Northern Blot实验方法步骤

Northern Blot实验方法步骤

实验原理

在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

实验试剂

1. NorthernMax Kit（Cat.# 1940，Ambion, Inc.）

2. 琼脂糖

3. DEPC

4. X光底片

5. 底片暗盒

6. Random Primer

7. dNTP Mixture

8. 111 TBq/mmol[a-32P]dCTP

9. Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer

10. Sephadex G-50

11. SDS

12. 双氧水, 灭菌水等

实验设备

1. 恒温水浴箱

2. 电泳仪

3. 凝胶成像系统

4. 真空转移仪

5. 真空泵

6. UV 交联仪

7. 杂交炉

8. 恒温摇床

9. 脱色摇床

10. 漩涡振荡器

11. 分光光度计

12. 微量移液器

13. 电炉（或微波炉）

14. 离心管，烧杯，量筒，三角瓶等

实验材料

总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜

实验步骤

1. 用具的准备：

180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。

处理DEPC水(2 L)备用。

2. 用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

3. 制胶

1) 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分) 。

2) 在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。

注意尽量避免产生气泡。

3) 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子。

如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。

4) 胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。）

5) 检查点样孔。

4. RNA样品的制备

在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。

5. 电泳：

1) 将RNA样品小心加到点样孔中。

2) 在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。

3) 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。

注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

6. 转膜

1) 用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。

2) 用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。

3) 连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。

4) 盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。

5) 将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。

6) 将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。

7) 打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。

8) 转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。

9) 用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。

10) 将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间) 12) 将膜在-20℃保存。

7. 探针的制备

1) 在1.5ml离心管中配制以下反应液：

模板DNA(25 ng) 1ul

Random Primer 2ul

灭菌水 11ul

总体积：14ul

2) 95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。

3) 在离心管中按下列顺序加入以下溶液：

10×Buffer 2.5ul

dNTP Mixture 2.5ul

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul

Exo-free Klenow Fragment 1 ul

4) 混匀后（25ul），37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。

5) 65°C加热5min使酶失活。

8. 探针的纯化及比活性测定：

1) 准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE（PH7.6）。

2) 取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。

3) 将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处。

4) 100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。

5) 倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。

6) 将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5ul点样于DE8paper上，其余上样于层析柱上。

7) 1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper。

8) 测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml）。

9. 预杂交：

1) 将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。

2) 加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 hr。

10. 探针变性：

1) 用10 mM EDTA将探针稀释10倍。

2) 90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。

3) 短暂离心，将溶液收集到管底。

11. 杂交：

1) 加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。

2) 42℃杂交过夜（14~24hr）。

杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。

12. 洗膜：

1) 低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。

2) 高严紧性洗膜：加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃摇动洗膜20min两次。

13. 曝光：

1) 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。

2) 检查膜上放射性强度，估计曝光时间

3) 将X光底片覆盖与膜上，曝光

4) 冲洗X光底片，扫描记录结果。

14. 去除膜上的探针：将200ml0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。

15. 杂交结果。

注意事项

操作应该小心，但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse 酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

坍落度与扩展度试验方法

依据标准GB50080-2002《普通混凝土拌合物性能试验方法标准》进行： 3.1坍落度与坍落扩展度法 3.1.1本方法适用于骨料最大粒径不大于40mm、坍落度不小于10mm的混凝土拌合物稠度测定。 3.1.2坍落度与坍落扩展度试验所用的混凝土坍落度仪应符合《混凝土坍落度仪》JG 3021中有关技术要求的规定。 3.1.3坍落度与坍落扩展度试验应按下列步骤进行: 1 湿润坍落度筒及底板，在坍落度筒内壁和底板上应无明水。底板应放置在坚实水平面上，并把筒放在底板中心，然后用脚踩住二边的脚踏板，坍落度筒在装料时应保持固定的位置。 2 把按要求取得的混凝土试样用小铲分三层均匀地装人筒内，使捣实后每层高度为筒高的三分之一左右。每层用捣棒插捣25次。插捣应沿螺旋方向由外向中心进行，各次插捣应在截面上均匀分布。插捣筒边混凝土时，捣棒可以稍稍倾斜。插捣底层时，捣棒应贯穿整个深度，插捣第二层和顶层时，捣棒应插透本层至下一层的表面;浇灌顶层时，混凝土应灌到高出筒口。插捣过程中，如混凝土沉落到低于筒口，则应随时添加。顶层插捣完后，刮去多余的混凝土，并用抹刀抹平。 3清除筒边底板上的混凝土后，垂直平稳地提起坍落度筒。坍落度筒的提离过程应在5一lOs内完成;从开始装料到提坍落度筒的整个过程应不间断地进行，并应在150s内完成。 4提起坍落度筒后，测量筒高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，即为该混凝土拌合物的坍落度值;坍落度筒提离后，如混凝土发生崩坍或一边剪坏现象，则应重新取样另行测 定;如第二次试验仍出现上述现象，则表示该混凝土和易性不好，应予记录备查。 5 观察坍落后的混凝土试体的豁聚性及保水性。勃聚性的检查方法是用捣捧在已坍落的混凝土锥体侧面轻轻敲打，此时如果锥体逐渐下沉，则表示戮聚性良好，如果锥体倒塌、部分崩裂 或出现离析现象，则表示豁聚性不好。保水性以混凝土拌合物稀浆析出的程度来评定，坍落度筒提起后如有较多的稀浆从底部析出，锥体部分的混凝土也因失浆而骨料外露，则表明此混凝土拌 合物的保水性能不好;如坍落度筒提起后无稀浆或仅有少量稀浆自底部析出，则表示此混凝土拌合物保水性良好。 6当混凝土拌合物的坍落度大于220mm时，用钢尺测量混凝土扩展后最终的最大直径和最小直径，在这两个直径之差小于50mm的条件下，用其算术平均值作为坍落扩展度值;否则，此次试验无效。

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

混凝土坍落度试验

建筑 混凝土坍落度试验 砼坍落度试验 1、试验步骤 （1）每次测定前，用湿布湿润坍落度筒、拌和钢板及其他用具，并把筒放在不吸水的刚性 水平底板上，然后用脚踩住 2个脚踏板，使坍落度筒在装料时保持位置固 定。 （2）取拌好的混凝土拌和物15L，用小铲分 3层均匀地装入筒内，使捣实后每层高度为筒 高的 1/3左右。每层用捣棒沿螺旋方向在截面上由外向中心均匀插捣25次。插捣筒边混凝 土时，捣棒可以稍稍倾斜。插捣底层时，捣棒应贯穿整个深度，插捣第二层和顶层时，捣棒 应插透本层至下一层的表面。浇灌顶层时，混凝土应灌到高出筒口，插捣过程中， 如混凝土沉落到低于筒口，则应随时加料，顶层插捣完毕后，刮去多余混凝土，并用镘刀抹平。 （3）清除筒边底板上的混凝土后，垂直平稳地提起坍落度筒。坍落度筒的提离过程应在5～10s内完成。从开始装料到提起坍落度筒的整个过程应不间断地进行，并应 150s内完成。2、试验结果确定与处理 （1）提起坍落度筒后，立即量测筒高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，即 为该混凝土拌和物的坍落度值。混凝土拌和物坍落度以mm为单位，结果精确至 1mm。（2）坍落度筒提离后，如混凝土发生崩坍或一边剪坏现象，则应重新取样再测定。如第二 次试验仍出现上述现象，则表示该混凝土拌和物和易性不好，应予记录备查。 （3）观察坍落后的混凝土试体的粘聚性和保水性。粘聚性的检查方法是用捣棒在已坍落的 混凝土锥体侧面轻轻敲打，此时，如果锥体逐渐下沉，则表示粘聚性良好，如果锥体倒塌、 部分崩裂或出现离析现象，则表示粘聚性不好。保水性以混凝土拌和物中稀浆析出的程度来 评定。如坍落度筒提起后无稀浆或仅有少量稀浆自底部析出，则表示此混凝土拌和物保水性 良好；坍落度筒提起后如有较多的稀浆从底部析出且锥体部分的混凝土也因失浆而骨料外 露，则表明此混凝土拌和物的保水性能不好。 （4）和易性的调整 1）当坍落度低于设计要求时，可在保持水灰比不变的前提下，适当增加水泥浆量。 2）当坍落度高于设计要求时，可在保持砂率不变的条件下，增加集料的用量。 3）当出现含砂量不足，粘聚性、保水性不良时，可适当增加砂率，反之减小砂率。 混凝土坍落度试验 一、实验目的 混凝土由各组成材料按一定比例配合、搅拌而成。混凝土拌和物的和易性是一项综合性的 指标，它包括流动性、粘聚性和保水性等三方面的性能。由于它的内涵较为复杂，根据我国的现 行标准规定，采用“坍落度”和“维脖稠度”来测定混凝土拌和物的流动性。这里先进行“坍落 度”试验。（本试验适用于坍落度值不小于１０ mm，骨料粒径不大于４０mm混凝土伴和物）。 二、实验设备和仪器

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

普通混凝土坍落度试验步骤

普通混凝土坍落度试验步骤 混凝土坍落度主要是指混凝土的塑化性能和可泵性能，影响混凝土坍落度的因素主要有级配变化、含水量、衡器的称量偏差、外加剂的用量，容易被忽视的还有水泥的温度等。坍落度是指混凝土的和易性，具体来说就是保证施工的正常进行，其中包括混凝土的保水性，流动性和粘聚性。 和易性是指混凝土是否易于施工操作和均匀密实的性能，是一个很综合的性能其中包含流动性、粘聚性和保水性。影响和易性主要有用水量、水灰比、砂率以及包括水泥品种、骨料条件、时间和温度、外加剂等几个方面。 混凝土的坍落度，应根据建筑物的结构断面、钢筋含量、运输距离、浇注方法、运输方式、振捣能力和气候等条件决定，在选定配合比时应综合考虑，并宜采用较小的坍落度。 一、适用范围： 集料骨料最大粒径不大于40mm； 坍落度值不小于10mm的混凝土拌合物。 二、坍落度试验的试验设备应符合下列规定: 1、坍落度仪应符合现行行业标准《混凝土坍落度仪》JG/T248的规定； 2、应配备2把钢尺，钢尺的量程不应小于300mm,分度值不应大于1mm； 3、底板应采用平面尺寸不小于1500mmX1500mm、厚度不小于3mm的钢板，其最大挠度不应大于3mm。 三、主要试验设备： 试验室用混凝土小型搅拌机试验步骤： 1、坍落度筒内壁和底板应润湿无明水；底板应放置在坚实水平面上，并把坍落度筒放在底板中心，然后用脚踩住两边的脚踏板，坍落度筒在装料时应保持在固定的位置；

2、混凝土拌合物试样应分三层均匀地装人坍落度筒内，每装一层混凝土拌合物，应用捣棒由边缘到中心按螺旋形均匀插捣25次，捣实后每层混凝土拌合物试样高度约为筒高的三分之一； 3、插捣底层时，捣棒应贯穿整个深度，插捣第二层和顶层时，捣棒应插透本层至下一层的表面； 4、顶层混凝土拌合物装料应高出筒口，插捣过程中，混凝土拌合物低于筒口时，应随时添加； 5、顶层插捣完后，取下装料漏斗，应将多余混凝土拌合物刮去，并沿筒口抹平； 6、清除筒边底板上的混凝土后，应垂直平稳地提起坍落度筒，并轻放于试样旁边；当试样不再继续坍落或坍落时间达30s时，用钢尺测量出简高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，作为该混凝土拌合物的坍落度值。点击添加图片描述（最多60个字）坍落度简的提离过程宜控制在3s~7s；从开始装料到提坍落度筒的整个过程应连续进行，并应在150s内完成。将坍落度简提起后混凝土发生一边崩坍或剪坏现象时，应重新取样另行测定；第二次试验仍出现一边崩坍或剪坏现象，应予记录说明。混凝土拌合物坍落度值测量应精确至1mm，结果应修约至5mm。 判断混凝土和易性 流动性：测量坍落度； 粘聚性：捣棒敲打锥体侧面； 保水性：观察稀浆程度。 坍落度的选择：

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

塌落度试验规范要求

塌落度试验规范要求 篇一：试块取样标准和制作方法及塌落度检测 试块取样标准和制作方法 （一）现场搅拌混凝土 根据《混凝土结构工程施工质量验收制约》（GB 50204-2002）和《混凝土强渡检验评定标准》（GBJ107－87）的规定，用于检查结构构件混凝土强渡的试件，应在混凝土的浇筑地点随机抽取。取样和试件留置应符合以下规定： 1、每拌制100盘但不超过100立方米的同配合比的混凝土，取样次数不得少于一次； 2、每工作班拌制的同一配合比的混凝土不足100盘时，其取样次数不得少于一次； 3、当一次连续浇筑超过1000立方米时，同一配合比的混凝土每200立方米取样不得少于一次； 4、同一楼层、同一配合比的混凝土，取样不得少于一次； 5、每次取样应至少留置一组标准养护试件，同条件养护试件的留置组数应根据实际需要确定。 （二）结构实体检验用同条件养护试件 根据《混凝土结构工程施工质量验收制约》的规定，结构实体检验用用同条件养护试件的留置方式和取样数量应符合以下规定：

1、对涉及混凝土结构安全的重要部位应举行结构实体检验，其内容包括混凝土强渡、钢筋保护层厚渡及工程合同约定的项目等。 2、同条件养护试件应由各方在混凝土浇筑进模处见证取样。 3、同一强渡等级的同条件养护试件的留置不宜少于10组，留置数量不应少于3组。 4、当试件达到等效养护龄期时，方可对同条件养护试件举行强渡试验。所谓等效养护龄期，就是逐日累计养护温渡达到600℃℃的环境中静置一昼夜至二昼夜，然后编号、拆模。拆模后应马上放进温渡为20±2℃，相对湿渡为95%以上的标准养护室中养护，或在温渡为20±2℃的不流动的氢氧化钙饱和溶液中养护。标准养护室内的试件应放在支架上，彼此间隔10～20mm，试件表面应保持潮湿，并不得被水直接冲淋。 混凝土坍落度简介 混凝土坍落度主要是指混凝土的塑化性能和可泵性能，影响混凝土坍落度主要有级配变化、含水量、衡器的称量偏差，外加剂的用量容易被忽视的还有水泥的温度几个方面。坍落度是指混凝土的和易性，具体来说就是保证施工的正常进行，其中包括混凝土的保水性，流动性和粘聚性。 和易性是指混凝土是否易于施工操作和均匀密实的性能，是一个很综合的性能其中包含流动性、粘聚性和保水性。影响和易性主要有用水量、水灰比、砂率以及包括水泥品种、骨料条件、时间和温度、外加剂等几个方面。

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

混凝土坍落度实验报告

混凝土 试验单位：云南工商学院建筑工程学院 试验班级：2012级土木工程5班 组号：第1组 组长：金端斌 成员：金端斌，陈飞，马伊帅，唐国银，柳帅，熊安林，李雄伟，饶启彬。 指导老师：肖松涛 一．混凝土坍落度。 混凝土坍落度主要是指混凝土的塑化性能和可泵性能，影响混凝土坍落度主要有级配变化、含水量、衡器的称量偏差，外加剂的用量容易被忽视的还有水泥的温度几个方面。坍落度是指混凝土的和易性，具体来说就是保证施工的正常进行，其中包括混凝土的保水性，流动性和粘聚性。 和易性是指混凝土是否易于施工操作和均匀密实的性能，是一个很综合的性能其中包含流动性、粘聚性和保水性。影响和易性主要有用水量、水灰比、砂率以及包括水泥品种、骨料条件、时间和温度、外加剂等几个方面。 混凝土的坍落度,应根据建筑物的结构断面、钢筋含量、运输距离、浇注方法、运输方式、振捣能力和气候等条件决定，在选定配合比时应综合考虑，并宜采用较小的坍落度。 二．实验目的。 混凝土由各组成材料按一定比例配合、搅拌而成。混凝土拌和物的和易性是一项综合性的指标，它包括流动性、粘聚性和保水性等三方面的性能。由于它的内涵较为复杂，根据我国的现行标准规定，采用“坍落度”和“维脖稠度”来测定混凝土拌和物的流动性。这里先进行“坍落度”试验。 试验设备和器材：坍落度筒和弹头型捣棒、铁锹、卷尺、镘刀、磅称等。 适用范围：适用于坍落度大于10mm，集料公称最大粒径不大于31.5mm水泥混凝土的坍落度。 三．试验步骤： 1．先用湿布抹湿坍落筒，铁锹，拌和板等用具。坍落筒为上口直径100mm，下口直径200mm，高300mm，呈喇叭状。 2．称量材料：

WB实验步骤

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。

混凝土坍落度试验

混凝土坍落度试验 LG GROUP system office room 【LGA16H-LGYY-LGUA8Q8-LGA162】

混凝土坍落度试验 砼坍落度试验 1、试验步骤 （1）每次测定前，用湿布湿润坍落度筒、拌和钢板及其他用具，并把筒放在不吸水的刚性水平底板上，然后用脚踩住2个脚踏板，使坍落度筒在装料时保持位置固定。 （2）取拌好的混凝土拌和物15L，用小铲分3层均匀地装入筒内，使捣实后每层高度为筒高的1/3左右。每层用捣棒沿螺旋方向在截面上由外向中心均匀插捣25次。插捣筒边混凝土时，捣棒可以稍稍倾斜。插捣底层时，捣棒应贯穿整个深度，插捣第二层和顶层时，捣棒应插透本层至下一层的表面。浇灌顶层时，混凝土应灌到高出筒口，插捣过程中，如混凝土沉落到低于筒口，则应随时加料，顶层插捣完毕后，刮去多余混凝土，并用镘刀抹平。 （3）清除筒边底板上的混凝土后，垂直平稳地提起坍落度筒。坍落度筒的提离过程应在5～10s内完成。从开始装料到提起坍落度筒的整个过程应不间断地进行，并应150s内完成。 2、试验结果确定与处理 （ 1）提起坍落度筒后，立即量测筒高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，即为该混凝土拌和物的坍落度值。混凝土拌和物坍落度以mm为单位，结果精确至1mm。（2）坍落度筒提离后，如混凝土发生崩坍或一边剪坏现象，则应重新取样再测定。如第二次试验仍出现上述现象，则表示该混凝土拌和物和易性不好，应予记录备查。（3）观察坍落后的混凝土试体的粘聚性和保水性。粘聚性的检查方法是用捣棒在已坍落的混凝土锥体侧面轻轻敲打，此时，如果锥体逐渐下沉，则表示粘聚性良好，如果锥体倒塌、部分崩裂或出现离析现象，则表示粘聚性不好。保水性以混凝土拌和物中稀浆析出的程度来评定。如坍落度筒提起后无稀浆或仅有少量稀浆自底部析出，则表示此混凝土拌和物保水性良好；坍落度筒提起后如有较多的稀浆从底部析出且锥体部分的混凝土也因失浆而骨料外露，则表明此混凝土拌和物的保水性能不好。（4）和易性的调整 1）当坍落度低于设计要求时，可在保持水灰比不变的前提下，适当增加水泥浆量。 2）当坍落度高于设计要求时，可在保持砂率不变的条件下，增加集料的用量。 3）当出现含砂量不足，粘聚性、保水性不良时，可适当增加砂率，反之减小砂率。 混凝土坍落度试验 一、实验目的 混凝土由各组成材料按一定比例配合、搅拌而成。混凝土拌和物的和易性是一项综合性的指标，它包括流动性、粘聚性和保水性等三方面的性能。由于它的内涵较为复杂，根据我国的现行标准规定，采用“坍落度”和“维脖稠度”来测定混凝土拌和物的流动性。这里先进行“坍落度”试验。（本试验适用于坍落度值不小于１０mm，骨料粒径不大于４０mm混凝土伴和物）。

Western_Blot操作步骤

Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

现场测定砼坍落度的方法

现场测定砼坍落度的方法 实验器材： ①坍落筒见下图。底部直径为（200±2）mm，顶部直径为（100±2）mm，高为（300±2）mm，筒壁厚度不小于1.5mm。 ②捣棒直径16mm，长600mm，端部磨园。 ③小铲、钢尺等 实验耗材：普通硅酸盐水泥、砂子、石子和水 坍落筒和捣棒 试验方法步骤 ①湿润坍落筒。将坍落筒放在一块刚性的、平坦的、湿润且不吸水的底版上，用脚踩两个踏板，使坍落筒在装料时位置固定。把按要求取得的混凝土试样分三层装入筒内，每层捣实后的高度大致为坍落筒高度的1/3。 ②每层用捣棒插捣25次，各次插捣要在每层截面上均匀分布。插捣底层时，需稍倾斜并贯穿整个深度。插捣第二层和顶层时捣棒要插透本层，并使之刚好插入下面一层。插捣时均应把约一半的次数呈螺旋形由外向中心进行。 ③插捣顶层前要将混凝土灌满到高出坍落筒，如果插捣使混凝土沉落到低于筒口，则要随时填加混凝土，使其一直保持高出顶。顶层插捣完后，用捣棒将筒顶混凝土表面搓平。 ④小心垂直提起坍落筒，其提离过程应在5-10s内完成，要平稳底向上提起，同时防止混凝土试体不受碰撞或震动。试验时从开始装料到提起坍落筒的整个过程要不间断地进行，要在不大于150s的时间内完成。 ⑤提起坍落筒后，立即测量筒高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，这就是坍落度值。示意图如下：（见后页）

坍落度试验示意图 黏聚性和保水性的检查方法 ①黏聚性的检查方法：用捣棒在已坍落的混凝土锥体的一侧轻轻敲打，若轻打后混凝土锥体渐渐下沉表示黏聚性良好，见下图b。若锥体突然倒塌，见下图c，或部分崩裂或发生石子离析现象，见下图a，即表示黏聚性不好。 ②保水性的检查方法：提起坍落筒后，若有较多的稀浆从底部析出，而使混凝土试体因失浆造成骨料外露，则表示此类混凝土拌和物的保水性能不好。若无稀浆或仅有少量稀浆自底部析出，而锥体部分混凝土试体含浆饱满，则表示此类混凝土拌和物的保水性能良好。

新手Western blot步骤及注意事项

WesternBlot操作步骤及注意事项 【原理】 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【试剂及配制】 1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。 2、电泳缓冲液 Tris（分子量121.14） 3.03g 甘氨酸（分子量75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。 3、转膜缓冲液 湿转法 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L甘氨酸11.25g 0.0375%SDS 0.375g 加少部分蒸馏水溶解 20%甲醇200ml 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。 4、TBS缓冲液 1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml NaCl 8.8g 蒸馏水定容至1000ml 配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。 5、TBST缓冲液（洗膜液） 20%Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。

混凝土塌落度的检测

普通混凝土拌合物工作性（和易性）试验———混凝土的坍落度试验 1．试验目的通过测定骨料最大粒径不大于37.5mm、坍落度值不小于10mm的塑性混凝土拌合物坍落度，同时评定混凝土拌合物的粘聚性和保水性，为混凝土配合比设计、混凝土拌合物质量评定提供依据；掌握GB/T50080—2002《普通混凝土拌和物性能试验方法标准》的测试方法，正确使用所用仪器与设备，并熟悉其性能。 2．主要仪器设备 （1）坍落度筒 （2）捣棒 （3）直尺、小铲、漏斗等。 3．试验步骤 （1）每次测定前，用湿布湿润坍落度筒、拌和钢板及其他用具，并把筒放在不吸水的刚性水平底板上，然后用脚踩住2个脚踏板，使坍落度筒在装料时保持位置固定。 （2）取拌好的混凝土拌和物15L，用小铲分3层均匀地装入筒内，使捣实后每层高度为筒高的1/3左右。每层用捣棒沿螺旋方向在截面上由外向中心均匀插捣25次。插捣筒边混凝土时，捣棒可以稍稍倾斜。插捣底层时，捣棒应贯穿整个深度，插捣第二层和顶层时，捣棒应插透本层至下一层的表面。浇灌顶层时，混凝土应灌到高出筒口，插捣过程中，如混凝土沉落到低于筒口，则应随时加料，顶层插捣完毕后，刮去多余混凝土，并用镘刀抹平。（3）清除筒边底板上的混凝土后，垂直平稳地提起坍落度筒。坍落度筒的提离过程应在5～10s内完成。从开始装料到提起坍落度筒的整个过程应不间断地进行，并应150s内完成。4．试验结果确定与处理 （1）提起坍落度筒后，立即量测筒高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，即为该混凝土拌和物的坍落度值。混凝土拌和物坍落度以mm为单位，结果精确至1mm。 （2）坍落度筒提离后，如混凝土发生崩坍或一边剪坏现象，则应重新取样再测定。如第二次试验仍出现上述现象，则表示该混凝土拌和物和易性不好，应予记录备查。 （3）观察坍落后的混凝土试体的粘聚性和保水性。粘聚性的检查方法是用捣棒在已坍落的混凝土锥体侧面轻轻敲打，此时，如果锥体逐渐下沉，则表示粘聚性良好，如果锥体倒塌、部分崩裂或出现离析现象，则表示粘聚性不好。保水性以混凝土拌和物中稀浆析出的程度来评定。如坍落度筒提起后无稀浆或仅有少量稀浆自底部析出，则表示此混凝土拌和物保水性良好；坍落度筒提起后如有较多的稀浆从底部析出且锥体部分的混凝土也因失浆而骨料外露，则表明此混凝土拌和物的保水性能不好。 （4）和易性的调整 1）当坍落度低于设计要求时，可在保持水灰比不变的前提下，适当增加水泥浆量。 2）当坍落度高于设计要求时，可在保持砂率不变的条件下，增加集料的用量。 3）当出现含砂量不足，粘聚性、保水性不良时，可适当增加砂率，反之减小砂率。 一、实验目的 混凝土由各组成材料按一定比例配合、搅拌而成。混凝土拌和物的和易性是一项综合性的指标，它包括流动性、粘聚性和保水性等三方面的性能。由于它的内涵较为复杂，根据我国的现行标准规定，采用“坍落度”和“维脖稠度”来测定混凝土拌和物的流动性。这里先进行“坍落度”试验。（本试验适用于坍落度值不小于１０mm，骨料粒径不大于４０mm混凝土伴和物）。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移 到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体以非共价键形式吸附 蛋白质，且能保持电泳分离的多肽 类型及其生物学活性不变。以固相 载体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再与酶 或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测 电泳分离的特异性目的基因表达的 蛋白成分。该技术也广泛应用于检 测蛋白水平的表达。 ? 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺 SDS? Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺 H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 ? 1. ?SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 ? 2. ?匀浆缓冲液： M Tris-HCl(pH ml；10%SDS ml；β-巯基乙醇 ml；ddH 2 O ml。

3. ?转膜缓冲液：甘氨酸 g；Tris g；SDS g；甲醇200 ml；加ddH 2 O定容至1000 ml。? 4. ? M PBS：NaCl g；KCl g；Na 2HPO 4 g； KH 2PO 4 g；加ddH 2 O至1000 ml。 ? 5. ?膜染色液：考马斯亮兰 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH 2 O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉 g 溶于20 ml的 M PBS 中。 ? 6. ?显色液：DAB mg； M PBS ml；硫酸镍 胺 ml；H 20 2 μl。 二、蛋白样品制备 ? 1. ? 单层贴壁细胞总蛋白的提取 ? （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 ? （2）?每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（～）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。? （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） ? （4）?每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 ? （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） ? （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提前开离心机预冷）