： 电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109?1010转化子/卩g 闭环DNA因操作简便，愈来愈为人们所接受。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化率（转化子数/每卩g质粒DNA =转化子总数/ 质粒DNA加入量（卩g） 理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数 为1*10 10 实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB 液体培养基、 实验试剂：溶液、含10%甘油的溶液、GYT三蒸水、10% 甘油的水

感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备及各种 感受态的特点 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT

感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法： 1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。 2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃， 220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于 50ml LB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养小时至OD600=。 注意：接种比例不得大于1:10。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置 5~10min； 注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4℃ 5000g离心5分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g 离心5分钟； 6、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。 含15%甘油的L CaCl2制备方法: 称取 CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。