杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法

杂交瘤技术的单克隆抗体的

制备方法

-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法

冉继平

摘要：本文主要介绍了单克隆抗体、杂交瘤技术以及运用杂交瘤技术制备单克隆抗体的步骤。还对三种（包括人促甲状腺激素单克隆抗体、绵阳早孕因子单克隆抗体、阿莫西林单克隆抗体）不同的单克隆抗体的制备方法和临床运用做了简单的介绍。

关键词：单克隆、抗体、杂交瘤技术。

1.0 杂交瘤单克隆抗体的简介

抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

杂交瘤单克隆抗体的原理是: B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。杂交瘤技术产生单克隆抗体的步骤

一.提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。

二.应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既

具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性

三.对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，体外或体内培养，从培养液或

动物腹水中提取单克隆抗体

2.0 单克隆抗体的实例

单克隆抗体用于临床诊断和治疗，目前研究的单克隆抗体非常的多，下文就会介绍几种单克隆抗体的的应用实例：

2．1 人促甲状腺激素单克隆抗体

人促甲状腺激素是脑垂体分泌的促进甲状腺生长和机能的糖蛋白激素。血液中人促甲状腺激素含量的异常变化会起机体产生一系列甲状腺疾病例如原发性甲状腺功能减退，甲状腺肿瘤及新生儿呆小症等。给社会和家庭带来了巨大伤害。因此，临床上将血清人促甲状腺激素含量作为评估甲状腺功能是否正常的首选指标。所以建立快速精确的人促甲状腺激素检测方法成为了预防甲状腺疾病的关键。目前检测人血清人促甲状腺激素常用方法均为免疫分析法：包括兔疫放射分析和酶联兔疫等。无论哪一种方法制备特性强灵敏度高的单克隆抗体才是实现精确检测的前提。采用杂交瘤技术取经兔疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮阳性筛选和亚克隆得到能稳定高效分泌抗人促甲状腺激素单克隆抗体的杂交瘤细胞株

由于人促甲状腺激素单克隆抗体的成功制备，成为了医学临床上检测甲状腺疾病的有效方法，是预防甲状腺疾病的关键。

2．2 绵阳早孕因子单克隆抗体

在养殖生产中及时进行妊娠诊断,减少空怀发生,是提高生产效率的重要技术措施之一。目前,绵羊妊娠诊断周期长、效率低,需要探索一种快速、高效、简便的新方法。为此,制备了绵羊早孕因子单克隆抗体,旨在为检测绵羊早期妊娠情况及评定胚胎移植效果奠定基础。

为制备绵羊早孕因子(EPF)单克隆抗体,以纯化的EPF 重组蛋白为抗原免疫BALB/ c 小鼠,免疫4 次后,取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 融合,采用间接ELISA 方法筛选单克隆抗体细胞株,将筛选的细胞株注入小鼠腹腔得到腹水型抗体,用G - sepharose 柱亲合层析法对小鼠腹水型抗体进行纯化,应用SDS - PAGE 和Western blot 分析抗体纯化后的纯度及特异性。结果,细胞融合后得到了1 株抗绵羊EPF 单克隆抗体的细胞株B4D5,纯化后的腹水型单克隆抗体纯度较高,具有较强的特异性,应用单克隆抗体检测绵羊妊娠准确率为81. 3%。表明,制备的绵羊早孕因子单克隆抗体为特异性抗绵羊早孕因子抗体。

早孕因子在绵羊妊娠2 d 后即能检测出来,若用绵羊早孕因子单克隆抗体检测绵羊妊娠情况,则大大提前了确定绵羊怀孕的时间。若绵羊怀孕期间胎儿出现死胎,绵羊EPF 将很快从母体中消失,通过此现象还可以用绵羊EPF 单克隆抗体检测怀孕母羊腹中胎儿的生长情况。目前国内外还没有测定绵羊怀孕的商品化试剂盒或试纸条,本试验制备的绵羊EPF 单克隆抗体给此项技术提供了物质基础,若能在此基础上生产出商品化的试剂盒或试纸条,则将在绵羊早期妊娠鉴定方面具有突破性的意义。

2．3 抗阿莫西林单克隆抗体

阿莫西林属于在畜、禽养殖业广泛使用的青霉素类抗生素。目前，对畜产品或动物源性食品中阿莫西林和氨苄西林残留量的检测主要采用高压液相色谱法和高压液相色谱-质谱串联法。这两种方法虽然敏感、准确，但是检测时间长、时效性差、耗资大、技术性要求高，且要有昂贵的仪器，不适合大量样品的筛选测定。开发灵敏、准确、快速的针对动物源性食品中阿莫西林免疫检测技术及其产品是对现有仪器检测方法的一个重要补充，其检测成本低、使用便利的特点能够实现企业原料和产品的现场监测。但开发该技术的关键是拥有抗阿莫西林的抗体。因阿莫西林的相对分子质量仅为419．45，不具有免疫原性，与大分子的载体蛋白交联才能更好地刺激机体产生免疫应答。将小分子的阿莫西林交联在大分子载体牛血清白蛋白和匙孔嘁血蓝蛋白上，KLH交联物用于免疫BALB／e小鼠，采用B细胞杂交瘤技术，通过融合，筛选制备抗阿莫西林抗体。

我们将小分子阿莫西林与大分子蛋白质载体交联，免疫小鼠，制备出抗阿莫西林单克隆抗体，并对其交叉反应进行初步鉴定，为建立食品中阿莫西林残留的免疫学检测方法奠定了基础。

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫

杂交瘤技术的基本原理

杂交瘤技术的基本原理 1975年G. Kohler和C. Mistein利用细胞融合技术，首次获得能生产单一抗体的杂交瘤细胞。与血液中的多种抗体比较，单克隆抗体更具有其特殊的优点。也正是它的特异性和高纯度的单一性而被利用于多种产业，从而获得巨大的经济效益。 抗体由B淋巴细胞产生，为了得到能产生单一抗体的淋巴细胞，并且要求这种淋巴细胞既能在一般的体外培养条件下进行正常的生长繁殖，而且还要能持久的产生这种单一抗体。G. Kohler和C. Mistein 发现存在多发性骨髓瘤疾病中的B淋巴肿瘤，由于在浆细胞中发生了成瘤转而能产生免疫球蛋白，而且这种细胞能在体外生长易被克隆。。受到这种天然肿瘤B淋巴细胞能产生抗体的启发，他们利用骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合成杂交瘤细胞制造各种单克隆抗体，使之成为一种成型的生产单克隆抗体的杂交瘤技术。 骨髓瘤细胞可以在体外生长，而且比正常细胞生长繁殖速度要快。此种细胞可以从患骨髓瘤的小鼠体内中获得，只是这种细胞不会产生抗体。用特定的抗原刺激正常小鼠脾脏B淋巴细胞，B淋巴细胞就会产生相应单一的特异性抗体，但这种B淋巴细胞却难以体外培养。杂交瘤技术就是将这两种具有功能的细胞融合在一起，在体外快速生长的杂交瘤细胞。此种杂交瘤细胞群持续分泌的成分但已有特异性的抗体。我们称为单克隆抗体。 其原理从三个方面阐明： (一)细胞的选择与融合

建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。 使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG1 000～2 000)是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40%(W/V)。 (二)选择培养基的应用 细胞融合一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活5～7d，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 细胞DNA合成一般有两条途径。主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，

杂交瘤细胞生成抗体技术

杂交瘤细胞生成抗体技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。 1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理 标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法 单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限

杂交瘤技术的实验原理及其操作演示(4学时)

教案 课程名称细胞生物学实验授课题目（章、节）实验八：杂交瘤技术的实验原理及其操作演示授课老师刘庆平授课对象2002级生物工程授课时间第十三周教学方法理论教学选用教具多媒体教学实验内容提要： 杂交瘤技术的实验原理及其操作演示（4学时） 第一节实验介绍150分钟 （一）、实验原理； （二）、实验目的； （三）、实验用品； （四）、实验方法和过程； （五）、实验结果分析； 第二节．实验多媒体示教30分钟

教学重点、难点及基本要求： 重点及难点： 杂交瘤获得成功的基本要素。 1、动物免疫 2、细胞融合 3、杂交瘤细胞的融合 基本要求： 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法 2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体 教研室主任意见： 单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等） 本教案以讲授一个单元（2-4学时）一次实验（实习）为单位填写。填写要用钢笔。字迹要清晰、工整。按表项目逐一填写。

实验二杂交瘤技术的实验原理及其操作演示 （多媒体教学演示4学时） 杂交瘤技术是1975年Kohler和Milstein用于制备单克隆抗体而创建的一项重要技术，被誉为“免疫学上的一次革命”。此技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备。抗体是由B淋巴细胞分泌的，一个B淋巴细胞只能分泌一种抗体。把B淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌的杂交瘤细胞，如果把单个杂交瘤细胞克隆化，扩增传代，其分泌的抗体即为高度纯一的单克隆抗体。单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能结合一种特定的抗原决定簇。正是由于其这种高度专一性，因此被广泛用于疾病的论断和治疗，生物大分子的鉴定、定位和分离纯化，以及一些细胞器，特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离等方面, 具有极其远大的应用前景, 因此，用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要，应用范围越来越广。 实验目的 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法 2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体 实验原理 杂交瘤技术的建立基于以下三种关键技术。 一、动物免疫 动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。 二、细胞融合 B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。 脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官, 取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞, 自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。

单克隆抗体制备方法(全)

单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

杂交瘤技术基本程序与方法

杂交瘤技术基本程序与方法 一、杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HA T培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。 二、基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml 注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。 淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、

杂交瘤技术制备单克隆抗体

杂交瘤技术制备单克隆抗体 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体制备的一般流程如下:

单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合

单克隆抗体制备过程中的两次筛选

单克隆抗体制备过程中的两次筛选 动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。 第一次筛选： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。 其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选： 在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合

杂交瘤技术制备单克隆抗体

杂交瘤技术制备单克隆抗体 来源：https://www.wendangku.net/doc/ab13921690.html, 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体制备的一般流程如下:

单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后

单克隆抗体制备实验过程

单克隆抗体制备实验过程 I 细胸培养 选出所需要的细J腕 群,继续培养 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞 的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器 官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。 杂交瘤细腕 体内培养 体外培养 从培养液中 \ /从腹水中提取 单克隆抗体

说明：FCA弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody ，北京康碧泉公司研制 的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。 PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。 2 、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3 、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合（Cell fusion） 【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3?5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围

的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3?5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml, 1000r/min 离心5min,弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5?2X 108个脾细胞。 (3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊 从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟， 随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2X 105/ml，备用。 (4)主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium )两种基础培养基，配好后过滤除菌 (0.22um),分装，4C保存。 不完全RPMI-1640培养基: 完全RPMI-1640或DMEI培养基: HT或HAT培养基:

淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

一、细胞融合前准备 (一)免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射 ) ↓2～3周后 第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注 射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射 │(一般0.8～1ml0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后

第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二)饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入6～8ml培养液 ↓ 反复冲洗，吸出冲洗液

制备单克隆抗体方法

制备单克隆抗体方法 1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。 这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法(“导弹”疗法，利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位。因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。 制备过程

1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。