固定化酶与固定化细胞

固定化酶

水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。

固定化酶（immobilized enzyme），酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。

酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。

物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。

化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过

酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法. 其中吸附法和共价键法又可统称为载体结合法。

具体方法

吸附法

利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。

常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。

载体结合法

最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。

此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。

交联法

依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

包埋法

酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。

酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。

固定化细胞

固定化细胞是指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢等）的细胞。它是用于获得细胞的酶和代谢产物的一种方法，起源于20世纪70年代，是在固定化酶的基础上发展起来的新技术。由于固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。通过各种方法将细胞和水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。

微生物细胞、动物细胞、植物细胞都可以制成固定化细胞。

细胞的种类多种多样，大小和特性个不相同，故此细胞固定化的方法有很多种。归结起来，主要可以分为吸附法和包埋法两大类。

1.吸附法

利用各种吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法称为吸附法。

用于细胞固定化的吸附剂主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体、和中空纤维等。

酵母细胞带有负电荷，在pH3~5的条件下能够吸附在多空陶瓷、多空塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产；在环境保护领域内使用的活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多空塑料等载体的表面，用于各种有机废水的处理，降低废水中的化学需氧量（COD)和生化需氧量（BOD）；各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可以吸附缠

绕在多空塑料、金属丝网等载体上用于生产有机酸和酶等；植物细胞可吸附在中空纤维外壁，用于生产色素、香精、药物和酶等次级代谢产物；动物细胞大多属于贴壁细胞，必需依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁、微载体、中空纤维外壁等载体上，制成固定化细胞，用于各种蛋白质的生产。

2.包埋法

将细胞包埋在多空载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。

凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定方法。

1．5．1无载体的固定

无载体固定主要目的是将吸附或者共价交联的细胞，彼此分成自身独立

的区域。所谓吸附过程是指细胞发酵过程中产生的细胞体絮凝或者呈丸粒状；或通过二级过程，在适应的参数变化之下，简单有效地制各出具有触媒活性的颗粒。

在此过程中。往往加入少量絮凝剂(即聚合物)，加入的聚合物可直接参与细胞间的相互作用。其明显特征是颗粒牢固。

1．5．2预制载体的固定

在酶的固定化领域中，尤其是使用共价结合是一种典型的方法。这一方法也可适用于固定化细胞的操作。触媒制备过程中形成的载体本体应不受物理、化学的条件限制。因此载体物质的柔性与制作方法要求很高。在制作过程中最优化的机械性能、孔隙结构受生理参数约束。

1．5．3载体制备过程中的固定

此法为整体细胞固定的一种通用方法。该工艺主要包括截留与密封。其实密封是一种边际效应。此法的特点是：由于整个细胞大小，制成的网状体比较简单，它能全面封锁滞留细胞，并对输送基质与产品有足够快的高效酶活；由于制备载体与保留酶活性及细胞存活生理要求条件适合，故载体制备的主要问题已得到解决。1．5．4生物触媒内固定化细胞的生长

此法正因其日趋重要而引起人们的注意。其理由是：整个细胞体处于存活状态下。制成生物触媒时，在小球之内，它的细胞浓度很可能增加和提高。新制各的生物触媒或者一级与多级酶系统生物触媒，经再生利用都可能出现一定程度的失活。而置入适当的生长环境下培养，其细胞浓度可能又会增加。最后，活细胞生物触媒或在静止期、或在生长期，作为多酶系统或辅酶系统的提供者，而得到利用。

各种酶固定方法

一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶 1、固定化载体的预处理 吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。 2、载体选择 取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。根据其酶活和得率进行筛选。 ３、固定化条件的优化 取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。 4、蛋白质含量测定 采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。 5、酶活收率 指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。 6、酶活测定 以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。在

60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。 二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶 1、固定化载体及其预处理 选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290 和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。 2、脂肪酶的固定化 采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环

酶固定化方法及载体特性

酶固定化一般方法及载体特性 酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。 1酶固定化的传统方法 关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。 1.1 吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。 1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。 1)网格型 将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。 2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。

2017高考生物一轮复习教案：专题27考点二 固定化酶和固定化细胞 含解析 精品

考点二固定化酶和固定化细胞 基础点 1固定化酶 (1)应用实例——果糖生产：葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖。 (2)固定化酶技术：将酶固定在颗粒状的载体上，再将酶颗粒装到反应柱内，反应柱底端的孔应满足酶颗粒无法通过而反应溶液可以自由通过。 2固定化细胞技术 (1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 (2)方法：包埋法、化学结合法和物理吸附法。 (3)制备固定化酵母细胞的操作流程：酵母细胞的活化→配制0.05 mol/L CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞→冲洗→发酵。 重难点 1制备固定化酵母细胞及用固定化酵母细胞发酵 2直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较

易错警示(1)固定化技术对酶的影响：固定化酶改变了酶的存在状态，不改变酶的特性，因此利用固定化酶仍要严格控制温度、pH 等环境条件，以利于酶发挥作用。 (2)正确理解固定化酶的优点：固定化酶能够连续使用，但不是永久使用。酶是具有生物活性的大分子，因此随着使用次数的增多，酶活性也会降低，如果酶活性降低到一定程度，就会失去使用价值。 1．思维辨析 (1)反应产物对固定化酶的活性没有影响。( ) (2)固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应。( ) (3)从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小。( ) (4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl 2和杂菌。( ) (5)刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液。( ) (6)利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物。( ) 答案 (1)× (2)× (3)√ (4)√ (5)× (6)× 2．酶在大规模产业化应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有( ) A ．热稳定性 B ．催化高效性 C ．催化特异性 D ．可反复使用性 答案 D 解析 固定化酶是利用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。

固定化技术应用-酶和细胞的固定化

固定化技术应用－酶和细胞的固定化 试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威 资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。 选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。也就 是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学 会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。 问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固 定化细胞？ 01 1.固定化酶技术 固定化酶技术是用物理或化学手段。将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。 酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。 2.固定化酶技术的发展 以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。

1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。科学家们就开始了同定化酶的研究工作。 1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。 我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。 当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。 邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。 Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。 3.现阶段固定化酶技术存在的缺点 （1）一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。 （2）固定化酶一般只适用于水溶性的小分子底物；大分子底物常受载体阻拦，不易接触酶，致使催化活力难以发挥。 （3）首次使用时投入成本较高。

第三章 固定化酶与固定化细胞

?第三章固定化酶与固定化细胞 ?第一节概述 ?第二节固定化酶的性质及其影响因素 ?第三节固定化酶的制备 ?第四节固定化细胞 ?第五节固定化辅酶和原生质体 ?第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 ?第一节概述 ?什么是固定化酶？ ?第一节概述 二．固定化酶的优缺点 ?多次使用 ?可以装塔连续反应 ?优点：纯化简单 ?提高产物质量 ?应用范围广 ?缺点：首次投入成本高 ?大分子底物较困难 ?第一节结束 ?点击返回 ?第二节固定化酶的性质及其影响因素 ?一．影响固定化酶性质的因素 ?二．固定化后酶性质的变化 ?三．评价固定化酶的指标 ?一．影响固定化酶性质的因素 1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 ?二．固定化后酶性质的变化 ?1．固定化对酶活性的影响： ?酶活性下降，反应速度下降 2．固定化对酶稳定性的影响 ?稳定性提高（原因） ?3．pH的变化（原因） ?载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 ?载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 ?催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 ?酶的pH值高；反之则低 ?固定化后酶稳定性提高的原因： ? a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 ? b. 酶活力的释放是缓慢的。 ? c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。 ?PH 对酶活性的影响： ?（1）改变酶的空间构象 ?（2）影响酶的催化基团的解离

?（3）影响酶的结合基团的解离 ?（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。 ?4．最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。 5．底物特异性变化 ?作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化 ?既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 ?特异性往往会变化。 6．米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （链接） ?米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境 Km'=Km/ρ(表观米氏常数) ?（1）载体与底物带相同电荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。 ?（2）载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，则ρ>1,Km'

固定化酶和固定化细胞技术

张 海 龙 山东教育学院 生物系 Shan Dong Institute of Education 第九章　第九章　固 固定化酶与固定化细胞技术

第一节固定化酶 ?固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。 ?酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的特点（与游离酶相比） ?（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化； ?（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化； ?（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ?（4）酶的反应过程能够严格控制； ?（5）酶的利用率提高，生产成本降低； ?（6）能够进行多酶反应； ?（7）可以增加产物收率，提高产物的质量； ?（8）增加了生产的成本； ?（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。

一、固定化酶的制备方法 ?根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则： –（1）必须维持酶的催化活性以及专一性； –（2）有利于实现连续化和自动化； –（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量； –（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用； –（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应； –（6）成本要低，以便于工业使用；

实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。?（一）包埋法： –1、网格型 –2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法?（二）吸附法： –1、物理吸附法 –2、离子吸附法 ?（三）、共价偶联法 ?（四）、交联法 ?（五）、共价结合法 –1、结晶法 –2、分散法

酶与细胞固定化技术样本

第五章酶与细胞固定化技术 教学目：使学生理解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）概念及意义，掌握酶惯用固定化技术，理解固定化酶性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）范畴,半透膜包埋法。 教学办法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺陷办法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎初次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA持续生产L-AA实现酶应用史上一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间范畴内呈闭锁状态存在酶，能持续地进行反映，反映后酶可以回收重复运用。涉及酶与不溶性载体结合“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中酶。 2、固定化细胞（原生质体）

指被限制自由移动细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范畴内，但细胞仍保存催化活性并具备能被重复或持续使用活力。 四、固定化酶长处 增长了酶稳定性 能减少酶总体费用 酶分离和回收变得容易，并可重复使用 使反映过程持续操作成为也许 反映产物也易于提取纯化 有助于过程设计和优化 拓广了酶应用范畴（多酶系统酶反映，非水相酶反映，生物传感器探头等） 第二节、酶固定化办法 一、酶固定化办法 1、酶固定化办法（四大类办法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其他（酶逆胶束包囊法） 一、酶固定化办法 2、选取办法根据： ⑴酶性质 ⑵载体来源、价格、机械性能、载体功能基团和交联度等 ⑶制备办法简便易行 ⒊衡量根据： ⑴测定固定化酶活力，以拟定固定化过程活力回收率；

第五章酶与细胞固定化技术

第五章酶与细胞的固定化技术 教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的畴,半透膜包埋法。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中的局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺点的方法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间围呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间围，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 四、固定化酶优点 增加了酶的稳定性 能降低酶的总体费用 酶的分离和回收变得容易，并可重复使用 使反应过程的连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化 拓广了酶的应用围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等） 第二节、酶的固定化方法 一、酶的固定化方法 1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法 2）包埋法

3）交联法 4）化学共价法 其它（酶的逆胶束包囊法） 一、酶的固定化方法 2、选择方法依据： ⑴酶的性质 ⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等 ⑶制备方法简便易行 ⒊衡量依据： ⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率； ⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； ⑶稳定性和不稳定原因的探究； ⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。 （一）吸附法 1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。 此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。 2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。 3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用； 缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的. 4、常用吸附剂 各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。 5、举例： 将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS 中备用。 （二）包埋法 1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋法 （网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。 2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高； 缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。 3、海藻酸盐包埋法 海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒

固定化酶与固定化细胞

固定化酶 水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。 固定化酶（immobilized enzyme），酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。 酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。 固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。 物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。 化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过 酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法. 其中吸附法和共价键法又可统称为载体结合法。 具体方法 吸附法 利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。 常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。 载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。

2016-2017学年高中生物第3章第4节酶的固定化检测

第四节酶的固定化 一、固定化酶 1．含义 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与不溶性的载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应。 2．方法 (1)共价键结合法：通过化学反应将酶以共价键结合到尼龙等载体上。 (2)包埋法：将酶包埋到多孔性凝胶中的固定化方法。 (3)物理吸附法。 3．优点 (1)固定化酶的活性稳定，可反复使用； (2)固定化酶能与反应液分开，制品较易纯化； (3)工业化生产可实现大批量、连续化、自动化； (4)极大地降低了生产成本。 4．缺点 需要制备纯净的酶，稍有不慎，酶就会失活。 二、固定化细胞 1．含义 用适当的载体将合成酶的细胞固定起来。 2．优点 比固定化酶更简捷，使用寿命更长。 三、木瓜蛋白酶的固定化操作技术 取尼龙布浸入等体积的CaCl2溶液和甲醇溶液中10 s左右―→盐酸溶液中室温下水解45 min―→蒸馏水冲洗至中性―→室温下放入戊二醛溶液中浸泡20 min―→磷酸缓冲液(pH 为7.8)反复洗涤―→木瓜蛋白酶溶液中固定3.5 h，温度为4_℃―→用NaCl溶液洗去多余的蛋白酶。 预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中

一、酶、固定化酶与固定化细胞的比较 ①固定化细胞使用的都是活细胞，因此应提供一定的营养物质。 ②固定化细胞由于保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变较小，酶活性受外界影响也较小。 二、固定化酶的制备及利用 1．酶的固定化：(1)18.6%的CaCl2溶液和甲醇溶液处理(10 s)，冲洗、吸干。 (2)3.65 mol/L的盐酸水解(45 min)，蒸馏水冲洗至中性。 (3)在5%的戊二醛溶液中浸泡(20 min)。 (4)0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤，(多次)吸干。 (5)放1 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中(4 ℃处理3.5 h)。 ↓ 2．检验酶的活性：(1)用固定化酶在适宜温度下分解蛋白质(10 min) (2)用双缩脲试剂检验 ↓ 3．酶的再利用：用取出的固定化酶再分解蛋白质

固定化酶的四种方法

1吸附法:利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可 以得到较高活性的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。 2交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键。常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。 3载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。共价键结合法:共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的一种方法。此法研究较为成熟，其优点是酶与载体问连接牢固，即使用高浓度底物或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和载体的分离，因此具有良好的稳定性及重复使用性。缺点是反应条件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损。 4包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化。但是此法只适用于小分子底物和产物的酶催化反应，因为只有小分子反应底物或产物，才可以通过高分子聚合物进行扩散。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。 酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。本实验中为什么选用石英砂来固定化酶？ 本实验中为什么选用石英砂来固定化酶？答：固定化酶有许多方法，本实验中采用的是吸附法。吸附法有物理交换法和离子交换法两种。其中本实验采用的又是物理交换法。该方法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，且对蛋白质要有高度吸附能力。自然界中有机硅胶、活性炭和石英砂等都可以被用于做载体。现已了解其中石英砂对固定化α-淀粉酶、胰蛋白酶作用较好。

高二生物酶的固定化

第四节 酶的固定化 【课标要求】 1．掌握固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2．尝试制备固定化酶，并检验酶的活性 【知识梳理】 （向下移动位置） 实践案例：木瓜蛋白酶的固定化 1．木瓜蛋白酶的作用：可以使蛋白质水解成 ，供酵母菌 所需，从而 发酵时间，提高啤酒 ，使酒质 醇和。 2．材料器具：见课本49页 3．活动程序： （1）酶的固定化 方法： ↓ 载体： 经一系列操作后，即可得到 。 （2）检验酶的活性 最适宜温度 ↓ 双缩脲试剂A 液和B 液 1号烧杯颜色： 2号烧杯颜色： 原因 （3）酶的再利用 3号烧杯颜色 ↓ 说明了 。 （向下移动） （4）结果记录 小结： 和 技术的应用，大大提高了酶在生产上的利用率。 定义：通过 或 的方法，将水溶性的 与不溶性的 结合，使酶固定在 上，并在一定的空间范围内进行 ， 这样制成的酶称为 。 ① ：将酶通过 以 结合到 等 上。 方法 ② :将酶均匀 在 等多孔性的 中的固定化方法。 ③ ：将酶吸附在载体表面上而被固定。 优点：固定化酶活性 ，可以 使用 次。 工业生产可以实现 、 、 极大降低生产成本。 1．固定化酶 2．固定化细胞 定义：利用适当的 将合成酶的 固定起来。 方法：多采用包埋固定法。（原因：细胞个大，而酶分子较小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。 优点：操作更容易更 ，使用 更长。 固定化细胞不需要酶的提取，减少了酶活力的损失和操作。

探究活动：大肠杆菌细胞的固定化 1．用培养基培养大肠杆菌，取1ml 加入烧杯中，再加入8ml 和体积分数为9%的1．6ml，搅拌均匀，待凝固后，切成小块，用和洗涤，即得到固定化大肠杆菌细胞。 2．胰凝乳蛋白酶的固定化 从提取，并以为载体，将胰凝乳蛋白酶固定化。 【复习指要】 1．学法指导：本节课应初步学会固定化酶的方法，引导学生理解固定化细胞和固定化酶这两种技术的区别与联系，辩证地认识这两种技术的优势与不足。本节课的固定化酶的方法和制备固定木瓜蛋白酶的操作过程应引起重视，在高考选择题和实验题中都有可能体现。 2．疑难解析： 辩证地认识固定化细胞和固定化酶两种技术的优势与不足。如：固定化细胞操作容易，对酶活性的影响更小，可以催化一系列的反应，容易回收等，但由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。 【典题解析】 1．关于固定化酶技术说法正确的是（） A．固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术 B．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应 C．固定化酶中的酶无法重复利用 D．固定化酶是将酶固定在一定空间的技术 [解析]固定化酶是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，其优点是酶被固定在一定装置内可重复利用，不足是无法同时解决一系列酶促反应。 [答案]D 2．研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸二酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的（） A．温度B．PH C．水分D．营养 [解析] 固定化酶技术是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术,利用了酶的高效性和专一性．酶与微生物比较来说,它的活性发挥不需要营养． [答案]D 【聚焦高考】

酶的固定化方案

酶的固定化的方案 一、材料和方法 1.实验材料及试剂 酶，25%戊二醛溶液，带氨基的载体，考马斯亮蓝，牛血清白蛋白。 2. 主要实验仪器 紫外可见光分光光度计Uv-1800，THZ一C恒温振荡器，MD200一3型电子天平PHS一3C酸度计 3.酶的固定化方法 1）载体的活化 a 对所得的载体表面带有大量的氨基，对其进行活化处理可用于酶蛋白的共价结合。采用戊二醛为活化试剂，使凝胶表面连接上游离的醛基。具体方法为:将lg带氨基的载体颗粒臵于3ml、10%的戊二醛溶液中振荡24h，然后真空过滤。所得固体用去离子水洗涤多次，干燥后即为戊二醛活化的树脂颗粒。 b大孔树脂预处理方法：称取10g树脂于锥形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤，用1L蒸馏水冲洗。树脂依次用25mL的5%HCl和5%NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用蒸馏水洗至中性。抽滤后臵于4℃冰箱中干燥4h，室温保存备用。 举例：称取适量经预处理的大孔树脂于50mL锥形瓶中，加入适量磷酸缓冲液（pH7.5，0.05mol/L）和适量的酶，臵于恒温水浴振荡器中吸附一定时间后（37℃，150r/min）真空抽滤，并用100mL缓冲液冲洗载体，抽干后臵于4℃冰箱中干燥4h，并于4℃冰箱中密封保存。 2）固定化方法 a 共价结合法 准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。然后于冰浴中缓慢振荡24h。之后离心收集固体，用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。 b 酶聚集体包被法 准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。然后于冰浴中缓慢振荡24h。之后向混合液中加入0.5ml、2%的戊二醛溶液，继续振荡10h，离心收集固体。最后用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。

酶的固定化

选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 1）离子键结合法： 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法 所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 2）共价键结合法 载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括： （1）天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等； （2）有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等 （3）无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。 用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有： Asp Glu侧链的—COOH、C-末端的—COOH；Tyr的苯酚基；Cys的—SH；Lys的ε-NH2、N-末端—NH2；Thr、Ser的—OH；His的咪唑基。 在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。 载体活化方法： （1）重氮化法 （2）叠氮法 （3）溴基化法 （4）烷基化法等。 4、交联法 借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。 常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。 其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个—NH2，戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。 交联酶法 借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。可视为一种无载体的固定化方法。 如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2～7.2，0℃下交联24h，可制成固定化酶。 共交联法 共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。 通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。 如一定量的脲酶加入到2.5mL含6%牛血清蛋白、0.2%戊二醛的0.02mol/L 磷酸缓冲液中，混合均匀后降温至-30℃，再升温至4℃，静置4h，形成泡沫状聚合物，冷冻干燥后，即为固定化酶。 5、热处理法 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化。 严格控制加热温度和时间。 细胞的固定化方法