羊产气荚膜梭菌的分离鉴定
一株羊源产气荚膜梭菌的分离及鉴定
金铎*1,2，林家琪1,2，董真1,2，展天松1,2，顾敏1,2，焦库华1,2，王彦红*1,2，刘文博*，1,2
（1，扬州大学兽医学院, 扬州，江苏， 225009；
2，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州，江苏，225009；）
摘要：2013年4月，扬州大学动物医院畜禽门诊接诊一例山羊急性死亡的病例，对其进行剖检，无菌恒温厌氧分离培养，纯化鉴别，革兰氏染色，生化反应，结果表明为产气荚膜梭菌，并对此进行了一定的讨论
关键词：产气荚膜梭菌；分离；鉴定。
产气荚膜梭菌旧名魏氏梭菌，产气荚膜杆菌，根据致死性毒素与其抗毒素的中和实验，将此菌分为A、B、C、D、E 5个类型，以菌体抗原进行血清型分类意义不大，菌体抗原与毒素分型之间没有明显关系，毒素至少已经发现15种，其中α、β、ε、ι、δ、θ、κ、λ、μ、υ、CPE、其他毒素、神经氨酸酶等。A型、C型、D型的某些菌株可以产生肠毒素，A型产气荚膜梭菌主要引起动物的气性坏疽，牛、羔羊、新生羊驼、驯鹿、仔猪、家兔的肠毒血症，B型菌主要引起羔羊痢疾，还可以引起犊牛、羔羊、山羊的肠毒血症或坏死性肠炎，C型菌是绵羊猝狙的病原。D型、E型菌也是导致牛羊肠毒血症和猪的腹泻[1]。笔者结合相关知识，在此整理于扬州大学动物医院所见的一例羊源产气荚膜梭菌感染的疾病。
1材料与方法
1.1病料来源
2013年4月，江苏某养殖户饲养的240多只母山羊陆续产羔，羔羊在产后24-48小时开始出现剧烈腹泻，拉水样黑色稀粪，虚弱，随后死亡，羔羊的死亡率达60%。剖检后发现病死羊羔严重脱水，真胃和大肠内容物呈糊状，小肠壁变薄，或黄或黑，透明，充满空气，部分肠道黏膜充血出血，卡他性出血性炎症,
*基金项目：江苏高校优势学科建设工程；江苏省大学生创新训练计划省级重点项目（201311117039Z）
作者简介：金铎（1992—），男，山东青岛人，扬州大学兽医学院本科生，主要从事羊临床菌株耐药性及质粒指纹图谱分析研究。
*通讯作者：王彦红，扬州大学兽医学院讲师，E-mail: wyh7405@https://www.wendangku.net/doc/ab1463038.html,
*通讯作者：刘文博，扬州大学兽医学院副教授，E-mail: lwb@https://www.wendangku.net/doc/ab1463038.html,
肝脏肿大。临床疑为产气荚膜梭菌感染，需进一步进行实验室检测。
1.2细菌分离
取山羊的肠道、肝脏、脾脏、肾脏等病变组织在无菌环境下接种与血琼脂平板上，在37℃条件下用烛缸厌氧罐进行厌氧培养24小时。然后在无菌条件下分
别挑取血平板上的单个菌落，在血平板和麦康凯琼脂近进行鉴别培养。取单个菌
落进行革兰氏染色，镜检。
1.3生化试验
利用细菌微量生化反应管（购于杭州微生物试剂有限公司，操作方法与判定标准参照该公司操作方法与标准）对所分离的菌株进行生化指标测定，利用牛乳
进行暴烈牛乳发酵实验。在37℃条件下培养24h，然后观察结果。
2结果
2.1细菌分离
取山羊的病变组织（肺脏）在无菌环境下接种于血琼脂平板上，37℃条件培养24h后出现表面光滑、半透明、圆屋顶状的菌落。菌落周围有溶血环，出现明
显的双溶血环，内环为完全溶血，外围为不完全溶血环。经过纯化培养，麦康凯
琼脂板上没有菌落生长。经过革兰氏染色镜检，结果菌体为直杆状，两端钝圆，
单个或成双的革兰氏阳性细菌，芽孢大而卵圆。肝脏，肾脏，脾脏与分离结果相
同。
2.2生化实验结果
分离菌接种在生化反应管后于37℃培养24h后，取出观察，分离细菌能发
酵葡萄糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖等，爆裂牛乳发酵实验呈现明显的阳性。其
他生化试验结果见下表(表1)。
表1生化实验结果
发酵反应
项目消化酪蛋白水解明胶酯酶卵磷脂酶葡萄糖麦芽糖乳糖蔗糖吲哚实验甘露醇硫化氢硝酸盐实验牛乳实验分离株+ + - + + + + + - - + + + 3讨论
本病例中病死山羊的肠道出现明显卡他性渗出并伴有出血症状，肝脏和肾脏出现坏死灶。分离菌株为直杆状，两端钝圆，单个或成双的革兰氏阳性细菌，芽孢大而卵圆。通过生化试验检验，结果表明病原菌与产气荚膜梭菌的生化反应结果一致，从而证明分离菌是产气荚膜梭菌。该病例的死亡率较高，对羊群危害较大。近年来，江浙一带地区养羊的人越来越多，产气荚膜梭菌对于草食动物的危害非常严重，本病的研究有重要意义。本病的防治重在饲养管理，保持环境，温湿度稳定。平时要注意搞好环境卫生，及时清理粪便，定期用生石灰、百毒杀等不同消毒剂杀灭环境中的病原体。不要突然更换饲料，平时可在饲料中添加微量元素硒，增加益生菌以调节肠道中的正常菌群平衡对减少本病的发生具有一定的临床效果［3］。加强对畜舍环境和粪便内产气荚膜梭菌的检测和监控有利于该病的防控，对暴发过该病的地区，需要掌握其流行形势以便于采取合理防治措施［4］。该疾病发展太快，治疗一般是没有太大效果。接种疫苗是预防本病的一种有效方法，预防羔羊痢疾、猝狙，肠毒血症等，可用三联菌苗和五联菌苗进行免疫防治。
由于产气荚膜梭菌病常呈急性散发, 目前尚无有效的治疗措施,治疗时一般遵循强心补液、解毒、镇静、调理肠胃的原则, 进行对症治疗；给予抗生素等药物, 如青霉素、四环素等,值得注意的是，磺胺嘧啶和多粘菌素类药物对产气荚膜梭菌生长没有抑制作用，对其他的细菌却有较强的抑制作用［5］，应用这两类
药物治疗产气荚膜梭菌感染往往不会得到理想的结果；采用同型的高免血清治疗, 对症加减, 也可收到一定的效果。中药治疗法, 采用能增加胃肠蠕动、清热解毒、凉血止痢、阻止瘟疫热毒进入机体的中药, 如黄芩黄连解毒汤加减, 煎水灌服, 每天2次,连用3～5d, 可收到良好的效果［6］。临床上，产气荚膜梭菌常与其他
菌混合感染，如巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等等［7］，在诊断和治疗的时候应格外注意，不能仅仅针对单一病原采取对症治疗措施而忽略可能的继发感染。
产气荚膜梭菌是羊肠道内正常菌，正常情况下数量有限，肠道菌群处于平衡状态，其发病原因主要与气候变化饲养管理不当或疫苗免疫失败等有关，如长期阴雨潮湿饲喂精料过多粗纤维含量较少，致使肠道正常菌群失调，产气荚膜梭菌
大量繁殖，产生毒素，使机体发病产气荚膜梭菌有不同的血清型［8］，确诊本病应依靠实验室诊断血清型鉴定，否则可能导致误诊。
参考文献：
［1］陆承平.兽医微生物学（第四版）［M］.中国农业出版社，2007：193-195
［2］张红英,卢中华,杨霞,王亚宾,金钺. 我国魏氏梭菌病的流行特点[J]. 中国畜牧兽
医,2004,1:39-41.
［3］李长安,王正园,常顺兰. 牛魏氏梭菌病概述[J]. 畜牧兽医杂志,2012,6:48-49+52
［4］郑晓丽,窦贤明,胡道俊,肖勇,赵翠荣,倪学勤. 湖北襄阳地区规模化牛场产气荚膜梭菌的分离和鉴定[J]. 湖北农业科学,2011,23:4893-4895.
［5］陈天寿. 微生物培养基的制造与应用［M］. 北京: 中国农业出版社，1995:332.
［6］郑晓丽,窦贤明,胡道俊,肖勇,赵翠荣,倪学勤. 产气荚膜梭菌对养牛业的危害及其防制[J]. 中国畜牧兽医，2010,8:211-214
［7］盛卫东. 魏氏梭菌病的诊断与综合防治[J]. 农技服务,2013,2:173+175.
［8］梁淑珍,徐明举. 山羊产气荚膜梭菌病的诊治[J]. 畜牧与兽医,2011,11:72-73.
产气荚膜梭菌检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准 食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验 1范围 本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。 本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。 2设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a）恒温培养箱：36℃±1℃； b）冰箱：2℃～5℃； c）恒温水浴箱：50℃±1℃，46℃±0.5℃； d）天平：感量0.1g； e）均质器； f）显微镜：10×～100×； g）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头； h）无菌试管：18mm×180mm； i）无菌培养皿：直径90mm； j）pH计或pH比色管或精密pH试纸； k）厌氧培养装置。 3培养基和试剂 3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A中A.1。 3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A中A.2。 3.3缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录A中A.3。 3.4乳糖-明胶培养基：见附录A中A.4。 3.5含铁牛乳培养基：见附录A中A.5。 3.60.1%蛋白胨水：见附录A中A.6。 3.7革兰氏染色液：见附录A中A.7。 3.8硝酸盐还原试剂：见附录A中A.8。 3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中A.9。 4检验程序
产气荚膜梭菌检验程序见图1。 图1产气荚膜梭菌检验程序 5 操作步骤5.1样品制备 5.1.1 样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃～5℃保存；如8h 内不能进行检验，应以 无菌操作称取25g （mL ）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。5.1.2 以无菌操作称取25g （mL ）样品放入含有225mL 0.1%蛋白胨水（如为5.1.1中冷冻保存样品， 室温解冻后，加入200mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min ～2min ；或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8000r/min ～10000r/min 均质1min ～2min ，作为1:10稀释液。5.1.3 以上述1:10稀释液按1mL 加0.1%蛋白胨水9mL 制备10-2～10-6 的系列稀释液。
临床微生物与检验名词解释
临床微生物与检验名词解释 名词解释 1、CPE:细胞病变效应,当病毒在宿主细胞增值时引起的细胞形态学的改变,常见细胞变圆,聚集,坏死,脱落等. 2、Dane颗粒:又称大球形颗粒,是完整的感染性病毒颗粒,呈球形,直径为42nm,具有双层衣壳.外衣壳相当于一般病毒的包膜,由脂质和蛋白质组成,镶嵌有HbcAg前S抗原. 3、EB病毒:一种疱疹病毒。引起传染性单核细胞增多症，并与伯基特(Burkitt)淋巴瘤、鼻咽癌以及多种淋巴瘤的发生有密切关系 4、E实验:是一种结合稀释法和扩散法原理对抗微生物药物直接定量的药敏实验技术. 5、H3N2型流感病毒的检验步骤:①标本采集与处理:无菌收集拭子或咽喉含涑液,用青霉素和链霉素处理消除杂菌;②鸡胚接种:将标本接种于9-11日的鸡胚中,初次接种于鸡胚的羊膜腔,传代培养接种尿囊腔,33-34℃培养2-3天,收集羊水或尿囊液;③血凝试验:甲型流感病毒能凝集人O型,鸡和豚鼠的红细胞,显阳性接着作血凝抑制试验;④血凝抑制试验:可确定病毒的型和亚型,用相应的特异性抗体如抗体H3去做试验,阳性者再确定N2. 6、HbsAg:表面抗原,大量存在于感染者血液中,是HBV感染的主要标志,具有良好的抗原性,也是制备疫苗的主要成分. 7、HIV:又称人类免疫缺陷病毒,是引起艾滋的病原体,形态为球形,包膜含有两种蛋白gp120和gp41,容易发生变异,病毒核心呈圆锥状,含有两条相同的RNA、核衣壳蛋白及逆转录酶等. 8、Nagler反应:卵磷脂酶具有抗原性,它的活性可被相应的抗血清所抑制.测定时在乳糖卵黄牛乳琼脂平板的半侧涂以A型产气荚膜梭菌与A型诺维梭菌混合抗毒素,而后从未涂抹康堵塞的一侧向涂抹抗毒素的一侧接种待测菌,厌氧培养18h后观察. 9、OT试验:是用结核菌毒素来测定机体能否引起皮肤迟发性过敏反应的一种试验,以判断机体对结核杆菌有无免疫力. 10、O抗体和H抗体的变化特点判断肥达试验的结果？若O、H凝集效价均超过正常值，则肠热症的可能性大，若两者均低，肠热症的可能性小，若O不高H高，可能预防接种或非特异性回忆反应，若O高H不高，则可能感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌感染。 11、SPA:即葡萄球菌的A蛋白,90%的金黄色葡萄球菌的细胞壁上含有此蛋白,能与IgG的Fc段非特异性结合,具有介导抗吞噬和协同凝集的作用. 12、白喉杆菌体外毒力试验的原理、方法及结果判断。①琼脂平板毒力试验。将含有20%牛血清肉汤琼脂分注与平皿中，每只平皿10ml，50℃冷却，在凝固之前，将浸有白喉抗毒素血清稀释液的滤纸条沉于琼脂内，制成平板(Elek平板)。在与滤纸条相垂直的方向将待检菌画直线接种，划线宽度约6-7mm，两端与皿壁连接。同时，与之相距10mm处平行划线接种一标准产毒菌株，作为阳性对照。37℃培养24-48小时，若菌苔两侧出现斜向外延伸的乳白色沉淀线，并与其邻近的标准产毒株的沉淀线相吻合，则为产毒株。②SPA协同凝集试验：将白喉抗毒素IgG先吸附在SPA上，再加入待检菌培养物上清液。若有白喉外毒素，则与SPA-IgG结合出现可见的凝集反应。③对流电泳：将已知的白喉抗毒素和待检菌培养液分置琼脂板两孔之中，电泳30min后，若两孔之间出现白色沉淀线，表明待检菌为产毒株。 13、白喉杆菌异染颗粒:在细胞内呈颗粒状，主要成分为RNA及嗜碱性的多偏磷酸盐，因亚甲蓝染色时不同于菌体着色，呈紫色而得名，或称迂回体。由于常见于白喉棒状杆菌，位于菌体两端，故又称极体，有助于鉴定 14、白色念珠菌感染的微生物检查方法及结果分析。①直接镜检可见革兰阳性、圆形或卵圆形芽生孢子及假菌丝②分离培养在沙氏培养基上形成乳白色或淡黄色类酵母菌落，镜检可见假菌丝及成群的卵圆形芽生孢子③血清学实验可检测多种假丝酵母菌的抗体，应用ELISA或胶乳凝集实验可检出白假丝酵母菌细胞壁甘露聚糖。④动物实验将白假丝酵母菌悬液1ml经尾静脉或腹腔注入小鼠或耳静脉注入兔体内，5-7天后动物死亡，解剖发现肾、肝等有脓肿。 15、包涵体:包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子. 16、鞭毛:是从细菌细胞膜伸出于菌体外的细长弯曲的蛋白丝状物，是细菌的运动器官，见于革兰阴性菌、弧菌和螺菌。 17、变形杆菌属:是一群动力活跃、产硫化氢、苯丙氨酸脱氢酶和脲酶均阳性的细菌.广泛存在于泥
产气荚膜梭菌
产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌是厌氧芽孢梭菌属中能引起人类严重疾病的重要致病菌。 1．生物学和病原学特点 产气荚膜梭菌为厌氧革兰阳性粗大芽孢杆菌，无鞭毛，不运动，孢子卵圆，次端生，在一般培养基上稀少。无外孢子壁，无附属丝：表面菌落直径2～5mm，圆形，有时边缘扩展、突起，呈淡灰黄色，半透明，表面有光泽，可在20～50℃生长，最适生长温度45℃，所有菌株均发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气；多数菌株能还原硝酸盐为亚硝酸盐，能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落。产气荚膜梭菌见图3～11。 该菌能分泌强烈的外毒素和侵袭性酶，具有强烈致病性和侵袭力，在人和动物体内可形成荚膜。产气荚膜梭菌在自然界的土壤、水和空气中广泛存在，人和动物的肠道是其重要的寄居场所，一般各类粪便每克含量可达10
2～109个之多，但不经肠道感染宿主，只是污染外环境。由于产气荚膜梭菌是正常肠道菌群的一部分，人体肠道对其无天然特异免疫力，所有人群均为易感者，以婴儿和年老体弱者病情更重。经口食人是其主要传染途径，也可由伤口感染，夏秋季节多见。 2．致病性和临床表现 产气荚膜梭菌的致病物质为外毒素、肠毒素和荚膜。外毒素根据性质和致病性不同，分为A、B、c、D、E 5个类型，其中A型菌株是人类最重要的致病菌，外环境中的分离株80％以上属A型，此型可致气性坏疽、食物中毒和坏死性结肠炎；C、D型也是人类的病原菌，C型的部分菌株能引起人的坏死性肠炎；其他为兽类病原菌。 摄食被A型或某些C型菌株污染的食物，引起的食物中毒，潜伏期为8～24h，发病时下腹部剧烈疼痛、腹泻，但为自限性感染，一般1～2d内可自愈，老弱患者和营养不良儿童偶可致死。另一种食物中毒的表现是坏死性肠炎，由C型菌β毒素引起，潜伏期不到24h，起病急，有剧烈腹痛、腹泻，肠黏膜出血性坏死，粪便带血，可并发周围循环衰竭、肠梗阻、腹膜炎等，病死率高达40％。3．食品安全危害 产气荚膜梭菌在污水、土壤、垃圾、人和动物的粪便以及食品中均可检出，土壤中的检出率达100％。被污染的食物主要是肉类和鱼贝类等蛋白质性食品，由于存放较久或加热不足使细菌大量繁殖，形成芽孢时产生大量的肠毒素，引起食源性疾病。多食肉而卫生条件差的城市和集体食堂中易造成产气荚膜梭菌的扩散传
饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进
饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进 潘宝怡，吴清平，彭飞艇，周锦祯，郭伟鹏 (广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东省华南应用微生物重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地，广东省微生物研究所,广东广州 510070) 摘要：针对饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）检测国家标准方法中,滤膜上的菌落在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂经24 h厌氧环境培养后黑色产生不明显的问题，对检验方法进行改进。国标改进方法一：按GB/T 8538.4.55-2008进行过滤后增加一步骤,即用SPS培养基（约10 mL）倾注于培养皿的膜上,然后放置厌氧培养；国标改进方法二：按GB/T 8538.4.55-2008进行过滤后将滤膜反贴于SPS培养基上，然后放置厌氧培养。对方法进行改进后，国标改进方法一和国标改进方法二滤膜上的菌落经24 h厌氧环境培养后均有明显的黑色产生。国标方法黑色菌落不明显，国标改进方法一和国标改进方法二产生的黑色菌落数与国标方法相比，具有显著性差异（P<0.01）。国标改进方法一不但有利于产气荚膜梭菌黑色的产生，而且容易挑取菌落做进一步试验。 关键词：饮用矿泉水；产气荚膜梭菌；方法；改进 文章篇号：1673-9078(2012)9-1236-1238 Improvement of Detection Method for Clostridium Perfringens in Drinking Natural Mineral Water of the National Standards PAN Bao-Yi, WU Qing-Ping, PENG Fei-Ting,ZHOU Jin-Zhen, GUO Wei -Peng (Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base), South China, Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China) Abstract: The target colonies on the filtration membrane could not turn black obviously on sulfite - polymyxin - sulfadiazine agar after 24 h incubation in anaerobic conditions based on national standard method for the detection of Clostridium perfringens in drinking mineral water. To solve the above problem, the detection method was improved according to the methods of GB/T 8538.4.55-2008. After filteration, the S PS medium (10 mL) was poured on the membrane in the petri dish, and then placed in anaerobic conditions. Another improvement method was also based on the methods of GB/T 8538.4.55-2008. After filtration, the membrane was placed on the SPS culture medium at the reverse side, and then placed in anaerobic conditions. Using the two improved methods, the colonies of C. perfringens on the filtration membrane could turn black obviously after 24 h incubation in anaerobic conditions. Obvious difference was found in the number of black colonies using the two improved methods. The first improved method would make C.perfringens colonies turn black easily and obviously, and it also makes easy to pick colonies for further studies. Key words: drinking mineral water; Clostridium perfringens; methods; improvement 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎常见的病原菌。在《饮用天然矿泉水》（GB 8537-2008）标准中要求为0 CFU/50 mL[1]。《饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538-2008）中规定，产气荚膜梭菌在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂(以下简称SPS)上经24 h厌氧环境收稿日期：2012-04-26 基金项目：广东省科技计划项目（2009B030500003）；粤港关键领域重点突破项目（2009Z52） 作者简介：潘宝怡（1983-），女，学士，主要从事微生物安全检测技术研究通讯作者：吴清平（1962-），男，博士，研究员，主要从事食品安全研究培养后应形成黑色菌落，然后取黑色菌落作为疑似菌落再做进一步的确证试验加以证实[2]，但在实际操作中发现，按照GB/T 8538.4.55-2008中产气荚膜梭菌的检测方法，滤膜上的产气荚膜梭菌在SPS培养基上经24 h厌氧环境培养后无明显黑色菌落产生，而如生长出来的为非黑色菌落，则为非疑似菌落，有可能导致漏检，不能真实反映样品中产气荚膜梭菌的存在情况。为解决这个问题，本文对标准中的检验方法进行了改进[3,4]。 1 材料和方法 1236
产气荚膜梭菌检验作业指导书
品有限公司生效日期：2014.01.01 页码：第1页，共2页 1 目的 规定矿泉水产气荚膜梭菌的检验方法，保证按标准化操作。 2 适用范围 适用于产气荚膜梭菌检测。 3 术语 产气荚膜梭菌：是继沙门氏菌、葡萄球菌后引起食物中毒的又一重要的病原菌。属于革兰氏阳性粗大梭菌，芽孢呈卵圆形，肉汤培养时芽孢少见，须在无糖培养基中才能生成芽孢。无鞭毛，不运动，属于专性厌氧菌。 4 职责 质检员负责按作业指导书进行检验。 5 流程图 无 6 作业内容 6.1 检验方法原理 微孔滤膜是一种微孔径的过滤膜（通常孔径为0.22μm、0.45μm，滤膜直径为47mm），滤膜能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上的典型微生物菌落数，算出一定体积水样中含有的微生物菌落总数。6.2 实验器材、培养基及试剂 6.2.1 实验器材 不锈钢过滤器装置、滤膜（直径47mm，微孔径0.22μm）、抽滤设备、无齿镊子、显微镜（10×～100×）、量筒、培养皿、灭菌锥形瓶、恒温培养箱（36±1℃）、恒温水浴锅（46±1℃）、酒精灯、冰箱（0～8℃）、厌氧培养装置、超净工作台。 6.2.2培养基及试剂 庖肉培养基、庖肉牛肉粒、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）、液体硫乙醇酸盐培养基（FT）、动力硝酸盐培养基（A法）、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、1g/L蛋白胨水、硝酸盐还原试剂（甲）、(乙)液、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂配套试剂、革兰氏染色液6.3操作步骤 6.3.1推测性检验 6.3.1.1水样过滤：在100级的洁净工作台进行过滤操作。 6.3.1.2用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好
产气荚膜杆菌
产气荚膜杆菌 百科名片 产气荚膜杆菌 产气荚膜杆菌(Clostridiumperfringen)又名魏氏梭菌(ClostridiumWelchii),它广泛存在于自然环境中,并见于几乎所有温血动物的消化道内,属于人和动物肠道内正常菌群的成员。本菌能引起人类气性坏疽及多种动物的肠毒血症和坏死性肠炎,是近年来我国家畜“猝死症”的主要病原。 特征 为梭状芽胞杆菌类属，是厌氧、无动力、能产生芽胞的革兰氏阳性粗大杆菌，单独或成双排列，两段钝圆，芽孢大，卵圆形，位于次端，在机体内可形成荚膜。无鞭毛不能运动。是气性坏疽的主要病原菌，并可引起厌氧性蜂窝织炎、泌尿系感染和食物中毒。存在于人粪及温血动物的粪便内，可作为粪便污染水体和土壤的指示菌。此菌具有芽胞，污染水体后存活时间较长，对氯等消毒剂有较强的抵抗力。如水体内未检出粪大肠菌群和粪链球菌而仅检出此菌，说明该水体以往曾有过粪便污染。产气荚膜杆菌作为判断土壤是否被粪便污染及污染程度的指示菌。通常用产气荚膜杆菌值表示。 培养特性 非专性厌氧菌，对营养要求不高，在厌氧血琼脂平板上，经35℃，孵育6h即开始生长，24h菌落可达2~4mm，灰白色，光滑，圆形，扁平，半透明，边缘整齐，偶尔可见边缘呈锯齿状或放射条纹的粗造形菌落。大多数A型菌落有双层溶血环，内层是狭窄的β-溶血环，外层是较宽的半溶血环。在庖肉培养中，上部肉汤混浊，肉渣淡红色，不被消化，产气较多，可将覆盖在肉汤使凡士林上冲，汹涌发酵，卵磷脂酶阳性。 家禽感染 由产气荚膜杆菌(clostridium perfringens)在实验感染上得知，其不仅能单独使鸡并发症坏死性肠炎(Necrotricentertis)，且能与球虫混合感染，增强、恶化球虫症之病变或症状，使死亡率变高。又同样，在野外之养鸡场，产气荚膜杆菌与球虫病之合并症，会给与养鸡户很大之经济性蒙害.常表现为：急性或亚急性坏死性肠炎、菌群
2020年产气荚膜梭菌
作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌是厌氧芽孢梭菌属中能引起人类严重疾病的重要致病菌。 1．生物学和病原学特点 产气荚膜梭菌为厌氧革兰阳性粗大芽孢杆菌，无鞭毛，不运动，孢子卵圆，次端生，在一般培养基上稀少。无外孢子壁，无附属丝：表面菌落直径2～5mm，圆形，有时边缘扩展、突起，呈淡灰黄色，半透明，表面有光泽，可在20～50℃生长，最适生长温度45℃，所有菌株均发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气；多数菌株能还原硝酸盐为亚硝酸盐，能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落。产气荚膜梭菌见图3～11。 该菌能分泌强烈的外毒素和侵袭性酶，具有强烈致病性和侵袭力，在人和动物体内可形成荚膜。产气荚膜梭菌在自然界的土壤、水和空气中广泛存在，人和动物的肠道是其重要的寄居场所，一般各类粪便每克含量可达102～109个之多，但不经肠道感染宿主，只是污染外环境。由于产气荚膜梭菌是正常肠道菌群的一部分，人体肠道对其无天然特异免疫力，所有人群均为易感者，以婴儿和年老体弱者病情更重。经口食人是其主要传染途径，也可由伤口感染，夏秋季节多见。
2．致病性和临床表现 产气荚膜梭菌的致病物质为外毒素、肠毒素和荚膜。外毒素根据性质和致病性不同，分为A、B、c、D、E 5个类型，其中A型菌株是人类最重要的致病菌，外环境中的分离株80％以上属A型，此型可致气性坏疽、食物中毒和坏死性结肠炎；C、D型也是人类的病原菌，C型的部分菌株能引起人的坏死性肠炎；其他为兽类病原菌。 摄食被A型或某些C型菌株污染的食物，引起的食物中毒，潜伏期为8～24h，发病时下腹部剧烈疼痛、腹泻，但为自限性感染，一般1～2d内可自愈，老弱患者和营养不良儿童偶可致死。另一种食物中毒的表现是坏死性肠炎，由C型菌β毒素引起，潜伏期不到24h，起病急，有剧烈腹痛、腹泻，肠黏膜出血性坏死，粪便带血，可并发周围循环衰竭、肠梗阻、腹膜炎等，病死率高达40％。 3．食品安全危害 产气荚膜梭菌在污水、土壤、垃圾、人和动物的粪便以及食品中均可检出，土壤中的检出率达100％。被污染的食物主要是肉类和鱼贝类等蛋白质性食品，由于存放较久或加热不足使细菌大量繁殖，形成芽孢时产生大量的肠毒素，引起食源性疾病。多食肉而卫生条件差的城市和集体食堂中易造成产气荚膜梭菌的扩散传播，从而导致食物中毒的流行。2009年4月21日河南省安阳县某焦化厂职工食堂发生隔夜熟鸡腿被产气荚膜梭菌污染，造成32人食物中毒事件。 作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13
羊产气荚膜梭菌的分离鉴定
一株羊源产气荚膜梭菌的分离及鉴定 金铎*1,2，林家琪1,2，董真1,2，展天松1,2，顾敏1,2，焦库华1,2，王彦红*1,2，刘文博*，1,2 （1，扬州大学兽医学院, 扬州，江苏， 225009； 2，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州，江苏，225009；） 摘要：2013年4月，扬州大学动物医院畜禽门诊接诊一例山羊急性死亡的病例，对其进行剖检，无菌恒温厌氧分离培养，纯化鉴别，革兰氏染色，生化反应，结果表明为产气荚膜梭菌，并对此进行了一定的讨论 关键词：产气荚膜梭菌；分离；鉴定。 产气荚膜梭菌旧名魏氏梭菌，产气荚膜杆菌，根据致死性毒素与其抗毒素的中和实验，将此菌分为A、B、C、D、E 5个类型，以菌体抗原进行血清型分类意义不大，菌体抗原与毒素分型之间没有明显关系，毒素至少已经发现15种，其中α、β、ε、ι、δ、θ、κ、λ、μ、υ、CPE、其他毒素、神经氨酸酶等。A型、C型、D型的某些菌株可以产生肠毒素，A型产气荚膜梭菌主要引起动物的气性坏疽，牛、羔羊、新生羊驼、驯鹿、仔猪、家兔的肠毒血症，B型菌主要引起羔羊痢疾，还可以引起犊牛、羔羊、山羊的肠毒血症或坏死性肠炎，C型菌是绵羊猝狙的病原。D型、E型菌也是导致牛羊肠毒血症和猪的腹泻[1]。笔者结合相关知识，在此整理于扬州大学动物医院所见的一例羊源产气荚膜梭菌感染的疾病。 1材料与方法 1.1病料来源 2013年4月，江苏某养殖户饲养的240多只母山羊陆续产羔，羔羊在产后24-48小时开始出现剧烈腹泻，拉水样黑色稀粪，虚弱，随后死亡，羔羊的死亡率达60%。剖检后发现病死羊羔严重脱水，真胃和大肠内容物呈糊状，小肠壁变薄，或黄或黑，透明，充满空气，部分肠道黏膜充血出血，卡他性出血性炎症, *基金项目：江苏高校优势学科建设工程；江苏省大学生创新训练计划省级重点项目（201311117039Z） 作者简介：金铎（1992—），男，山东青岛人，扬州大学兽医学院本科生，主要从事羊临床菌株耐药性及质粒指纹图谱分析研究。 *通讯作者：王彦红，扬州大学兽医学院讲师，E-mail: wyh7405@https://www.wendangku.net/doc/ab1463038.html, *通讯作者：刘文博，扬州大学兽医学院副教授，E-mail: lwb@https://www.wendangku.net/doc/ab1463038.html,
产气荚膜梭菌及检验
产气荚膜梭菌及检验 一、流行病学 产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆发。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻。摄食被本菌污染的食品后8�22小时开始发病。在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×107或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1�2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。 据美国人类卫生教育福利部报导魏氏梭菌引起的食物中毒，在美国占细菌性食物中毒的30%左右，另据美国疾病控制中心，估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人，其中大约只报导1200例，暴发约20起，大量的暴发和少量的发病都与公共饮食有关。例如：学校的自助食堂和护理病房，产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。 产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。 产气荚膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的热抵抗力很强，由患者粪便中分离的芽胞能耐受 100℃,1�5小时的加热。除了具有形成芽胞及耐热等特点之外，生化性状，毒素及酶的特异性等，同其它魏氏梭菌是一致的。 当产品达到合适温度时，那些未被杀死的芽胞，由于蒸煮而使其可能发芽。蒸煮后需要经过快速一致的冷却。事实上在所有暴发的病例中，产气荚膜梭菌中毒的主要原因是没有经过恰当冷却事先煮好的食品，特别当做好的食品量又是很大时，适当的热处理（60℃以上）充分的再加热，冷却食品（最低中心温度为24℃）也是必要的控制措施，培训食品加工人员，仍是控制措施的一个关键方面。 二、生物学特性： 1、形态： 本菌菌体两端钝圆，直杆状1-2×2-10μm，革兰氏阳性，卵圆形芽胞位于菌体中央或近端，不比菌体明显膨大，但有些菌株在一般的培养条件下很难形成芽胞，无鞭毛，在人和动物活体组织内或在含血清的培养基内生长时有可能形成荚膜。 2、培养： 本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，甚至在EH=200-250mv的环境内也能生长。 在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更好。生长适宜温度为37-47℃，多认为43-47℃为最宜本菌生长和繁殖速度极快，在适宜条件下增代时间仅8min，可利用高温快速培养法，对本菌进行选择分离，如在45℃下，每培养3-4小时传种1次，即可较易获得纯培养，在深层葡萄
产气荚膜芽孢梭菌
产气荚膜梭菌 形态： 本菌菌体两端钝圆，直杆状1-2×2-10μm，革兰氏阳性，卵圆形芽胞位于菌体中央或近端，不比菌体明显膨大，但有些菌株在一般的培养条件下很难形成芽胞，无鞭毛，在人和动物活体组织内或在含血清的培养基内生长时有可能形成荚膜。 特征： 为梭状芽胞梭菌类属，是厌氧、无动力、能产生芽胞的革兰氏阳性粗大梭菌，单独或成双排列，两段钝圆，芽孢大，卵圆形，位于次端，在机体内可形成荚膜。无鞭毛不能运动。产气荚膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的热抵抗力很强。除了具有形成芽胞及耐热等特点之外，生化性状，毒素及酶的特异性等，同其它魏氏梭菌是一致的。 产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆发。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻，并可引起厌氧性蜂窝织炎、泌尿系感染和食物中毒。在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×107或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1至2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。 产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。 存在于人粪及温血动物的粪便内，可作为粪便污染水体和土壤的指示菌。此菌具有芽胞，污染水体后存活时间较长，对氯等消毒剂有较强的抵抗力。如水体内未检出粪大肠菌群和粪链球菌而仅检出此菌，说明该水体以往曾有过粪便污染。产气荚膜梭菌作为判断土壤是否被粪便污染及污染程度的指示菌。通常用产气荚膜梭菌值表示。 当产品达到合适温度时，那些未被杀死的芽胞，由于蒸煮而使其可能发芽。蒸煮后需要经过快速一致的冷却。事实上在所有暴发的病例中，产气荚膜梭菌中毒的主要原因是没有经过恰当冷却事先煮好的食品，特别当做好的食品量又是很大时，适当的热处理（60℃以上）充分的再加热，冷却食品（最低中心温度为24℃）也是必要的控制措施，培训食品加工人员，仍是控制措施的一个关键方面。 培养特性：不严格的厌氧，普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。适宜生长温度为37℃-47℃，生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。 生化特性：发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，能将亚硫酸盐还原为硫化物。 毒素与分型 毒素：产气荚膜酸菌能产生外毒素和肠毒素。外毒素：致死毒素。坏死毒素和溶血毒素，毒性不强不耐热。还有透明质酸酶等酶类。肠毒素：不耐热，60℃经10min即可破坏。不耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶等蛋白分解酶比较稳定。