实验七血红蛋白

实验七脱辅基血红蛋白的制备和重组

一、实验目的

1.了解生物化学中典型的血红蛋白的性质和结构以及结合在蛋白上的辅基的作用。

2.学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质代换金属离子的方法。

3.学习快速扫描分光光度计的使用及紫外可见吸收光谱的应用。

4.学习柱层析和透析袋脱盐的方法。

二、实验原理

血红蛋白(Hemoglobin)是由二价铁Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种结合蛋白，它是由四个亚基组成的四聚体，分子量大约为65000。四个亚基中，两个亚基具有相同的氨基酸序列，称为α—亚基，每条链含141个氨基酸，另外两个氨基酸序列相同的亚基，称为β—亚基，各含146个氨基酸。两种亚基有其各自的二级、三级空间结构，亚基之间以非共价键结合在一起。每个亚基中均含有一个血红素辅基，血红素是一个铁原卟啉Ⅳ，它处于一个疏水环境，此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着非常重要的作用。Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2价还原态存在的，若被氧化成Fe(Ⅲ)，则称为高铁血红蛋白，它就失去了可逆载氧功能。

血红素辅基与血红蛋白均以非共价键相连，其中包括Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8His)上的Nε上的配位键；卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白氨基酸侧链之间的盐桥；以及卟啉环中乙烯基与蛋白的疏水相互作用。在酸性条件下，由于蛋白的变性而使这些作用变得很弱，以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。利用高铁血红素在丁酮中的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质，用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋白分离。分离得到的脱辅基血红蛋白(ApoHb)可以用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、钴卟啉、铜卟啉等)进行重组，生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。

由于高铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱中，在405nm处有很强的特征吸收峰，而脱辅基血红蛋白只在280nm处有蛋白的特征吸收峰，当将高铁血红素加入ApoHb溶液中后，重组成功的高铁血红蛋白又会在405nm处出现它的特征吸收峰，因而血红蛋白的脱辅基与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测。

三、实验方法

1. 氧合血红蛋白的制备(供全班学生使用)

在市血站购买一袋人血，用高速冷冻离心机4000r/min离心10min，取下层血球加四倍体积的0.9% NaCl洗血球，再用4000r/min离心10min，如此重复2～3次，取下层血球，按1∶1(v/v)体积比加甲苯，振荡2分钟以上，使血球破膜，8000r/min离心20min，弃去上层甲苯和中层脂肪，取下层血球沉淀，加10分之一沉淀体积的9% NaCl，激烈振

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荡混合，4000r/min离心10min，弃沉淀，取上层红黑色血红蛋白溶液，再用8000r/min 离心10min，弃上层，取下层血红蛋白溶液用滤纸过滤，因过滤很慢，可放4℃冰箱内过滤过夜，然后装透析袋，4℃对H2O透析除NaCl和甲苯，换2～3次予冷的H2O，由透析袋内取出血红蛋白溶液置入一锥形瓶，取样分析血红蛋白(Hb)的浓度：取5μl Hb，加3.0ml H2O(稀释601倍)，用分光光度计作250nm～700nm的扫描，并检测Hb在415nm、541nm和576nm处的三个特征峰值：A415、A541和A576，已知这三个特征峰的吸光系数值为：

ε415 =125 l/mmol、ε541 =13.5 l/mmol、ε576 =14.6 l/mmol。

由公式：浓度C=(A×稀释倍数)/ ε，即可计算出制备的氧合血红蛋白Hb的浓度C Hb。

2. 氧合血红蛋白(Hb)氧化成高铁血红蛋白

取已知浓度(约3～6 mmol/L)的氧合血红蛋白2 ml，置于5 ml小烧杯或10 ml试管内放入冰浴，用下式计算需加入过量1.3倍的K3Fe(CN)6 的量(10mg/ml)(Mw=329.26)：用移液管吸取所需加入的K3Fe(CN)6，在缓慢搅拌下滴入Hb内，直到血红蛋白的颜色从鲜红色变成棕黑色。

装一根1.8cm×22cm的Sephadex G-25凝胶脱盐柱，用10mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡脱盐柱，将制成的高铁血红蛋白溶液全部上柱，用4℃H2O洗脱，用量筒收集高铁血红蛋白，再用H2O将其稀释至1.0～1.5mmol/L (因为过浓不利于脱辅基，太稀又会脱不完全)，记录总体积，取样稀释200～300倍，作250～700nm的扫描，得重组前高铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱图，检测峰值A405。

3.脱辅基(以下步骤均在冰浴或4℃下进行)

高铁血红蛋白用1.0mol/L HCl粗调，再用0.1mol/L HCl细调溶液pH=1.8～2.0 (这一步是关键，pH太高，脱辅基不完全，pH过低蛋白会变性)，将溶液置入具塞试管内，加入等体积予冷丁酮，手摇振荡萃取，静止分层，弃上层丁酮，取下层溶液，如此反复萃取几次，直至上层丁酮无色为止。

取下层浅绿色脱辅基后蛋白溶液装透析袋，4℃对1L 5 mmol/L NaHCO3透析0.5～1 h，以除HCl，再对H2O(4℃)透析两次，以除丁酮，再对4℃200 ml 0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液透析1 h，中间取出透析袋倒置二次（此时会出现少量白色变性蛋白沉淀）。

取出袋内溶液，用8000r/min离心10 min(4℃)，取上层清液，测体积(脱辅基血红蛋白ApoHb)，立即存于冰浴。取样稀释10～20倍，作250nm-700nm扫描，作峰检测得A278蛋白吸收峰值，(以0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液作参比)。计算脱辅基血红蛋白(ApoHb)的浓度C ApoHb：

（ApoHb的ε278=13.1 L/mmol）

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4. 重组高铁血红蛋白

取3.0ml ApoHb，用0.01mol/L NaOH配制5mg/ml的高铁血红素(Hemin，Mw=651.5) ，计算Hemin的加入量(过量1.5倍)：

缓慢搅拌下，用10～15min滴加所需体积的Hemin到3.0ml ApoHb中，并在冰浴中再放置1 h，用1mol/L NaOH粗调和0.1mol/L NaOH细调溶液pH=9～10，溶液颜色变为棕黑色。

再用G-25脱盐柱脱去过量的Hemin等，脱盐柱用0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液平衡和洗脱，用量筒收集重组后的高铁血红蛋白，测量总体积，取样稀释后作250nm～700nm 扫描，测峰值A405，最后计算重组率：

由扫描所得的各个紫外可见吸收光谱图，可以清楚地看到血红蛋白脱辅基前后和重组后的效果。

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血红蛋白的测定方法

血红蛋白的测定方法 血红蛋白是一种色素蛋白，可以用比色法测定。血液中血红蛋白以各种形式存在，包括氧合血红蛋白、碳氧血红蛋白、高铁血红蛋白或其他衍生物。 1）氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定法：血液中除了SHb以外，其他各种血红蛋白均可被试剂转化、生成HiCN，其最大的吸收峰为540nm波长，可经比色测定。此法为国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐的国际标准参考方法，操作简单，显色快且结果稳定医`学教育网搜集整理；但本法试剂中KCN有剧毒，测定过程中高白细胞和高球蛋白血症易致混浊，HbCO转化较慢。 2）十二烷基月桂酰硫酸钠血红蛋白（SLS-Hb）法：除SHb外，血液中各种Hb均可与低浓度十二烷基月桂酰硫酸钠（SLS）作用，生成SLS-Hb棕红色化合物。SLS-Hb最大吸收波峰538nm，波谷500nm，肩峰560nm.由于摩尔消光系数尚未最后确认，因此不能用吸光度“A”值直接计算血红蛋白浓度。本法操作简单，呈色稳定，准确性和精确性符合要求，且无公害。但SDS质量差异较大，并且SDS可破坏白细胞，不适合进行白细胞计数的血液分析仪使用。 3）叠氮高铁血红蛋白（HiN3）测定法：与HiCN法相似，但仍然有公害问题。 4）碱羟血红蛋白（AHD 575nm）测定法：试剂简单、不含有毒试剂、呈色稳定，但由于其吸收峰在575nm，限制了此法在血液分析仪的使用。 5）溴代十六烷基三甲胺（CTAB）血红蛋白测定法：该法试剂溶血性强又不破坏白细胞，可同时进行白细胞计数，可用于血细胞分析仪自动检测Hb和白细胞。缺点是对Hb测定结果的准确度和精密度较低。 近年来，多参数血细胞分析仪的应用，使Hb测定逐步以仪器法取代手工法，其优点是操作简单、快速，同时可以获得多项红细胞的参数，血液分析仪法测定血红蛋白的原理与手工法原理相似，多采用HiCN法，但由于各型号仪器使用的溶血剂不同，形成Hb的衍生物不同医`学教育网搜集整理。某些溶血剂形成的衍生物稳定性较差，因此要严格控制溶血剂加入量及溶血时间，特别是半自动血细胞分析仪应严格控制实验条件。有些溶血剂内虽加入了KCN，但其衍生物并非是HiCN，仪器要经过HiCN标准液校正后，才能进行Hb测定。仪器法测定血红蛋白精确度CV约为1%.

临床生化检验部分复习试题a

临床生化检验部分复习试题 一、选择题(最佳答案) 1、下列说法正确的是 ⑴、高密度脂蛋白胆固醇是好胆固醇，⑵、氧化酶法测定血清胆固醇所用比色波长为340纳米，⑶、低密度脂蛋白胆固醇是好胆固醇，⑷、反映心肌损伤时肌红蛋白比肌钙蛋白特异性强，⑸、心肌肌酶谱中的CK增高就一定是心肌炎。（1） 2、下列说法错误的是(2) ⑴各种炎症时都伴有CRP增高，⑵、超敏CRP增高是动脉硬化的直接原因，⑶、超敏CRP增高是动脉硬化的病人出现心梗的标志，⑷、超敏CRP增高是冠心病人出现心梗的危险标志，⑸、CRP和超敏CRP本质是一样的。（2） 3、高密度脂蛋中含量最高的载脂蛋白是（1） ⑴、载脂蛋白A，⑵、载脂蛋白B，⑶、载脂蛋白C，⑷、载脂蛋白D，⑸、载脂蛋白E。 4、低密度脂蛋白中含量最高的载脂蛋白是（2） ⑴、载脂蛋白A，⑵、载脂蛋白B，⑶、载脂蛋白C，⑷、载脂蛋白D，⑸载脂蛋白E。 5、急性胰腺炎时血清淀粉酶增高峰值多在（5） ⑴、发病后2小时，⑵、发病后6~8小时，⑶、发病后9~10小时，⑷、发病后5~7小时，⑸、发病后12~24小时。 6、下列说法错误的是（1） ⑴、胰腺癌患者血清淀粉酶一定升高，⑵、暴饮是急性胰腺炎诱发因素之一，⑶、胰腺癌的病人CA199有可能增高，⑷、腮腺炎的病人血清淀粉酶升高，⑸、CEA升高可能为胃癌。 7、反映红细胞膜异常的试验是（1） ⑴、红细胞渗透脆性试验，⑵、酸洗脱试验，⑶、高铁血红蛋白还原试验，⑷、血红蛋白电泳，⑸、网织红细胞计数。 8、反映红细胞膜内酶缺泛的试验是（3） ⑴、红细胞渗透脆性试验，⑵、酸洗脱试验，⑶、高铁血红蛋白还原试验，⑷、血红蛋白电泳，⑸、网织红细胞计数。 9、反映红细胞血红蛋白结构异常试验是（4） ⑴、红细胞渗透脆性试验，⑵、酸洗脱试验，⑶、高铁血红蛋白还原试验，⑷、血红蛋白电泳，⑸、网织红细胞计数。 10、反映红细胞破坏加速首选的试验是（5） ⑴、红细胞渗透脆性试验，⑵、酸洗脱试验⑶、高铁血红蛋白还原试验，⑷、血红蛋白电泳， ⑸、网织红细胞计数。 11、VMA是（2） ⑴、肾上腺素的代谢产物，⑵、去甲肾上腺素的代谢产物，⑶、多巴胺的代谢产物，⑷、盐皮质激素的代谢产物，⑸、糖皮质激素的代谢产物。 12、醛固酮是（2） ⑴、肾上腺髓质产生，⑵、肾上腺皮质产生，⑶、甲状腺产生，⑷、甲状旁腺产生，⑸、肾上腺产生。 12、下列说法错误的是（5） ⑴、尿HCG增高；早期妊娠，⑵、尿HCG增高；异位妊娠，⑶、血HCG增高可能为肺癌， ⑷、血HCG异常高可能为葡萄胎，⑸、尿HCG增高可能为子宫癌。 13、低钾的病人常伴有（2）

血红蛋白含量测定

血红蛋白含量测定 血红蛋白是红细胞的主要成分，在正常情况下，每个红细胞均含有一 定量的血红蛋白。血红蛋白是由珠蛋白和亚铁血红素组成的结合蛋白质。 血红蛋白除能与氧结合形成氧合血红蛋白外，尚能与某些物质作用形成多 种血红蛋白衍生物。它们具有特定的色泽和吸光谱，在临床上，可用以诊 断某些变性血红蛋白血症和血红蛋白的定量测定。 ●仪器型号：Sysmex KX-21型多项目自动血球计数仪器 Sysmex XE-2100型多项目自动血球分析装置 ●检测原理： 一、Sysmex KX-21 在自动检测法中的血红蛋白测量以氰化正铁血红蛋白法或氧合血红 蛋白法为主流。但这种方法血红蛋白转化速度慢，其处理液应进行妥善处 理，以及环境方面的考虑，并不是一种令人满意的测量法。无氰HGB测量 法与氧合血红蛋白法相同，其血液中的血红蛋白转化成氧合血红蛋白，且 不含剧毒物。另外，由于可以测量正铁血红蛋白，如质控血那样的含有正 铁血红蛋白的血液也可正确进行测量。 二、Sysmex XE-2100 集中于氰化高铁血红蛋白测定法和氧化血红蛋白测定法的优点，不使 用毒性物质，使该方法成为自动检测的一个合适的方法。同时，由于该方

法可以用测量氰化高铁血红蛋白，所以该方法也可以准确的测量含有高铁 血红蛋白的血液。

●试剂： 一、Sysmex KX-21 ⑴稀释液 ⑵WBC/HGB用溶血剂 ⑶2％EDTA二钾溶液 二、Sysmex XE-2100 ⑴CELLPACK（EPK） ⑵SULFOLYSER（SLS） ●标本吸入量： 一、Sysmex KX-21: 全血模式50lμ 二、Sysmex XE-2100：⑴手工模式130lμ ⑵自动进样器模式200lμ ●静脉血采血方法： 抽取病人静脉血2ml，于EDTA三钾抗凝的真空采血管中（1.5mgEDTA-K3 ／ML）24小时室温保存。 ●操作步骤： 一、Sysmex KX-21 ⑴仪器在全血模式（WB）下 ⑵要在允许空白值内： WBC RBC HGB PLT 0.3?109/L 0.02?1012/L 1g/L 10?109/L

血红蛋白的提取和分离

专题5 DNA和蛋白质技术 课题3 血红蛋白的提取和分离 编制人：魏善春审核人：孙高宏包科领导： 【学习目标】 1、简述蛋白质提取和分离的基本原理 2、理解蛋白质提取与分离的实验操作过程 【重点与难点】 重点：蛋白质提取和分离的基本原理 难点：蛋白质提取与分离的实验操作（凝胶色谱操作）过程 【知识链接】 1.血红蛋白存在于何种细胞？其特性和作用分别是什么？ 2.为何不选用鸡血做实验材料？ 3.分离不同种类蛋白质的依据是什么？ 【自主学习内容一】基础知识（记忆） 1．凝胶色谱法：凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时的速度不同，相对分子质量较小的蛋白质由于能够路程较，移动速度；而相对分子质量较大的的蛋白质，只能在移动，路程，移动速度。 2．缓冲液缓冲液通常是由1～2种缓冲剂（如NaHCO3、（NH4）2SO4）溶解于水中配制而成；其作用是。 3．电泳：电泳是指电泳利用了待分离样品中各分子以及，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是和。在测定蛋白质分子量时通常使用，其中SDS的作用是，。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它以及等因素。【自主学习内容二】实验操作（凝胶色谱法） 1.蛋白质的提取和分离一般分四步：、、和。 2.样品处理 （1）红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是采

集的血样要及时通过采用的方法使红液分层，用胶头吸管吸出上层透明的黄色，将下层红细胞倒入烧杯，再加入，缓慢搅拌低速离心，如此重复三次，直到，表明红细胞忆洗涤干净。注意：离心转速及离心时间不能过长，否则，达不到分离效果。 （2）血红蛋白的释放：原理是当外界溶液浓度低于细胞内液浓度时，细胞，红细胞由于没有的保护，而，释放出血红蛋白；使用的试剂是。 （3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明的液体，这是，第4层是红细胞破碎物沉淀物（其他杂质，呈色）。将试管中的液体用滤纸过滤，除去，于分液漏斗中静置片刻后，分出层的红色透明液体。 （4）透析：取2mL的血红蛋白溶液装入中，将透析袋放入盛有300mL的物质量浓度为中（pH为），透析12h。透析可以去除样品中的杂质，或用于。 3．凝胶色谱操作 首先要；第二步是，因为，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有，避免影响分离效果；第三步是。【合作探究】 1．凝胶色谱分离蛋白质的原理是怎样的？ 2.根据凝胶色谱分离的原理分析，在装填凝胶时要紧密、均匀的原因。 【学习反思】

健康评估 溶血性贫血实验室检查

一、红细胞破坏过多的检查 1.外周血液常规红细胞计数、血红蛋白含量减低，血涂片中可见破碎红细胞、异形红细胞等。出现 典型的异形红细胞或自身凝集现象时，可提供溶血原因的线索。 2.血浆游离血红蛋白测定意义正常血浆只有微量游离血红蛋白，>40mg/L是溶血尤其是血管内溶血 的重要指标，如阵发性睡眠血红蛋白尿、血型不合输血反应等。血管外溶血，如遗传性球形细胞增多症，一般不增高。 3.血清结合珠蛋白测定（Hp）意义 1.血清结合珠蛋白降低见于： ⑴各种溶血性贫血，包括血管内或血管外溶血； ⑵肝细胞损害、传染性单核细胞增多症、先天性无结合珠蛋白血症等。 2.血清结合珠蛋白增高见于感染、组织损伤、肝外阻塞性黄疸、恶性肿瘤等。 4.血浆高铁血红素白蛋白试验意义本试验有助于鉴别血管内或血管外溶血，阳性表示严重血管内溶 血。如阵发性睡眠性血红蛋白尿时，出现一条高铁血红素白蛋白区带，而球形细胞增多症系血管外溶血则无此区带。 5.尿液检查 ⑴尿胆原排出增多； ⑵隐血试验阳性，这是因为当血浆游离血红蛋白显著增高，超过结合珠蛋白的量和肾小管再吸收 功能时，出现的血红蛋白尿； ⑶尿含铁血黄素试验呈阳性反应，是反映慢性溶血，尤其是血管内溶血。 6.红细胞寿命测定是检测溶血的可靠指标，常用51Cr、3P-DFP或二异丙基氟磷酸标记红细胞法， 能反映红细胞寿命的指数。此项测定显示红细胞寿命缩短表明有溶血。 二、红细胞代偿性增生的检查 1.网织红细胞增多在5%～20%以上。 2.外周血出现幼红细胞，主要是晚幼红细胞。由于网织红细胞及幼红细胞的出现，故可表现大红细 胞增多。 3.骨髓幼红细胞显著增生，以中幼红和晚幼红细胞增生为主，粒红比例常发生倒置。 三、红细胞膜缺陷的检查 1.红细胞渗透脆性试验意义 1. 红细胞渗透脆性增高见于：遗传性球形细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血伴继发球形细胞增 多等。 2.红细胞渗透脆性减低见于：缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血等。 2.红细胞孵育渗透脆性试验意义本试验对轻型遗传性球形细胞增多症的检出敏感，也见于丙酮酸激 酶缺乏症等酶缺陷的溶血性贫血。 3.自身溶血试验及纠正试验意义 1. 遗传性球形细胞增多症，在低渗盐水中溶血显著增强，加葡萄糖后溶血明显纠正，加ATP后溶 血明显纠正。 2. 先天性非球形细胞溶血性贫血Ⅰ型（G-6-PD缺乏症），低渗盐水中正常或溶血稍增强，加葡 萄糖后溶血部分纠正，加ATP后溶血部分纠正。

糖化血红蛋白(HbA1c)测定原理方法及临床意义

糖化血红蛋白（HbA1c）测定的原理方法与仪器解析及临床意义 糖化血红蛋白（HbA1c）测定的原理方法与仪器解析及临床意义 糖尿病目前在世界上发病率很高，占免疫病的比率，在发达国家高达2-5%，而我国糖尿病的发病率亦达 2-3%，并且每年还以1‰的速度增长。糖尿病是一种终生性疾病，其并发症是至残至死的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。临床上广泛采用血糖参数来判定糖尿病，而血糖参数只代表抽血时的血糖水平，对确诊有局限性。近年来的医学研究证明：血液中的糖化血红蛋白（HbA1c）浓度相对稳定，其浓度值能准确反映最近1-3个月期间的血糖水平，便于医生对糖尿病进行早期诊断；也可用于糖尿病人的血糖监控及慢性并发症的判断等，受到临床的广泛重视，目前我国各大、中型医院正逐渐开展糖化血红蛋白（HbA1c）占总血红蛋白（Hb）的百分含量的测定项目。有些发达国家已将HbA1c的测定列入中老年人的常规体检项目。测定HbA1c比较常用的方法，目前有乳胶凝集反应法和离子交换高压液相色谱法两种，分别用生化分析仪和糖化血红蛋白自动分析仪进行测定。 1HbA1c的临床意义 糖化血红蛋白是一项说服力较强、数据较客观、稳定性较好的生化检查，不受偶尔一次血糖升高或降低的影响。能反应糖尿病患者2-3个月以内的糖代谢状况，同时与糖尿病并发症尤其是微血管病变关系密切，在糖尿病学上有重要的临床参考价值。 1．1增高：测定HbA1c可以了解糖尿病人在2～3个月的血糖控制情况。此外，用含葡萄糖的透析液作血透的慢性肾衰病人，地中海贫血和白血病病人亦增高。 1．2降低：溶血性及失血性贫血，慢性肾衰，慢性持续性低血糖症等。 1．3作为糖尿病的病情监测指标 1．3．1作为轻症、Ⅱ型、“隐性”糖尿病的早期诊断指标。 1．3．2不是诊断糖尿病的敏感指标，不能取代现行的糖耐量试验。 1．3．3可以列为糖尿病的普查和健康检查的项目。 1．4当HbA1c＞9％时，说明患者存在着持续性高血糖，可以出现糖尿病肾病、动脉硬化、白内障等并发症。临床经常以糖化血红蛋白作为监测指标来了解患者近阶段的血糖情况，以及估价糖尿病慢性并发症的发生与发展情况。 1．5对预防糖尿病孕妇的巨大胎儿、畸形胎、死胎，以及急、慢性并发症发生发展的监督具有重要意义。1．6对于病因尚未明确的昏迷或正在输注葡萄糖（测血糖当然增高）抢救者，急查糖化血红蛋白具有鉴别诊断的价值。 1．7对于糖化血红蛋白特别增高的糖尿病患者，应警惕如酮症酸中毒等急性合并症的发生。 2临床常用的测定糖化血红蛋白HbA1c的方法 2．1乳胶凝集反应法 乳胶凝集反应法是利用抗原抗体直接测定总血红蛋白Hb中的糖化血红蛋白HbA1c的百分含量。目前有国内外几家厂商可以提供HbA1c测定的试剂盒。这种免疫反应是由被测血样品中的总Hb和HbA1c与试剂中的抗体结合而形成凝集，凝集量随HbA1c浓度的大小而变化。使用生化分析仪器来进行比浊测定HbA1c的浓度，采用终点法，生化仪通过测定反应液的吸光度值，可直接反映出凝集量的多少；推算出

实验诊断学习题-贫血溶血性贫血

贫血、溶血性贫血 1．在诊断遗传性球形细胞增多症时，最没必要做的检测是D A．红细胞渗透脆性试验 B．红细胞渗透脆性孵育试验 C．自身溶血试验及纠正试验 D．氰化物-抗坏血酸试验 E．酸化甘油溶血试验 2、下列有配伍正确的是E A．自身免疫性溶血性贫血——Ham 试验阳性可确诊 B．遗传性球形细胞增多症——冷热溶血试验阳性 C．PNH——蔗糖溶血试验阳性可确诊D．G6PD缺陷症——高铁血红蛋白还原试验还原率增高 E．PK缺陷症——自身溶血试验溶血不能被葡萄糖纠正 3、下列用于诊断红细胞膜缺陷性溶血的指标中，何项除外E A．自身溶血试验及纠正试验 B．红细胞渗透脆性试验 C．红细胞孵育渗透脆性试验 D．酸化甘油溶血试验 E．冷热溶血试验 4、典型的缺铁性贫血属于D A．大细胞性贫血 B．正细胞正色素性贫血 C．单纯小细胞性贫血 D．小细胞低色素性贫血 E．大细胞低色素性贫血 5、女性，18岁，Hb80g/L，属于C A．正常 B．轻度贫血 C．中度贫血 D．重度贫血 E．极重度贫血 6、血管内溶血的特征不包括A A．血清结合珠蛋白升高B．尿胆原升高 C．血清游离血红蛋白明显升高 D．间接胆红素明显升高 E．高铁血红素白蛋白复合物出现 7、下列不属于遗传性红细胞内在缺陷的疾病是 D A．G6PD缺陷症 B．α-珠蛋白生成障碍性贫血 C．遗传性椭圆形红细胞增多症 D．PNH E．异常血红蛋白病 8、贫血的Bessman分型是按照以下何项指标进行的B A．MCV、MCH和MCHC B．MCV和RDW C．MCH和RDW D．MCHC和RDW E．Hct和MCV 9、营养性巨幼细胞贫血属于A A．大细胞性贫血 B．正细胞正色素性贫血 C．单纯小细胞性贫血 D．小细胞低色素性贫血 E．小细胞高色素性贫血 10、判断是否贫血，应该看以下何项指标C A．MCV、MCH和MCHC B．Hct和RDW C．RBC、Hb和Hct D．RBC、WBC和BPC E．网织红细胞数和Hb 11．RDW是A A．红细胞容积分布宽度 B．红细胞比容 C．平均红细胞体积 D．平均红细胞血红蛋白含量 E．平均红细胞血红蛋白浓度 12、判断贫血严重程度的指标是B A．RBC

血红蛋白尿(专业知识值得参考借鉴)

本文极具参考价值，如若有用请打赏支持我们！不胜感激！ 血红蛋白尿(专业知识值得参考借鉴) 一概述血红蛋白尿（hemoglobinuria）指尿中含有游离血红蛋白而无红细胞，或仅有少许红细胞而含有大量游离血红蛋白的现象。反映了血管内有超出正常的溶血。由于尿中血红蛋白含量不等尿色可以呈红色、浓茶色，严重时呈酱油色。患者因疾病病因不同可表现不同症状，如阵发性睡眠性血红蛋白尿患者的血红蛋白尿容易清晨第一次尿出现。蚕豆病有进食蚕豆史或在蚕豆开花季节发生。溶血严重时常伴贫血、黄疸，肝、脾大。根据引起血红蛋白尿的原发疾病，针对病因进行治疗。二病因及常见疾病1.尿路中溶血 若尿相对密度低于1.006，则红细胞在尿中溶解，尿色呈红色称假性血红蛋白尿。 2.肾梗塞 在梗塞区域产生溶血，此种血红蛋白尿的特点是血中与珠蛋白结合的血红蛋白和游离的血红蛋白均属正常，和血管内溶血引起真正血红蛋白尿容易区别。 3.血管内溶血 是血红蛋白尿最重要最常见的原因,具体如下： （1）红细胞先天缺陷所致的溶血性贫血。 （2）血型不合：输血反应。 （3）细菌感染：见于败血症、感染性细菌性心内膜炎；原虫感染常见恶性疟疾，此病又称黑尿热。（4）药物和化学制剂所致溶血：如奎宁、奎尼丁、氯丙嗪、非那西汀等药物。化学制剂及重金属盐类常见苯肼、硝基苯、苯胺、砷、砷化氢，铅等。 （5）动植物因素引起血管内溶血：见于毒蛇咬伤，毒蕈中毒。 三检查实验室检查对确定溶血性贫血的存在和原因有决定性价值，根据临床最大可能地进行相应的特殊试验，如酸溶血、热溶血、冷溶血以及红细胞震荡试验等，以便确定具体疾病的诊断。红细胞脆性试验可作为初步检查。血常规除贫血外，网织红细胞增加是特点，周围血象出现幼稚红细胞，骨髓检查红系列增生活跃，而粒系列、巨核系列正常。 四鉴别诊断1.阵发性睡眠性血红蛋白尿 是一种获得性红细胞内在缺陷慢性溶血性贫血。血红蛋白尿（酱油样尿）的发生直接与睡眠有关（不止限于夜间睡眠）。酸溶血试验阳性（Ham试验）有确诊意义。卢斯试验阳性（ROuS试验）尿沉渣

血红蛋白检测试剂盒(比色法)

血红蛋白检测试剂盒(比色法) 简介： 血红蛋白(Hemoglobin ，Hb 或HGB)是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质，是能使血液呈红色的蛋白。血红蛋白由四条链组成，两条α链和两条β链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。Hb 在氧含量高的区域，容易与氧结合；在氧含量低的区域，又容易与氧分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞具有运输氧的功能。 Leagene 血红蛋白检测试剂盒(比色法)( Hemoglobin Colorimetric Assay Kit)在酸性条件下产物呈红色，吸收峰在530nm ，产物红色越深，说明Hb 含量越高，反之则越低，通过分光光度比色法测定530nm 处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出血清血红蛋白含量水平。该试剂盒主要用于检测溶血血清样本，亦可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液等中血红蛋白含量。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制检测工作液： ① 配制显色工作液：取Hb Assay buffer 至室温，取显色底物溶解于Hb Assay buffer ， 即为显色工作液。 ② 配制标准品工作液。 2、 准备样品： ① 溶血标本血清：溶血血清按照常规方法制备后，-80℃冻存。使用时用生理盐水稀 释100倍。 ② 细胞或组织样品：取恰当的细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速 离心取上清，-80℃冻存。 3、 加样：按照下表设置96孔板空白对照、标准品、待测样品，溶液应按照顺序依次加入， 并注意避免产生气泡。如果样品中的血红蛋白含量过高，可以减少样品用量或适当稀释 编号 名称 TC0205 50T TC0205 100T Storage 试剂(A): Hb Assay buffer 2.5ml 5ml -20℃ 避光 试剂(B): 显色底物 100μl ×2 100μl ×3 RT 试剂(C): Acid Assay buffer 10ml 20ml RT 试剂(D): Hb(1mg/ml) 10μl ×2 10μl ×3 -20℃ 试剂(E): ddH 2O 1ml 1ml RT 使用说明书 1份

高中生物选修一血红蛋白的提取与分离练习

血红蛋白提取与分离原理 一、选择题(每小题 4 分，共20分) 1．利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是 ( ) 。 A ?相对分子质量大的 B ?溶解度高的 C.相对分子质量小的 D .所带电荷多的 解析相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。 答案A 2.将经处理破裂后的红细胞混合液以 2 000 r/min 的速度离心10 min 后，离心管中 的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是 ( ) 。 A .血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层 B .甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层 C.脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层 D .甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层 解析混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第 4 层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。 答案D 3.下列关于电泳的说法不正确的是 ( ) 。 A .电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B .带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少 D .用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大 小 解析蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质一SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超

过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 答案C 4?已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如下图所示。下列叙述正确的是 ()。 k相对分子质量 丙. ?丁?戊 0 电荷基 A ?将样品装入透析袋中透析12 h,若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内 B ?若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快 C?将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也 存在于沉淀中 D ?若五种物质为蛋白质，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子， 则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近 解析透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不 能透过，乙保留在袋内，甲则不一定保留在袋内；凝胶色谱柱分离时，相对分子质 量小的物质路程长、移动慢；离心时相对分子质量大的物质先沉淀，戊沉淀，则 乙、丁、丙均已沉淀；用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率主要 取决于分子大小。 答案C 5.下面说法不正确的是 ()。 A .在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸、碱对溶液pH的影响，维持 pH基本不变 B .缓冲溶液通常由1?2种缓冲剂溶解于水中配制而成 c?电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 D ?透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内 解析透析袋一般是用硝酸纤维素（又叫玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由进

溶血性贫血的实验室检查

溶血性贫血的实验室检查 一、红细胞破坏过多的检查 1. 外周血液常规红细胞计数、血红蛋白含量减低，血涂片中可见破碎红细胞、异形红细胞等。出现典型的异形红细胞或自身凝集现象时，可提供溶血原因的线索。 2. 血浆游离血红蛋白测定意义正常血浆只有微量游离血红蛋白，>40mg/L是溶血尤其是血管内溶血的重要指标，如阵发性睡眠血红蛋白尿、血型不合输血反应等。血管外溶血，如遗传性球形细胞增多症，一般不增高。 3. 血清结合珠蛋白测定（Hp）意义 1. 血清结合珠蛋白降低见于： ⑴各种溶血性贫血，包括血管内或血管外溶血； ⑵肝细胞损害、传染性单核细胞增多症、先天性无结合珠蛋白血症等。 2. 血清结合珠蛋白增高见于感染、组织损伤、肝外阻塞性黄疸、恶性肿瘤等。 4. 血浆高铁血红素白蛋白试验意义本试验有助于鉴别血管内或血管外溶血，阳性表示严重血管内溶血。如阵发性睡眠性血红蛋白尿时，出现一条高铁血红素白蛋白区带，而球形细胞增多症系血管外溶血则无此区带。 5. 尿液检查 ⑴尿胆原排出增多； ⑵隐血试验阳性，这是因为当血浆游离血红蛋白显著增高，超过结合珠蛋白的量和肾小管再吸收功能时，出现的血红蛋白尿； ⑶尿含铁血黄素试验呈阳性反应，是反映慢性溶血，尤其是血管内溶血。 6. 红细胞寿命测定是检测溶血的可靠指标，常用51Cr、3P-DFP或二异丙基氟磷酸标记红细胞法，能反映红细胞寿命的指数。此项测定显示红细胞寿命缩短表明有溶血。 二、红细胞代偿性增生的检查 1. 网织红细胞增多在5%～20%以上。 2. 外周血出现幼红细胞，主要是晚幼红细胞。由于网织红细胞及幼红细胞的出现，故可表现大红细胞增多。 3. 骨髓幼红细胞显著增生，以中幼红和晚幼红细胞增生为主，粒红比例常发生倒置。 三、红细胞膜缺陷的检查 1. 红细胞渗透脆性试验意义

血红蛋白的提取和分离 基础知识

第15课时血红蛋白的提取和分离 1.归纳蛋白质多样性的原因 (1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。 (2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。 (3)图丙说明：氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。 (4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。 2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞含有血红蛋白，使红细胞呈现红色。 3.红细胞放到低渗溶液中，会吸收水分，体积膨胀直至涨破。

课堂导入 蛋白质是生命活动不可缺少的物质，随着基因组测序工作的完成，人们对蛋白质的研究和应用工作进入了新的时代，这就需要获得纯度较高的蛋白质。因此对蛋白质的分离就是生物学研究中经常要做的工作，下面我们就以血红蛋白的提取和分离来学习有关蛋白质的一些基本技术。

探究点一蛋白质分离技术 生物体内的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子的之间的差异来分离的。 1.蛋白质特性的差异 (1)分子的形状和大小； (2)所带电荷的性质和多少； (3)溶解度； (4)吸附性质； (5)对其他分子的亲和力。 2.分离的方法 (1)凝胶色谱法 Ⅰ.概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

Ⅱ.凝胶：是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。 Ⅲ.凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A) ①蛋白质混合物上柱； ②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外； ③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动； ④相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开； ⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。 (2)电泳 ①概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ②原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，

血红蛋白含量测定

血红蛋白含量测定 血红蛋白就是红细胞的主要成分,在正常情况下,每个红细胞均含有一定量的血红蛋白。血红蛋白就是由珠蛋白与亚铁血红素组成的结合蛋白质。 血红蛋白除能与氧结合形成氧合血红蛋白外,尚能与某些物质作用形成多 种血红蛋白衍生物。它们具有特定的色泽与吸光谱,在临床上,可用以诊断某些变性血红蛋白血症与血红蛋白的定量测定。 仪器型号:Sysmex KX-21型多项目自动血球计数仪器 Sysmex XE-2100型多项目自动血球分析装置 检测原理: 一、Sysmex KX-21 在自动检测法中的血红蛋白测量以氰化正铁血红蛋白法或氧合血红 蛋白法为主流。但这种方法血红蛋白转化速度慢,其处理液应进行妥善处理,以及环境方面的考虑,并不就是一种令人满意的测量法。无氰HGB测量法与氧合血红蛋白法相同,其血液中的血红蛋白转化成氧合血红蛋白,且不含剧毒物。另外,由于可以测量正铁血红蛋白,如质控血那样的含有正铁血红蛋 白的血液也可正确进行测量。 二、Sysmex XE-2100 集中于氰化高铁血红蛋白测定法与氧化血红蛋白测定法的优点,不使用毒性物质,使该方法成为自动检测的一个合适的方法。同时,由于该方法可以用测量氰化高铁血红蛋白,所以该方法也可以准确的测量含有高铁血 红蛋白的血液。

试剂: 一、Sysmex KX-21 ⑴稀释液 ⑵WBC/HGB用溶血剂 ⑶2％EDTA二钾溶液 二、Sysmex XE-2100 ⑴CELLPACK(EPK) ⑵SULFOLYSER(SLS) 标本吸入量: 一、Sysmex KX-21:全血模式50l 二、Sysmex XE-2100:⑴手工模式130l ⑵自动进样器模式200l 静脉血采血方法: 抽取病人静脉血2ml,于EDTA三钾抗凝的真空采血管中(1、5mgEDTA-K3／ML)24小时室温保存。 操作步骤: 一、Sysmex KX-21 ⑴仪器在全血模式(WB)下 ⑵要在允许空白值内: WBC RBC HGB PLT 0、3109/L 0、021012/L 1g/L 10109/L ⑶检测质控数值合格。 ⑷标本的测量:将待测标本充分混均,然后将吸液管放进待测标本试

血红蛋白测定实验

血红蛋白测定实验 一、实验目的与任务 了解XF—1B型（或Hb—2000型）血红蛋白仪的使用方法，掌握血红蛋白的测定技术。有训练运动员在较好训练效果的影响下血红蛋白正常值高于正常成年人，因此，血红蛋白的测定是评定训练效果的重要指标。 二、原理 测定血红蛋白的方法很多，常见的有直接比色，光电比色法，沙利氏比色法（间接比色法）。 我们现在实验室用的是XF—1B型和Hb—2000型血红蛋白仪。此仪器是采用氰化高铁法，应用光电比色的原理测定血红蛋白值的，其原理是：将全血样品20ul注入5ml氰化高铁血红蛋白稀释液内（亦称文—齐氏液），作251倍稀释，溶化红细胞释出血红蛋白。稀释剂将血红蛋白先转变成高铁血红蛋白，再转化为氰化高铁血红蛋白。然后，再用XF—1B 型（或Hb—2000型）Hb仪比色法直接测定显示浓度数，不需任何换算（每次测定只需5秒钟）。 三、实验器材 XF—1B型和Hb—2000型血红蛋白仪、一次性血细胞吸管（刻度10～20ul）、采血针、75%酒精、消毒棉球、培养皿、烧杯、可调加液器、试管架、血红蛋白测定试剂（文—齐氏液）、氰化高铁血红蛋白标准液。 四、实验步骤 1、插上电源，打开血红蛋白仪电源开关，按动进样开关，重复三次吸入蒸馏水，并通电预热20～30分钟。观察显示是否为“零”。（按出Hb仪器左下角“测试—定标”按键，使之处于“测试”状态。）

2、取试管一支，加入Hb测定试剂（文—齐氏液）5ml，放在试管架上备用。 3、采血、比色：先消毒，再用采血针在耳垂或无名指尖处采血，用干棉球擦去第一滴血，待第二滴血自然流出一大滴时，用血细胞吸管取血液20ul（注意：吸管内不可有气泡，否则需重新采血）。擦去吸管外血液后，轻轻吹入测定管底部，并回吸数次洗净吸管，然后充分混合均匀。待5分钟后，置Hb仪上比色。 4、记录：直接读数，记录下来。 Hb值通常以每100 ml血液中含Hb若干克来表示。（g/ml）。 本仪器采用国际单位制（g/L），可直接显示Hb值（g/L）。 我国正常成人，男子约：120～150 g/L 女子约：110～140 g/L 男运动员不超过：170 g/L， 女运动员不超过：160 g/L。 五、注意事项 1、每人每次测试前应先将Hb仪进样处吸入蒸馏水，冲洗流通池。使显示数值为“000”。 2、比色前将仪器前部左下角“测试—定标”键置于测试状态。 3、Hb仪采样吸管一定要全部侵入液体中，避免气泡吸入，否则影响测定结果，若有气泡请重新操作测试一次。 4、若“零点”漂移绝对值>2g/L，需调整“调零”旋钮，使仪器显示回到“000”。

血红蛋白异常所致的贫血及其实验诊断题库1-1-8

血红蛋白异常所致的贫血及其实验诊断题 库1-1-8

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]红细胞镰变形试验可用于诊断下列哪种疾病（）. A.HbC B.HbE C.HbH D.HbS E.HbBarts 镰状细胞贫血是常染色体显性遗传疾病，HbS在脱氧状态下，互相聚集，形成多聚体。纤维状多聚体排列方向与细胞膜平行，并与之紧密接触，当有足够的多聚体形成时，红细胞即由双面凹盘状变成镰刀形，此过程称"镰变"。镰状细胞贫血红细胞镰变形试验阳性。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]HbBarts的组成是（）. A.α2β2 B.α2γ2 C.α2δ2 D.γ4 E.δ4 HbBarts的组成是γ4。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]HbBarts见于下列哪种疾病（）. A.HbC B.β珠蛋白生成障碍性贫血 C.α珠蛋白生成障碍性贫血 D.HbE E.HbS 珠蛋白基因缺失或基因缺陷导致一种或一种以上的珠蛋白肽链不能合成或合成不足，如α珠蛋白基因缺失，α链不能合成或合成不足，结果形成的HbH（β4）、HbBaIts（γ4）两种异常血红蛋白，都对氧有极高的亲和力，失去向组织释放氧的功能，而且极不稳定，易发生沉淀形成包涵体，导致溶血。(11选5 https://www.wendangku.net/doc/aa16108289.html,)

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列哪项不是溶血的实验诊断依据（）. A.网织红细胞计数增高 B.骨髓红系增生明显活跃 C.间接胆红素升高 D.尿胆原增高 E.血清游离血红蛋白40mgL 溶血性贫血时血清游离血红蛋白增高（40mgL），血管内溶血明显升高，血管外溶血轻度增高。

溶血全套实验操作规程

溶血全套实验操作规程 一, 抗碱血红蛋白（HbF）测定 1.取抗凝血1-2ml, 用等渗盐水离心沉淀, 洗涤红细胞3-4次, 将洗涤后的红细胞按沉淀体 积加1.5倍蒸馏水和半量四氯碳, 用力震荡混合5-6分钟, 使红细胞完全溶解后离心20分钟, 上层即为100g/lHb液. 2.对照管: 100g/lHb液0.02ml, 再加5ml蒸馏水, 混匀. 3.测定管: 100g/lHb液0.1ml, 加入预温至25℃的0.083M的KOH1.6ml，同时开动秒表， 混匀数秒钟，至1min整，立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml，倒转混匀，过滤取上清夜。 4.分光光度计540nm，蒸馏水调零，分别测两管光密度。 HbF%=测定管光密度/（对照管光密度X5）X100 5.正常人1.0-3.1%，新生儿55-85%，一岁后接近正常人。 二，异丙醇试验 1ml7%异丙醇溶液，置有塞试管中，37℃水溶液预热数分钟后，加入0.1mlHb(10%)溶液，加塞混匀，计时观察，同时做正常对照。若放在37℃水溶液中，5min出现浑浊，40min 之内出现沉淀，则为阳性。 三，血浆游离血红蛋白测定 试剂（ml）标准管测定管空白管 1. 10g/L联苯胺0.5 0.5 0.5 2. 被检血浆（血清）——0.02 —— 3. 标准血红蛋白0.02 ———— 4．1%HO 0.5 0.5 0.5 5．10%醋酸液 5 5 5 （注：1-4试剂混合后，于室温下静置20min, 再加5试剂） 10min后，用比色剂（0.5cm）测定各管的光密度，波长530nm空白管为比色对照。结果按下列计算： 血浆游离Hb(mg/L)=测定管光密度/标准管光密度（0.025）X100） 正常值：〈40mg/L 四，高铁血红蛋白还原实验 1，静脉采血1.5-2mL，加入含有38g/L枸橼酸钠抗凝剂的小瓶内，再加葡萄糖20mg.血液与抗凝剂按9：1混合，亦可用ACD抗凝。 2，将此血标本离心沉淀5分钟（1000R/M），或置于4℃冰箱24小时，待红细胞下沉后，吸取部分血浆，使血液与血浆之比约为1：1（相当于红细胞压积30-40%） 3，摇匀后，取此血液1.0毫升，加12.5%g/l亚硝酸钠-葡萄糖溶液和0.0004mol/L美兰液各 0.05ml,颠倒混合15次，使与空气中的氧气充分接触，加塞，37℃水浴（孵箱）保温3 小时（血不足用半量）。 4，取出后摇匀，吸取此血液0.1 ml,加于10ml0.02mmol/L磷酸盐缓冲液中，2分钟后，634nm 处（或红色滤光板）比色，用蒸馏水做空白，测定其光密度为A。

血红蛋白的提取和分离》名师教案

专题5D N A与蛋白质技术 课题5.3 血红蛋白的提取和分离 辉县市第二高级中学李艳琴一、【课题目标】 知识与能力目标 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白。 2、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 学科素养 1、基础知识（从血液中提取和分离血红蛋白；色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理）； 2、基本技能（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤，培养学生理论联系实际的能力）； 3、基本思想（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神）； 4、基本活动经验（通过色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理的学习，关注学生科学态度的教育，拓展学生视野）。 二、【课题重点】 凝胶色谱法的原理和方法 三、【课题难点】 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 四、【教学方法】 启发式教学 五、【教学工具】 多媒体课件 六、【教学过程】 （一）引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？ （二）进行新课 1．基础知识 蛋白质的理化性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 1.1凝胶色谱法（分配色谱法）： （1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 （2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程：（图5－13b） 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 ＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 1.2缓冲溶液 （1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 （2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 1.3凝胶电泳法： （1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 ［思考］阅读教材后，填写下表： （2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （优教提示：打开素材实验演示：琼脂糖凝胶电泳） （3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 2．实验设计 （优教提示：打开素材实验演示：血红蛋白的提取和分离） 2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

溶血性贫血的实验诊断试题及答案

2017 第八章溶血性贫血的实验诊断 一、A1 1、不符合溶血性贫血骨髓象的是 A、骨髓增生明显活跃 B、粒红比值减低 C、三系显著减低 D、中晚幼红增多 E、无巨幼红细胞 2、红细胞脆性增高见于 A、缺铁性贫血 B、遗传性球形红细胞增多症 C、阻塞性黄疸 D、珠蛋白生成障碍性贫血 E、血红蛋白病 3、Rous试验结果阳性见于 A、阵发性冷性血红蛋白尿症 B、血红蛋白病 C、冷凝集素综合征 D、丙酮酸激酶缺乏症 E、珠蛋白正常障碍性贫血

4、筛选试验选用红细胞形态学检查的溶血性贫血是 A、G6PD-CNSHA B、阵发性睡眠性血红蛋白尿症 C、蚕豆病 D、珠蛋白生成障碍性贫血 E、阵发性冷性血红蛋白尿症 5、用热变性试验筛选的溶血性贫血是 A、温抗体型自身免疫性溶血性贫血 B、阵发性冷性血红蛋白尿症 C、蚕豆病 D、G6PD-CNSHA E、血红蛋白病 6、筛选试验选用PK荧光斑点试验，可能的溶血性贫血是 A、丙酮酸激酶缺乏症 B、迟发性溶血性输血反应 C、急发性溶血性输血反应 D、冷凝集素综合征 E、遗传性椭圆形红细胞增多症 7、筛选试验选用渗透脆性试验，可能的溶血性贫血是 A、血红蛋白病 B、嘧啶～5’～核苷酸缺乏症 C、遗传性口形红细胞增多症

D、珠蛋白生成障碍性贫血 E、阵发性睡眠性血红蛋白尿症 8、筛选试验选用Coombs试验，可能的溶血性贫血是 A、嘧啶～5’～核苷酸缺乏症 B、血红蛋白病 C、蚕豆病 D、珠蛋白生成障碍性贫血 E、冷凝集素综合征 9、筛选试验选用Rous试验，可能的溶血性贫血是 A、遗传性口形红细胞增多症 B、阵发性冷性血红蛋白尿症 C、药物致免疫性溶血性贫血 D、急发性溶血性输血反应 E、微血管病性溶血性贫血 10、筛选试验为Rous试验，确诊试验为Ham试验，可能的溶血性贫血是 A、血红蛋白病 B、冷凝集素综合征 C、蚕豆病 D、阵发性睡眠性血红蛋白尿症 E、丙酮酸激酶缺乏症 11、发生血管外溶血时，不常见的是 A、贫血、黄疸