番茄果实中乙烯与多聚半乳糖醛酸酶的关系
2004-03-15收到，2004-09-15接受。
国家基础重点发展规划项目(No.G1999011701)和国家自然科学基
金项目(No.30270934)资助。
*通讯作者(E-mail: lyb@https://www.wendangku.net/doc/a611888893.html,; Tel: 010-********)。
番茄果实中乙烯与多聚半乳糖醛酸酶的关系
寇晓虹1 朱本忠2 罗云波2* 田慧琴2 蔚变云2
(1山西农业大学食品科学与工程学院，太谷 030801；2中国农业大学食品科学与营养工程学院食品生物技术系，北京 100083)
摘要：乙烯与多聚半乳糖醛酸酶(PG)都是果实成熟过
程中关键的调节因子。一方面，在有乙烯合成缺陷的
转反义ACS番茄和乙烯感受缺陷的Nr突变体番茄果实
中PG基因表达量都明显下降，PG酶活性明显降低；
用外源乙烯(100 μL/L)处理绿熟期番茄果实使PG基因
的表达明显增强，而1-甲基环丙烯(1-MCP，1 μL/L)处
理转色期番茄果实明显抑制PG基因表达。另一方面，
转反义PG基因番茄果实乙烯释放量在授粉后低于其野
生型，番茄乙烯受体基因LeETR4和乙烯反应因子
LeERF2基因表达量比野生种低。PG降解果胶的产物
D-GA(100 mg/L)促进未熟期番茄果实中的乙烯生成和
LeETR4、LeERF2基因的表达。
关键词：多聚半乳糖醛酸酶(PG); 乙烯；果实成熟；D-
半乳糖醛酸(D-GA); 调控
中图分类号：Q945
多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG，
EC3.2.1.15)是一种在细胞壁结构变化中起重要作用
的酶，它参与果胶降解，从而使细胞壁结构解
体，最终导致果实软化。许多果实软化进程与PG
活性增高和果胶的溶解呈很好的相关性(Hadfield和
Bennett 1998, Hadfield等1998)。而作为植物五大
激素之一的乙烯是跃变型果实成熟过程中的关键因
子，其生物合成与信号转导调控机理是果蔬成熟
衰老机制研究中的重点之一(Alexander等2002)。
乙烯影响许多与成熟相关的基因如P G、
PME(果胶甲酯酶基因)、LeEXP1(番茄伸展蛋白因
子)和Le Rabl a等的转录和翻译(Ale xa nde r和
Grierson 2002)。虽然针对乙烯在跃变型果实成熟
过程中对PG调节作用的研究相当多，但是其结果
中存在很多矛盾。一些学者认为，PG基因表达
受乙烯调控，并且非常低的乙烯就可引起其反应
(Sitrit和Bennett 1998); 其次，番茄果实PG基因
启动子与E4和E8的乙烯特异启动子类似
(Nicholass等1995)，暗示PG基因表达受乙烯诱
导。但也有些研究者认为，番茄果实中PG基因
的转录不受乙烯影响，而其翻译受到乙烯的调控
(Hadfield和Bennett 1998)。鉴于果实中乙烯对PG
的调控模式仍不明确，而PG对乙烯生成和信号转
导的影响尚未见到研究报告，本文从番茄果实中
乙烯对PG的作用和PG对乙烯合成和信号转导途
径的影响两方面进行研究，旨在进一步阐明乙烯
与PG之间的关系，初步探讨PG对乙烯代谢的作
用，明确二者在跃变型果实成熟过程中的确切作用。
1 材料与方法
1.1 植物材料
实验用植物材料为野生型番茄(Lycopersicon
esculentum cv. Lichun)、转反义ACS基因番茄和
转反义PG基因番茄，分别在正常栽培条件下种植
于中国农业大学科学园。其中Nr突变体番茄的种
子由广州中山大学张宏博士馈赠；转反义ACS基
因番茄和转反义PG基因番茄由中国农业大学食品
生物技术实验室培育得到。
1.2 外源乙烯和1-MCP处理番茄果实
外源乙烯和1-MCP处理参照Liu等(2000)的方
法。选取大小一致的绿熟期番茄果实，放入容积
相同的玻璃瓶中，密封，注入标准乙烯气体使终
浓度为100 μL/L。选取破色期的番茄果实，加入
终浓度为1 μL/L的1-MCP进行处理，处理时间分
别为0、4、8、12、24 h，处理重复3次，处
理温度为25℃。按照处理时间取相应果实的外果
皮，液氮速冻后于-80℃贮藏，用于RNA提取和
分析。
1.3 D-半乳糖醛酸(D-GA)处理番茄果实
用100 mg/L的 D-GA浸泡未熟期番茄果实15
min, 然后放置在25℃下观察果实变化，分别测定
处理不同时间后果实的乙烯释放量，同时取果实
的外果皮，液氮速冻后于-80℃贮藏备用。
1.4 Northern杂交分析
参照Gregory等(1988)的RNA异硫氰酸胍-酚-氯仿小量提取方法提取番茄果实组织中的RNA。杂交和洗膜参照Church和Gilbert(1984)方法。1.5 PG酶活性测定
参照陈冬兰(1985)的方法。酶活力单位为mmol半乳糖醛酸h-1 kg-1 FW。
1.6 乙烯释放量测定
用取样器从密闭容器中取1 mL气样测定乙烯释放量。用惠普GC-6890型气相色谱仪测定，HP-5毛细管柱，柱长30 m, 氢火焰离子探测器检测，
载气为N
2，压力为0.6 kg/cm2，燃气为H
2
，流
量为30 mL/min；检测器的温度为160℃，柱温80℃。
2 结果
2.1番茄果实中乙烯生成和PG酶活性的变化
在整个成熟期间转反义ACS和Nr突变体番茄果实乙烯释放受到明显的抑制(图1A)。PG酶活性在3种成熟模式番茄40 DAP(days after pollination)时果实中都很低(图1B)，三者差异不大；45 DAP 野生型番茄果实的PG酶活性迅速上升，转反义ACS番茄和Nr突变体的PG酶活性则仍保持低水平；50 DAP转反义ACS番茄和Nr突变体的PG酶活性才有较大的提高，但仍显著低于野生型番茄；这表明在乙烯生物合成和它的生理作用受到
图1 不同成熟阶段转反义ACS、Nr 突变体和野生型番茄果实乙烯生成(A)和PG活性变化(B)
Fig.1 Difference in ethylene production rate(A) and PG activity(B) between antisense ACS, Nr mutant and wild-type tomato at different stages
抑制的番茄果实中PG酶活性也相应受到抑制。
2.2 PG基因在番茄果实中的表达
PG基因在3种不同成熟模式番茄果实中的表达模式差异较大(图2)。在野生型55 DAP的番茄果实中PG基因表达水平较高，并且在不同组织中表达趋势不同，果皮的PG基因表达水平显著高于中柱和辐射壁。PG基因在乙烯合成受阻的转反义ACS番茄果实成熟过程中表达水平比较低，只在果皮中有较弱的表达，中柱和辐射壁中没有表达信号。Nr突变体番茄对乙烯的感受受阻，果实不
图2 PG基因在野生型、反义ACS和Nr突变体番茄果实中的表达
Fig.2 Expression of PG in wild type, antisense ACS and Nr mutant tomato fruits 1: Pericarp; 2: Columella; 3: Radial pericarp.
能正常成熟，PG基因在Nr突变体果实中表达情况与在转反义ACS番茄果实中的相同，也明显被抑制。
2.3 外源乙烯和1-MCP处理对番茄果实PG基因表达的影响
用乙烯100 μL/L处理绿熟期番茄果实，能明显促进PG基因的转录表达(图3)，而且随着处理时间的延长，促进效果更加明显。利用乙烯受体专一性抑制剂1-MCP处理转色期番茄果实，PG基因的表达明显受到抑制，抑制程度随处理时间延长而加大(图3)。这表明番茄果实中PG基因表达受到外源乙烯的诱导，且这种作用效果随着处理
图3 外源乙烯(100 μL/L)和1-MCP(1 μL/L)处理对番茄果实PG基因表达的影响
Fig.3 Effect of exogenous ethylene (100 μL/L) and 1-MCP (1 μL/L) on expression of PG in tomato fruits
时间延长而更加明显，这主要是由于乙烯在果实
中不断积累，形成的乙烯浓度累积效应。
2.4 转反义PG基因番茄的乙烯生成及LeETR4和
LeERF2基因的表达
为了研究PG在番茄果实成熟过程中对乙烯生
成及作用的影响，我们培育了PG功能受抑制的转
反义PG基因番茄。它的果实的乙烯释放量在转色
期(45 DAP)和粉红期(50 DAP)低于野生型番茄(图
4)，同时果实中LeETR4和LeERF2基因表达也明
显低于对照(图5)。这表明抑制PG基因表达能抑
制番茄果实中乙烯生成，同时使得乙烯受体基因
图4 不同成熟阶段转反义PG基因番茄和野生型番茄果实的乙烯生成变化
Fig.4 Difference in ethylene production rate between antisense PG and wild-type tomato at different stages LeETR4和信号转导途径中转录因子LeERF2的表达水平下降。
2.5 D-GA处理对番茄果实乙烯生成的影响
为了进一步了解PG对乙烯生成的调节作用，本课题采用PG降解产物D-半乳糖醛酸(D-GA，处理浓度100 mg/L)处理未熟期番茄果实。结果表明(图6)D-GA处理后第2天番茄果实已达绿熟期，乙烯释放量明显增加；对照果实仍保持较低的乙烯释放量。处理后第6天果实的乙烯生成量比对照高73%，此时乙烯释放量达到峰值；处理后第8天果实全红，乙烯释放量也随之下降，此时对照果实呈现粉红色，乙烯释放量缓慢上升到峰值，图5 不同成熟阶段转反义PG基因番茄和野生型番茄果实的LeETR4和LeERF2 基因的表达
Fig.5 Expression of LeETR4 and LeERF2 in antisense PG and wild-type tomato at different stages
随后开始下降。由此可见，D-GA 处理促进了乙烯生成，并使得乙烯高峰提前出现。
2.6 D -GA 处理对番茄果实PG 、Le ERF2和LeETR4基因表达的影响
未成熟番茄果实中LeERF2基因在D-GA 处理后2 d 表达水平迅速提高，之后一直保持较高水平。 LeETR4和PG 基因在D-GA 处理后4~6 d 表达信号明显增强(图7)。 这表明D-GA 处理在促进番茄果实中PG 基因表达的同时，也能促进乙烯受体基因LeETR4和乙烯反应结合因子LeERF2的表达。
3 讨论
果实成熟是一个高度协调的遗传调控和生化变化过程，是由多基因调控的复杂过程。乙烯广泛作用于植物各个生理过程。关于跃变型果实中乙烯对于PG 基因表达的调控研究，已有许多报告，在转反义ACC 氧化酶基因番茄果实中，乙烯合成受到抑制，PG 酶合成受阻(H a dfie ld 和
Bennett 1998, Smith 等1990); Sitrit 和Bennett(1998)认为番茄果实中PG 基因的转录和翻译都受乙烯调控。乙烯作用抑制剂硫代硫酸银也可以抑制PG 的mRNA 积累(Davies 等1988) 。近来在梨果实中的研究表明，在成熟后期PG 基因的表达也受乙烯诱导(Hiwasa 等2003)。但也有研究表明，在乙烯生成严重受阻的反义ACS 番茄果实中PGmRNA 仍然积累，表明PG 基因转录可能主要由其它因子而不
是乙烯调控(Oeller 1991, Theologis 等1993)。在本研究中发现，在绿熟期番茄果实中，PG 基因能被乙烯诱导表达，随着乙烯的积累PG 基因表达量增加，PG 酶活性提高；在转反义ACS 番茄果实和Nr 突变体番茄果实中由于乙烯合成和感受受阻，乙烯释放量很低，PG 基因表达被显著地抑制(图2)，PG 酶活性明显低于野生型番茄(图1B)。外源乙烯和1-MCP 处理实验表明乙烯影响PG 基因的表达(图3)，进一步证实乙烯参与调控PG 基因表达和PG 酶活性变化，并具有诱导调控作用。P G 是影响果实成熟软化进程的重要因子，而在转反义PG 基因番茄得到后，许多实验又表明，PG 对于果实成熟软化并不是必要的(Sheehy 等1988，Smith 等1990) 。因此使得人们对于PG 在果实成熟中的确切作用产生怀疑。但是我们看到P G 基因在根、茎、叶、花、果实中都有表达，这说明PG 基因参与植物的生理代谢过程。PG 直接作用的果胶降解过程可能不是果实成熟的直接原因，但PG 有可能通过影响其它成熟因子的作用途径来参与调节果实成熟过程。Ber gey 等(1999)和Orozco-Cardenas 等(2001) 研究认为，番茄叶片在受到伤害协迫时，会发生一系列防卫反
应信号传导过程，在这个过程中发现PG 是位于维管束上的伤害早期表达基因，PG 基因的表达诱导第二信使产生并进一步激活叶肉细胞中的防卫基因PPO 、pis (proteinase inhibitors)等的表达。说明PG 还参与植物抗病反应。PG 基因的功能多样性使得研究者开始重新审视PG 在果实成熟中的作用，近来还有研究发现猕猴桃果实中一个PG 基因(CKPGC )在成熟阶段I 中有表达(Wang 等2000)，这为PG 基因在果实中的表达先于乙烯高峰和呼吸跃变提供了第一个例证。本研究表明改变PG 基因的表达会影响乙烯的生成和乙烯受体基因(如LeETR4)和LeERF2基因的表达(图5)。初步证明
图7 D-GA(100 mg/L)处理对未熟番茄果实 PG 、LeERF2和LeETR4基因表达的影响
Fig.7 Effect of D-GA(100 mg/L) on expression of PG , LeERF2and LeETR4 in immature tomato fruit
图6 D-GA(100 mg/L)处理对未熟番茄果实乙烯生成的影响Fig.6 Effect of D-GA(100 mg/L) on ethylene production in immature tomato fruit
PG基因的表达对于乙烯的生物合成和信号转导有影响。同时用PG酶反应降解产物D-GA处理未熟期番茄果实能刺激乙烯生成(图6)，虽然此时PG 基因表达水平很低，但仍有一定的PG酶活力，因此推测PG基因在果实成熟早期就有表达，其反应产物低聚半乳糖醛酸可能作为激活子诱导系统II 乙烯的产生，从而通过影响乙烯的合成和传导途径，与乙烯协同作用参与调控果实的成熟软化进程。早期表达的PG基因可能作为一种信号分子参与乙烯代谢或其它生理代谢的调控过程。本研究初步提出了PG基因影响乙烯生物合成和信号转导的可能性，更深入的作用机制还有待于进一步的研究。
致谢：1-MCP为中国农业大学食品学院姜微波老师惠赠。
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KOU Xiao-Hong 1 , ZHU Ben-Zhong 2, LUO Yun-Bo 2*, TIAN Hui-Qin 2, YU Bian-Y un 2
(1College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University , Taigu 030801, China; 2Department of Food Biotechnology, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University , Beijing 100083, China)
Abstract: Ethylene and PG (polygalacturonase)are both key plant growth regulators in fruit rip-ening process. The expression of PG was mark-edly inhibited in either antisense ACS tomato (Lycopersicon esculentum cv. Lichun) where endogenous ethylene synthesis was suppressed,or in Nr mutant in which ethylene perception was severely damaged. Also, the PG activities in fruits of these mutants (Fig.1A) were signifi-cantly lower than that of wild-type tomato (Fig.1B). PG gene expression was promoted in ma-ture green tomato fruit by exogenous ethylene 100 μL/L treatment for 4 h, and was inhibited significantly in breaking tomato fruit after being treated with 1-MCP (1-methylcycloprane) 1 μL/L (Fig.3), a specific ethylene reception inhibitor.Ethylene production of antisense PG tomato fruit during 45-50 DAP was lower than that of wild-type tomato (Fig.4), and the level of transcrip-tional expression of both the ethylene receptor
gene LeETR4 and the ethylene response factor gene LeERF2 were lower in this transgenic to-mato fruit (Fig.5). Ethylene production and the expression of LeETR4 and LeERF2 were both promoted by treatments with D-GA 100 mg/L, a product of enzymatic degradation of PG, in im-mature tomato fruit (Fig.6 and Fig.7). The rela-tionship of PG and ethylene in tomato fruit in this study provided forceful evidences to sup-port the mechanism by which PG and ethylene synergistically regulated climacteric fruit ripen-ing and softening.
Key words : polygalacturonase (PG); ethylene; fruit ripening;D-galacturonic (D-GA); regulation
This work was supported by National Natural Science Foundation of China (Nos. 30270934, 30371004) and t he State Key Basic Research and Development Plan of China (No. G1999011701).
*Corresponding author (E-mail: lyb@https://www.wendangku.net/doc/a611888893.html,).