实用高效液相色谱法的建立纠错版第7章 离子样品：反相,离子对和离子交换HPLC
第7章离子样品：反相，离子对和离子交换HPLC
7-1引言
图1-3中的讨论将常规样品分为2类：中性样品和离子样品。离子样品是任何含有一种或一种以上离子的或可解离的有机化合物的混合物。中性样品的分离已在第6章讨论；本章讨论离子样品的反相，离子对和离子交换HPLC的分离。一些离子样品也包含在图1-3中特殊样品范畴中：生物样品（见第11章）、手性样品（见第12章）和无机离子。无机离子的分离在本书中不作讨论。
离子样品的HPLC分离往往更复杂且难于理解。而且，往往有一些中性化合物碰不到的问题。另一方面，离子样品的谱峰间距比中性样品更易于控制，这一点使最终分离成功的可能性大为增加。
7-2酸性和碱性样品
为方便本章的讨论，我们定义“离子溶质”为在通常p H范围内（大多数硅胶基质色谱柱：2
2、四烷基铵盐（p H<13）或大多数p H<8的烷基胺）。在HPLC分离条件下离子电荷随p H发生变化的化合物简单地称作酸或碱。如流动相p H被限制在较窄范围内，某特定酸（如醋酸）的保留行为可能与强酸（p H>7，完全解离），酸（3
7-2-1酸碱平衡与反相保留
在反相色谱（RPC）中，疏水化合物样品的保留值较大（见6-2-1节）。当某种酸（HA）和碱（B）发生解离（即从不带电形式转化），其疏水性将会大大减弱（亲水性增强）。因此，在RPC中的保留值k可能下降10~20倍。
HA ＜＝＞A-＋H+（7-1）
B ＋H+＜＝＞B H+（7-2）
疏水亲水
（RPC中保留较强）（RPC中保留较弱）
当p H增加，酸失去质子（发生解离）；而当p H降低时，碱获得质子（也发生解离）；因此随p H增加，酸的RPC保留值减小，而碱的则增大。该保留值行为的说明见图7-1所示5种不同化合物的RPC保留值随流动相p H值变化的关系图。在3
图7-2a进一步阐述了这种酸碱行为，一种碱性化合物（理想的）保留与p H的关系。当p H值在一足够大的范围内发生变化，样品的解离和保留值如图呈特有的S形曲线（亦见图7-1中的化合物4）。在该保留值-p H曲线的中点（见图7-2a中虚线），p H值等于该化合物（就碱来说为B H+）的p Ka值。文献中的不同酸或碱的p Ka值通常指在水缓冲剂中的测得值。如果HPLC流动相中含有有机溶剂，其p Ka值可随%B有所变化（见7-2-3节）。
当一种化合物的p Ka=p H时，其有一半解离（即流动相中B与B H+的浓度相等）。几乎所有与p H相关的保留值变化均发生于p Ka值±1.5单位的p H值范围内（见图7-2a的B 区域）。超出该范围（图7-2a中为p H<2.5或p H>5.5），该化合物或者完全解离或者完全未解离，其保留值随p H变化不大（即保留行为与中性化合物相似）。该情况见图7-1所示，当p H>6时的化合物1，与p H< 7时的化合物2的情况。
如化合物含有多个酸和╱或碱基，其RPC保留值与流动相p H的关系则更为复杂。当
当分离酸性或碱性样品时，加入缓冲剂控制流动相的p H是非常可取的。（用p H计）很难精确测定含有有机溶剂的流动相的p H，因为电极响应易发生漂移。因而，如使用p H 计，最好先调节缓冲剂的p H，再加入有机溶剂。这就使最终流动相的实际p H值难以确定（因为加入有机溶剂会改变p H），但该问题比流动相p H重现性不好要大得多（即当加入有机溶剂后，再测p H值）。
选择具体缓冲剂时，应切记的几种考虑因素：
缓冲容量
UV吸收度
其它性质：溶解度、稳定性、与样品和╱色谱柱的相互作用、挥发性、对HPLC系统的腐蚀等。
7-2-2-1缓冲容量
缓冲容量由p H、缓冲剂p Ka及其浓度决定。与样品化合物的情况类似，缓冲剂发生解离的p H范围为p Ka±1.5。只有在此p H范围内缓冲剂才能有效地控制p H值。因此，为了保险起见，为某具体分离所选择的缓冲剂应控制的范围p H≈p Ka±1.07-2b下的讨论）。假定进样体积较小和╱或样品对流动相p H的影响不很大，10~50mM浓度的缓冲剂对RPC 分离一般足够。较高的缓冲剂浓度（>50mM）可以提供较大的缓冲容量，但在高%B的流动
缓冲剂的p Ka值为2.1，所以当流动相p H >3.1时，其缓冲容量将显著降低。在这些实验条件（25% MeOH-缓冲剂）下，溶质（DMA）的p Ka为3.8（即2.8
3.5时（缓冲容量非常小，见7-2-2-4节的进一步讨论），峰变形已相当严重。
7-2-2-2缓冲液的紫外吸收
理想状态下，缓冲剂应在或者低于220nm处透光性良好，以便于在低UV波长处检测。表7-1中的所有缓冲剂（除枸橼酸盐外），都满足该标准。有时，有必要在200nm或以下进行UV检测。表7-1中的几种缓冲剂（磷酸盐、碳酸盐、铵盐）能在非常低的UV波长检测。然而缓冲剂由于含有杂质，在低UV波长的吸收度可大大提高。表7-1中的UV截止波长所指是纯试剂的。
7-2-2-3缓冲液的其它性质
a缓冲剂所允许的p H 范围（保守的估计）b吸光度< 0.5A；c需要加入酸（如醋酸或磷酸）
d Tris ：三（羟甲基）氨基甲烷；
e Bis：1，3-二[三（羧甲基）氨基甲烷]丙烷。
缓冲剂的溶解度、挥发性和稳定性（可能与设备、样品和╱或色谱柱发生作用）对某些分离也很重要。无机缓冲剂，如磷酸盐，在含有高浓度有机物的溶液中的溶解度不大。甲醇-水流动相比乙腈-水或THF-水溶液的溶解度大，因此甲醇可能是有机溶剂的首选。无机缓冲剂通常比较稳定，不过挥发性缓冲剂可能难以维持恒定的p H（尤其充氮气时）。例如，碳酸盐缓冲剂放置后，由于长时间CO2会逸出，流动相p H可能增大。p H<2.5时，三氟醋酸（TFA）高度解离，几乎不挥发（该缓冲剂经常用于肽和蛋白质的分离；见11-2-1节）。一些缓冲剂放置即降解，储存或长期使用后，其UV吸收也会增加（如：TFA、三乙胺）。
有报道，枸橼酸缓冲剂对不锈钢材质有腐蚀作用，但也有报道称每天结束工作时清洗系统、除去枸橼酸盐，HPLC系统即可用该缓冲剂。枸橼酸盐缓冲剂的主要缺点是UV吸收较高，使其UV检测限于230nm以上。一些缓冲剂能通过形成离子对，与样品发生作用（如三氟醋酸缓冲剂与阳离子样品；三乙胺与阴离子样品等）。虽然，这种离子对作用并非总不好，但当分离条件偶然改变时，会使色谱图解析变得复杂（见7-3节）。
挥发性缓冲剂对2种情况有作用。如需回收纯化的样品组分（制备HPLC，见第13章），通过蒸发或冷冻干燥能方便地除去缓冲剂。碳酸铵、甲酸铵、醋酸铵和三氟醋酸等缓冲剂可作这类应用。某些检测器[如蒸发光散射（见3-3-1节）或质谱（见3-3-4节）]可能需要挥发性缓冲剂。
7-2-2-4合适的缓冲液
反相HPLC分离一般采用C8或C18键合相硅胶-基质色谱柱，p H范围超出2~8时，这种色谱柱不稳定。因此，缓冲剂应能将p H控制在2~8之间。如缓冲剂可在210nm或以下波长检测，则很理想。表7-1表明，磷酸盐缓冲剂可控制的p H范围在2.1~3.1或6.2~8.2。醋酸盐的缓冲范围是3.8
枸橼酸盐的优点是能用单一缓冲剂控制宽范围的p H：2.1
7-2-3 p Ka与化合物结构的关系
优化流动相p H值时，了解各样品组分的近似p Ka值是非常重要的。利用该信息可以将流动相的p H值规定于一适用的范围中（例如，p Ka±1.5时，谱峰间距的变化受p H的影响；或者，如果要尽量减小p H对保留值的影响，使方法稳定，则可用超出此范围的（p H）。若不知样品组分的p Ka值，可以通过样品的分子结构估计出。表7-1总结了一些典型样品分子中常见的酸或碱取代基在水中的p Ka值。
a指脂肪取代基(如乙酸) b指芳香取代基(如苯甲酸)
由于几种原因，应小心使用表7-2的数据。首先，取代基（如-COOH）的p Ka值可能受相邻取代基的电负性影响而变化很大。例如，醋酸的p Ka为4.8，而三氟醋酸的p Ka却为0.7。其次，如在流动相中加入有机溶剂，p H与p Ka值还会进一步发生变化。当按照以上推荐调节流动相的p H（加入有机物以前），一项研究数据显示酸性样品（苯甲酸衍生物）在水中和水-甲醇混合液中所测得p Ka值差异很小。同时也表明碱性样品（苯胺衍生物）中甲醇浓度每增加10%时，其表现；p Ka降低约0.3个单位。其它研究也表明吡啶衍生物中甲醇、乙腈或THF浓度每增加10%，其p Ka降低0.1~0.3个单位。
如图7-2a所示，有可能通过分离效果随p H的变化来推断化合物的酸或碱性以及近似的p Ka值（即，保留值在极端p H时，显示的极大值和极小值的中间p H=p Ka）。例如，图7-1中化合物4（一种碱）的p Ka值大约为7。同样，化合物1是一种酸，其p Ka<4。据报道有计算机软件可通过3次改变p H的RPC实验，估计其p Ka值（作为方法建立的一部分，见10-2-1-1节）。另有研究通过改变p H和离子对试剂浓度的等度HPLC实验，可以将所有的样品组分按酸性、碱性、中性、强酸性或强碱性分类。该程序已被扩大用于梯度洗脱。7-2-3-1合适的流动相p H
样品分子中最常见的酸或碱取代基为胺[-NH2、-N（CH3）2等]、碱性杂环和羧酸
（-COOH）基团。芳香胺、吡啶与芳香及脂肪羧酸在水溶液中的p Ka范围为4~5，而脂肪胺的p Ka为8~11。RPC色谱柱一般使用的p H范围为2~8，这将很大程度排除对脂肪胺解离和保留的控制。因此，与p H有关的保留值变化最可能发生于p H3~6的范围内，这不包括烷基胺化合物。
HPLC方法建立中选择最佳起始p H受多种因素的影响。优化峰间距和分离时，希望样品保留值随p H发生变化。这时，选择p H在≈p Ka ±1范围内改变。其它情况下，对于p H的微小变化，我们可能需要保持不变的分离效果；这就要求p H< （p Ka－2）或>（p Ka ＋2）。无论处理已知样品（在分离前可估计p Ka值）还是未知样品（p Ka由实验近似得出），开始RPC方法建立时最好选用p H微小改变不影响分离的流动相（p H<3见7-3-1节）。
7-2-4对于离子样品适宜的HPLC分离模式
对于常规离子样品，我们可以选择反相、离子对、离子交换色谱法这3种HPLC分离模式。RPC具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特点，通常是首选的分离模式。若RPC 分离不够理想，可以考虑在流动相中加入离子对试剂。通过对离子对试剂浓度的控制来拓宽RPC的范围；因此，在离子对试剂浓度由0变至最大值时，会有RPC-IPC保留值的连续变化。所以起初的RPC实验有助于后面IPC分离（若需要的话）条件的优化选择。对于特殊的分离目的，可以考虑从离子对或离子交换色谱开始，见7-4与7-5节中的讨论。
7-3离子样品反相分离的优化
7-3-1初始实验
离子样品反相分离的方法建立与中性样品有些相似（6-4节）。初始分离实验条件的选择，可参照表1-3中的推荐值。离子样品与中性样品初始实验的主要差异为需用（1）经p H 缓冲的流动相；（2）硅羟基效应最小的反相柱（即：碱性RPC柱，见5-2-1节）。也可用非硅胶基质柱（例如聚苯乙烯、石墨化碳等，见5-2-1节）。不过，最佳结果往往是用表5-4中的低酸性硅胶基质色谱柱获得。
硅羟基效应（见7-3-3-2节）可导致碱性样品的峰形变差，柱效降低。对于这些样品，用低p H的流动相通常可以得到较高的柱效（见7-3-3-2节）。而且低p H方法一般抗干扰性较好，因为大部分样品的保留值不易受p H微小改变的影响。最后，当首次开始HPLC方法建立时，并不知道获得合适的分离是否需要改变p H；所以初始实验的流动相p H<3最好。
下一步实验是通过调节流动相强度（%B），以使样品具有合适的保留值范围0.5 当选择的流动相强度（%B）得到合适保留值后，可能还需调整峰间距，即尽量扩大样品的分离度或降低保留值范围，以便进行等度分离。最后，能改变柱条件以最好地兼顾分离度、运行时间和柱压（见2-3-2节）。 7-3-2选择性的控制 与中性样品的方法建立相比，离子样品反相分离中的峰间距控制可选择其它的分离条件。如已知样品的酸性或碱性（p Ka 值），能更好地预测选择性的变化。改变p H往往是改变分离选择性的最有效方式。其它可有效地改变峰间距的条件是%B、溶剂类型（甲醇、乙腈、THF）、温度、柱类型（C8 与C18、氰基、苯基）与缓冲剂浓度。注意用高温度的缓冲剂流动相对柱寿命会有不利影响，尤其p H<3或p H>7。 7-3-2-1 p H 如图7-1中所示，p H变化可导致离子化合物的k值发生10倍或更大的变化。因此，在改变p H的同时有必要对%B进行调整。另一方面，如果样品中含有中性化合物且又最后流出，改变p H对总运行时间就不会有太大影响。这种情况下，改变p H而不必调整%B。 基于初始梯度的运行结果（甲醇-缓冲剂，p H2.5）和表8-2，进行图7-4a中的等度分离。保留值范围足够（2 检查图7-4b~c的3次分离情况，下一实验p H的逻辑选择应介于2.5~3.5之间（如p H3.0）。其分离见图7-4d所示，所有谱峰都获得了较好的分离（关键峰对3╱4的Rs=1.8）。通过移动峰4使其与峰3与5等距时，还能获得少许改善。增加p H至3.1，可获得这种效果（未画出，但参见图7-4a和b），其Rs=1.9（关键峰对3╱4和4╱5）。 合物无法保持其峰大小不变。由于这些及其它原因，有时有必要进行数次p H微小改变是实验（如0.2~0.5单位）。为了合理地优化p H，也可能需要在所有运行中注入标准品来进行峰 确认，见10-7节中峰跟踪识别的讨论。 为0.5 一般认为溶剂类型（乙腈、甲醇、THF）对于离子样品选择性的影响方式与对中性样品的极为类似。因此，改变溶剂类型对优化分离是一有效途径。对分离某些离子样品（需用大%B 的强疏水性样品），甲醇可能优于乙腈，与含乙腈或THF的流动相比较，大多数缓冲剂在甲醇-水混合液中溶解得更好。 7-3-2-4柱温 如6-3-4节中所述，温度对RPC分离中性样品的峰间距影响一般很小。而对离子样品 则不同，因为这类分离中包含多种不同的保留过程，而每一种对温度的改变都有不同的响应（如：样品化合物解离度的变化；同一化合物解离和未解离分子的疏水保留；包括解离种类 剂的浓度，会选择性地降低所有样品阳离子的保留值，因增加了缓冲剂阳离子的竞争力。这种影响用于以Zorbox C8柱分离PTH-氨基酸样品的示例已有报道（图1-5b）。不过，一般不推荐改变缓冲浓度作为改善选择性的手段，因为硅羟基解离的柱间重现性一般不好，导致样品保留值和分离飘忽不定。 7-3-2-6胺改性剂 在流动相中加入胺改性剂会影响碱性样品的分离，一般使峰形有较大改善（见7-3-3-2节）。由于胺对解离的硅羟基有掩蔽作用，随胺改性剂浓度的增加，碱性化合物的保留值往往会降低。这将有利于改变选择性。有研究描述了同时优化%B、p H、甲胺浓度，分离含 有13种代谢物的药物，胺改性剂影响选择性的应用也取决于解离的硅羟基（见7-3-2-5节），而且同类型的色谱柱之间也会有所不同。因此，改变胺浓度并非控制选择性的首选。再者，如在流动相中加入胺改性剂，其浓度则应足够大，以尽可能大地抑制硅羟基效应。 7-3-2-7柱型 由6-3-3节的示例可知，改变色谱柱类型（C8、氰基、苯基）可使中性样品的谱峰间距发生变化。用不同类型的色谱柱会使离子样品发生相似的选择性改变。在离子样品的方法建立中，改变峰间距有许多其它参数，而且极为方便，所以一般改变柱型只用于那些优化了其它条件后谱峰间距仍不能满意的样品。 碱性样品的分离曾采用“原”硅胶色谱柱和有机-缓冲剂流动相进行。其保留似乎是通过离子交换过程实现，其中包括质子化碱和解离的硅羟基（见式7-3）。只有在键合相柱的常规RPC不能成功时，才推荐使用硅胶色谱柱。 7-3-3特殊问题 离子样品的RPC方法存在诸多问题，这些问题对中性样品不是问题或对于离子样品则相当突出。 7-3-3-1 p H敏感度 当流动相p H接近于一种或多种样品组分的p Ka 值时，p H值的微小变化（小至0.1 单位）会对谱峰间距和样品分离度产生较大影响。这种p H敏感度由不能精确调节缓冲剂p H值的准确度仅达±0.05~0.1单位。因此，在离子样品的方法建立过程中，p H对最终方法的影响大小应是主要问题。 可以采用几种方式将p H的敏感度问题降至最小。首先，测定方法的p H敏感度。若流动相p H必须控制在较窄范围内（±0.1单位或更小），可通过准确量取缓冲剂组成（重量或体积），以精密控制p H值，而不是用p H计将缓冲剂滴定至理想的p H。其次，如果这种方法不能保证精密调节p H，采用比目标p H值高或低0.2单位的流动相进行分离，并将这些色谱图附于方法步骤中。这样，当由于p H不对，样品分离不足时，使用者能利用这些分离调节流动相p H，见图1-5d的示例。最后，对于p H敏感方法的最好办法是设计或重做该方法，普适性更好。有利于最大分离度的那些条件（尤其是p H值）往往不利于方法的抗干扰性。对于抗干扰好的方法，分离条件的微小变化有时带来的分离度损失很小。见10-6节中的讨论。 7-3-3-2硅羟基效应 离子样品，尤其碱性样品，能与硅胶基质色谱柱的硅羟基发生反应（见5-2-1-1节）。能导致保留值增加，谱峰拖尾，和柱间重现性差。选择适宜的实验条件以尽可能减小这些硅羟基效应，一般是较理想的。通常，最主要的硅羟基-样品间的相互作用是由离子交换引起的。样品中的质子化碱（BH+）与钠、钾或其它阳离子发生交换反应，它们连在柱填料中的解离的硅羟基上：例如： BH+＋SiO-K+<=> K+＋SiO- BH+（7-3） 据式7-3，由于色谱柱保留碱性样品化合物的容量可能非常有限（如<1μg），正常的进样量（>1μg）就会使柱超载，产生拖尾谱峰（见2-4节）。为解决这一问题，应选择合适的实验条件，以尽量减小式7-3的离子交换过程所引起的样品保留。 选用适于碱性样品的色谱柱可降低硅羟基效应（见表5-4）。用于这类柱填料的硅胶，制作时通常尽量减小极酸性的硅羟基数目，因硅羟基有利于式7-3中的保留过程。所有硅胶基质的色谱柱都含有易受影响的硅羟基，但用低p H（2.0 H+＋SiO-K+<=> K+＋SiO- H+（7-3a） 高p H 低p H 用高浓度的缓冲剂（>10mM），选用被硅羟基牢固保留的缓冲剂阳离子（Na+ 如用钾缓冲剂时，碱性样品仍拖尾，以三乙胺（TEA）或己胺代替钾缓冲剂可能会解决问题。据报道二甲辛胺（DMOA）更有效，但它作为流动相改性剂会带来其它问题。用TEA、己胺尤其是DMOA时，改变流动相后柱平衡会较缓慢，因此应先试用其它方法后，再使用这些胺改性剂。 少于1μg的进样量（对有问题的碱性化合物而言）会进一步减少峰拖尾，而在某种情况下，增加进样量也有该效果。在极端情况下，有必要试用另一不同柱，由于某化合物的拖尾情况可能在不同的碱性RPC柱上会有所不同。另外，如分离对塔板数的要求不高，用聚合物（非硅胶）RPC柱则可以消除硅羟基的问题（聚合物柱一般比硅胶基质柱的柱效低）。 有人建议分离碱性样品时用较高p H（如>7）。弱碱（如苯胺、吡啶）在较高p H值下可能不解离，所以能消除式7-3的保留及其有关问题。一些色谱柱在高p H也显示拖尾较小，可能由于硅羟基已充分解离，以至柱容量不再受限制。对于高p H分离，也有报道乙腈比甲醇或THF的拖尾更大。硅胶基质柱在p H6以上时欠稳定，而在p H大于8时往往无法使用。然而溶胶-凝胶载体制成的致密键合的烷基、端基封尾色谱柱在有机缓冲剂及温度≤400C条件下，可以日常应用的p H至少高达11（亦见5-2-3-4和5-4-3-5节）。 最近报道了抑制硅羟基与碱性化合物相互作用的另一种办法。用中等酸度的色谱柱（SpHerisorb C8），在流动相加入0.02~0.05%乙腈可使几种苯胺衍生物的峰形有很大改善。这种方法对（与硅羟基的作用更强的）脂肪胺是否也有效尚待进一步研究。也有人提出以“动力学改性”硅胶改善碱性样品的RPC分离。采用原硅胶作柱填料，在流动相中加入0~220mM 的四级长链烷基三甲胺离子。很明显，这种添加剂以类似于C18填料的烷基涂层覆盖于填料的表面上，以封闭硅羟基。重现性和峰形都声称超过了碱性RPC柱。 RPC分离酸性化合物时偶尔会有拖尾或峰过度展宽现象,已经证明,在流动相中加醋酸或醋酸盐有利于解决这类问题。 7-3-3-3温度选择性 如图7-6所示，对于离子样品的分离，温度的微小改变会对样品分离度产生明显影响。因此，柱恒温对分离离子样品比分离中性样品更重要。若色谱柱在室温下使用，应研究温度变化对分离的影响。应注意预防不加控制的室温波动可能带来的问题。 7-3-4总结 反相分离离子样品的方法建立方式与非离子样品的近似（见6-4节），但也有一些差异。见图7-7的总结。如在一系列研究中的任何一步得到了可接受的分离，下一步工作则可省略，或照第8步继续进行实验（改变柱条件）。 第1步以25mM磷酸钾缓冲剂（p H2.5），15×0.46cm低酸性C8与C18柱，流速2.0ml/min与表1-3中的其它条件，进行60min的初始梯度，5→100%MeOH。或者，用60%MeOH（其它条件相同）进行初始等度分离。因为离子样品往往保留较弱，起始%B值可以较低（60%B），而中性样品一般用80~100%B，（见6-2-2-1节）。 第2步由初始梯度谱图决定是否可用等度洗脱（见图8-6及有关讨论）。如等度洗脱可行，估计等度分离的最佳%B（见表8-2）；若等度洗脱不行，照第2a步继续进行。 另外，由初始等度分离，估计末峰（k≈10的%B值，%B减少10%（如由60%→50%B），k值会增加3倍（“3倍规则”，见6-2-1-1节）。 第2a步若基于初始梯度的运行结果，等度洗脱不合适，或等度运行结果超出样品的保留值范围（0.5 同时调整p H和%B，以得到合适的保留值范围（0.5 建立梯度洗脱方法（见第8章） 采用离子对HPLC，以得到合适的保留值范围（见7-4-3-1节）。 改变p H或使用离子对能否改善保留范围，能通过色谱图中的第1峰和最末峰的p Ka 值（若知道的话）推断出。例如流动相p H=2.5时，若第1峰是吡啶衍生物，其k<0.5，而末峰为中性，且k >20，提高p H至6或7应导致吡啶衍生物的解离降低并增加其保留值，而不影响末峰的保留值。然后，能再增加%B 将所有峰的保留值调整进0.5 第3步用由初始实验得出的%B值进行等度分离（若以梯度洗脱进一步进行方法建立，其方法也类似，见第8章的讨论）。如必要，调整%B以使k范围达到0.5~20。如需改善选择性，可进一步改变流动相强度（±5~10%B），以测定%B对谱峰间距和分离的影响。通过选择能提供适宜的保留值和良好分离度的%B值，可得到满意的分离。若未得到可接受的保留值范围，则返回第2a步。 第4~5步若由于峰间距较差，在第3步未获得足够的分离，（用图6-4）改为乙腈作溶剂，按需要调整%B以得到良好的保留值和分离效果。另外，如图7-4中的示例改变p H，以测定分离的最佳p H。对大多数样品来说，推荐的p H改变如图7-4所示：2.5、3.5、4.5。如果已知样品的p Ka>5，实验p H则应为4、5、6。p H改变过程中，可能有必要改变%B 以维持0.5 第5a步若酸性样品的p Ka<2或碱性样品的p Ka>8，可能有必要使用离子对HPLC （或用对p H稳定的聚合物柱）进一步控制谱峰间距（见7-4节）。 第6~7步通过改变柱类型、温度或（不常用的）缓冲剂浓度，进一步改变峰间距。 第8步峰间距优化完成后，考虑改变柱长、流速或微粒粒度以进一步改善分离效果。见2-3-3-1节中的有关讨论。 7-4离子对色谱 离子对和反相HPLC共享有多种特征。这2种分离使用的色谱柱和流动相大致相似，主要区别是离子对色谱（IPC）的流动相中加入了离子对试剂。对于含有离子样品的大多数分离，应先试用7-3节的RPC分离，然后再考虑IPC。IPC分离在方法建立和使用方面都很复杂，并且易受其它实验问题的影响（见7-4-5节）。若RPC方法建立（见图7-7）由于峰间距较差，不能充分分离，此时应考虑选择IPC。因此，逻辑上，IPC是需进一步改善的RPC 分离的一种补充方法。 某些样品的首份色谱图可能提示等度RPC不可代替梯度洗脱，如图7-8所示。图7-8a 的初始梯度分离表明用该流动相不可能得到满意的等度分离（见图8-6中的讨论），这一点被图7-8b的30%B的等度分离所证实。图7-8b中第1谱峰在k<0.5流出，最末谱峰的k >20。然而，分析早与晚流出的谱峰的酸-碱性质则可找出缩小保留值范围，使等度分离满意的办法。 早流出峰X~X3为强碱性，因此在p H2~8范围内解离且保留较弱，改变p H不会影响它们的分离。晚流出峰MP和PP为中性（而且疏水），故其保留值也不受p H影响。但是，用阴离子试剂的离子对会选择性地提高这些早流出的阳离子谱峰的保留值，对晚流出的中性谱峰的影响相对较小，使样品的等度分离满意（见图7-8c；以及下面的讨论）。 7-4-1保留机制 样品的IPC保留过程见图7-9中所示。图7-9a简单描述了C8或C18柱填料的表面，一个被负离子对试剂（如己烷磺酸盐）的吸附分子覆盖的矩形体。离子对试剂因其疏水的烷基被固定相所吸引，于是该试剂所带的电荷（C6-SO3-）连结于固定相上。固定相上的该负电荷与试剂和╱或缓冲剂中的正电荷（Na+）保持平衡。这样，以带正电荷的样品离子（质 高p H。在图7-9c中，流动相中加了足量的离子对试剂TBA+，完全覆盖了固定相，于是使中性分子RCOOH的保留值降到了最小。但是固定相上产生的正电荷（吸附的TBA+）强烈吸附带负电的RCOO-。在该离子对条件下，样品保留值对p H作图时，最大保留值会出现于高p H（样品完全解离），最小保留值出现于低p H（无样品发生解离）。 图7-9c所示的IPC性质引起的保留过程与图7-9b中反相HPLC有很大不同。因此，一旦在反相HPLC使用的流动相中加入一种适宜的离子对试剂，离子样品的分离选择性将会发生较大变化。 1.0ml/min 30 0C；（b）同（a），但用30%B等度分离；（c）同（a），但用等度离子对分离，40%甲醇-缓冲剂（65mM辛烷磺酸盐），1.5ml/min。 7-4-1-2离子对试剂的浓度 通过改变被固定相吸收的离子对试剂的多少，有可能将保留过程由反相连续地改变为离子交换色谱。这种变化通过改变流动相中的试剂浓度而实现。首先考虑被C18柱吸收的磺酸盐试剂P-，图7-10a所示。对固定相中的试剂浓度（P）s与流动相中的试剂浓度（P）m 作图，离子对试剂分别为C6-磺酸盐和C8-磺酸盐。当流动相中离子对试剂浓度增加时，柱吸附量也增加，但后来当柱对离子对试剂达到饱和时，吸附量呈稳定水平。由于C8-磺酸盐疏水性较强，故保留也较牢固，在流动相中离子对试剂浓度较低时，色谱柱即达到饱和。因此，强疏水的C8-试剂使色谱柱达到一定的吸附容量（如50%饱和量）时，其浓度低于疏水弱的C6-试剂。样品保留主要由柱上离子对试剂的吸附量与所产生的电荷决定。因此，当调节流动相中的试剂浓度，以使色谱柱摩尔吸附量相同，该2种试剂（C6与C8）的分离效果将会相似（亦见图7-12c与有关讨论）。 再考虑磺酸盐离子对试剂浓度增加时，样品保留值的改变（见图7-10b）。对于亲水的离子样品化合物BH+，发生保留主要由图7-10a或图7-10b的离子交换过程决定。于是，当[P]m增加，色谱柱上的电荷增加，化合物BH+的k值也增加。一旦柱对离子对试剂达到饱和（最大柱荷载），样品的保留趋于平衡。因为IPC保留包括离子交换过程，进一步增加离子对试剂浓度也增加反离子（Na+）的浓度，它们与样品离子竞争在柱上的保留。因此，随 过反相和离子交换（或离子对）过程2者同时保留的结果。当色谱柱吸收的离子对试剂量增大，离子交换保留机制为主，而反相保留机制为次要。该效果见图7-11所示的胆酸混合物的分离[log k对p H的曲线图；注意图Y轴的开始单位分别为（a）-0.5、（b）-0.2]。图7-11 a表明不加离子对试剂时，样品反相保留值与p H值的关系。所有组分的最大保留值发生于低p H，而高p H时的保留值最小。一旦在流动相中加入了1mM四丁基铵离子（TBA+），色谱柱对试剂有较小的吸收（饱和量的5~10%）。该吸收使高p H值时的样品保留值增加了大约5倍。而在低p H值处，由于吸收的离子对试剂部分阻塞了固定相，保留值却有所降低。通常，用浓度非常高的离子对试剂（TBA+）制造较大的离子对效应（见图7-13c中的讨论，对图7-11以45%乙腈-缓冲剂为流动相的示例，推荐浓度约为100mM）。样品的较大的k值发生于高p H值，并非低p H（如图7-9c）。 7-4-1-3离子对试剂的类型 图7-12以带正电的碱（Adr+）、带负电的酸（NpS-）和中性化合物（BzOH）的分离，进一步说明了随着离子对试剂浓度的改变，样品保留值变化的情况。未加离子对的分离结果 见图7-12a。质子化碱（Adr+）不保留（k=0），其它2化合物（BzOH和NpS-）的保留足够（k≈5）。图7-12b因为在流动相中加了14mM辛烷硫酸盐作为离子对试剂（柱吸收量为 流动相浓度>10mM时，任何浓度的TFA都无法达到与HFBA类似的分离效果。 7-4-2初始实验 对于离子样品，IPC的初始实验条件一般与反相分离相同（见图7-7）。也就是说，开始时不用离子对试剂。当已确定IPC合适后，则在流动相中加入合适的离子对试剂。其它条件保持不变，所以问题是：选用何种离子对试剂与用多大的浓度？ 目前应用的大多数离子对试剂为烷基磺酸盐或四烷基铵盐，二者都可以在210nm波长以上进行UV检测。烷基磺酸盐和高氯酸盐（ClO4-）有时用于分离碱性化合物，但通常这些IPC试剂并无特殊优点。磺酸盐通常用于碱性样品，以增加质子化碱和其它阳离子的保留值。四烷基铵盐用于酸性样品，以增加解离的酸和其它阴离子的保留值。酸、碱和╱或中性混合物的试剂类型（阴离子或阳离子）的选择将取决于初始色谱图，如图7-8中所示。 混合荷电相反的离子对试剂（如磺酸盐加季胺盐化合物），其结果通常适得其反，因为2试剂会发生结合，因此易于抵消它们各自对样品的保留效果。据报道可以十六烷基三甲胺（CTMA）和十二烷基磺酸盐（DS）的联合使用分离碱性样品，其中CTMA的主要作用是降低固定相硅羟基的影响。该项研究也报道用该2种IPC试剂可进一步控制保留值和选择性。 7-4-1-3节的讨论表明如果改变离子对试剂浓度，以获得相同的固定相荷载[如C6-与 C10-磺酸盐（如图7-12C）或四乙基与四丁基铵盐]，则采用不同链长的离子对试剂也能获 方法通过改变试剂浓度，可发掘较大范围的离子对选择性。图7-13a的曲线（在约300μmol ╱g）的色谱柱最大试剂吸收量时，趋于平衡，这可通过在0%甲醇时采用大约40mM的试剂浓度来实现。若流动相是40%的甲醇，需要的该试剂浓度则高得多（>>40mM），以获得最大的色谱柱吸收量。因此，辛烷磺酸盐对于含40%以上甲醇的流动相不甚合适。该情况下，应用保留更强的离子对试剂（如C10-或C12-磺酸盐等）可能更好。 图7-13b总结了较好的磺酸盐试剂及其浓度,它们能为含不同甲醇浓度的流动相提供有效的离子对(有效的试剂吸附量)。例如：若流动相为25%甲醇-水，最好选用C8-或C16-磺酸盐，初始浓度分别为大约30或10mM。该初始浓度（约能提供1╱3的最大色谱柱试剂吸附量）可以在不同条件时上下调整，以改变试剂吸附量和离子对的范围，进而改变峰间距。 若以乙腈或THF代替甲醇，可用表7-3估计所推荐的试剂类型及浓度。例如，以25%乙腈作流动相，相当的甲醇百分比为50%。那么，图7-13b显示C10-或C12-磺酸盐的初始浓度分别为25mM或5mM。图7-13c提供的类似指南为应用四烷基季胺试剂分离酸类的情况。 表7-3 用阴离子对试剂（如烷基磺酸盐）a的HPLC中的溶剂强度关系（百分比） a例如，若20%甲醇可获得较好的保留值范围（0.5 7-4-3控制保留值范围和选择性：改变%B，p H和离子对试剂浓度 7-4-3-1保留值范围 RPC方法建立期间，分离中性样品时控制保留值范围比较容易。首先改变流动相组成（%B）以获得0.5 分离离子样品的情况略有不同。在通过改变p H、离子对试剂浓度等试图改变选择性时，可能会使保留值和保留值范围发生过大的变化。使得IPC的方法建立略复杂于RPC。但另一方面，也可以对这种保留值的过度变化加以利用。例如，对于起初似乎需要梯度洗脱的离子样品，用离子对条件都可以进行等度分离，0.5 在图7-8a的梯度分离和图7-8b的等度分离中，4种化合物X~X2与HB的保留较弱，而MP与PP的保留很强。该种流动相的等度洗脱不可能达到0.5 其它样品也可以图7-8示例的类似方式，通过改变p H或离子对调整其保留值和保留值范围。应记住磺酸盐试剂可剧烈增加带正电荷组分的保留值，并剧烈降低带负电荷组分的保留值（四烷基铵试剂则相反）。任何离子对试剂都可能降低中性样品的保留值，但幅度不大。 实验2 离子交换法制备去离子水 一、实验目的 1．了解离子交换法的原理。 2．掌握离子交换柱的制作方法及去离子水的制备方法。 3．学习电导率仪的使用及水中常见离子的定性鉴定方法。 二、实验原理 1．离子原理 无论是工农业生产用水、日常生活用水，还是科研实验用水，对水质都有一定的要求。在天然水或者自来水中含有各种各样的无机和有机杂质，常见的无机 杂质有+2Mg 、+2Ca 、-23CO 、-3HCO 、-Cl 离子及某些气体。常见的处理方法有 蒸馏法、电渗析法和离子交换法。本实验中主要介绍离子交换法的原理及应用。 离子交换法中起核心作用的物质就是离子交换树脂，它是一种具有网状结构的有机高分子聚合物，由本体和交换基团两部分组成，其中本体起的是载体作用，而本体上附着的交换基团才是活性成分。根据活性基团类型的不同，可以把离子交换树脂分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。 典型的阳离子交换树脂是磺酸盐型交换树脂，其结构为 其中H +离子可以电离，进入溶液，并与溶液中阳离子如+Na 、+2Mg 、+ 2Ca 离子等进行交换，故名为阳离子交换树脂。 典型的阴离子交换树脂如季铵盐型离子交换树脂，其结构为 其中-OH 离子可以电离进入溶液，并与溶液中阴离子-24SO 、- CI 离子等进行 交换，故名为阴离子交换树 脂 等净化的水分别经过阴 离子交换树脂后，杂 质离子被+H 离子和-OH 离子所取代，最后通过中和反应 结合生成水，达到净化的 目的。值得指出的是离子交换法只 能对水中电解质杂质有较好的净化作用，而对其他类型杂质如有机杂质是无能为力的。 实际生产时，将离子交换树脂装填入容器状管道中，做成离子交换柱（见图3.28），一个阳离子交换柱和一个阴离子交换柱串联在一起使用，称为一级离子交换法水处理装置（图3.29）。该装置串联的级数越多，去杂质的效果显然越好。实际上实验室里使用的所谓蒸馏水，有很多就是通过离子交换法制得的。 离子换柱在使用过一段时间后，柱内树脂的离子交换能力会出现下降，解决办法是分别让NaOH 溶液和HCl 溶液流过失效的阳离子和阴离子交换树脂，这一过程叫做离子交换树脂的再生。 2．水质的检验 由于纯水中只含有微量的+H 离子和-OH 离子，所以电导率极小，如果水中含有电解质杂质，会使得水的电导率明显增大。故用电导率仪测定水样的电导率大小，可以估计出水样的纯度。 另外还可以用化学方法对水样中常见离子进行定性鉴定： （1）-C1离子：用3AgNO 溶液鉴定。 （2）- 24SO 离子：用2BaC1溶液鉴定。 （3）+2Mg 离子：在pH 约为8～11的溶液中，用铬黑T 检验+2Mg 离子。若无+2Mg 离子，溶液呈蓝色；若有+2Mg 离子存在，则与铬黑T 形成酒红色的 离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理： 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质： 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可 离子交换色谱 一、实验原理： 离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC) 是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂 ; 而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 离子交换层析是用离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。 二、实验设计 离子交换剂；缓冲液；洗脱剂 具体操作： 1、离子交换介质的选择： 考虑目的分子的大小，目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱，目的分子稳定，选择强交换介质。 对于大多数纯化步骤来说，建议开始的时候使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。如果选用阴离子交换剂，使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷，可与阴离子交换剂结合。如果选用阳离子交换剂，缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。对于一个未知等电点的蛋白质，可以先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透 析至pH7.0，然后过阳离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pHo 如果目的蛋白再穿过液中，说明目的蛋白在此 pH条件下带正电荷，可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸8.0，然后再过阴离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的 pH。以此类推，直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止，也可用阳离子交换剂作类似的选择，不过要注意，pH 的改变应向减小的方向进行。 功能集团的强弱 一般情况下，在分离等电点pH为6-9的目的分子，尤其是当目的分子不稳定时，需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。 流动相(缓冲液)的选择： 离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对 pH有一定缓冲作用的溶 离子交换法 早在古希腊时期人们就会用特定的黏土纯化海水.算是比较早的离子交换法.这些黏土主要是沸石....离子交换树脂都是用有机合成方法制成。常用的原料为苯乙烯或丙烯酸(酯)，通过聚合反应生成具有三维空间立体网络结构的骨架，再在骨架上导入不同类型的化学活性基团(通常为酸性或碱性基团)而制成。例:苯乙烯型树脂的合成可分为阴离子类型和阳离子类型. 一．定义 离子交换法(ionexchangeprocess)是液相中的离子和固相中离子间所进行的一种可逆性化学反应，当液相中的某些离子较为离子交换固体所喜好时，便会被离子交换固体吸附，为维持水溶液的电中性,所以离子交换固体必须释出等价离子回溶液中。二．原理 离子交换法是以圆球形树脂(离子交换树脂)过滤原水,水中的离子会与固定在树脂上的离子交换.常见的两种离子交换方法分别是硬水软化和去离子法.硬水软化主要是用在反渗透(RO)处理之前,先将水质硬度降低的一种前处理程序.软化机里面的球状树脂,以两个钠离子交换一个钙离子或镁离子的方式来软化水质. 离子交换树脂利用氢离子交换阳离子，而以氢氧根离子交换阴离子；以包含磺酸根的苯乙烯和二乙烯苯制成的阳离子交换树 脂会以氢离子交换碰到的各种阳离子(例如Na+、Ca2+、Al3+)。同样,以包含季铵盐的苯乙烯制成的阴离子交换树脂会以氢氧根离子交换碰到的各种阴离子(如Cl-)。从阳离子交换树脂释出的氢离子与从阴离子交换树脂释出的氢氧根离子相结合后生成纯水。 阴阳离子交换树脂可被分别包装在不同的离子交换床中，分成所谓的阴离子交换床和阳离子交换床。也可以将阳离子交换树脂与阴离子交换树脂混在一起，置于同一个离子交换床中。不论是那一种形式，当树脂与水中带电荷的杂质交换完树脂上的氢离子及(或)氢氧根离子，就必须进行“再生”。再生的程序恰与纯化的程序相反，利用氢离子及氢氧根离子进行再生，交换附着在离子交换树脂上的杂质。 三．纯化方法 若将离子交换法与其他纯化水质方法(例如反渗透法、过滤法和活性碳吸附法)组合应用时，则离子交换法在整个纯化系统中，将扮演非常重要的一个部分。离子交换法能有效的去除离子，却无法有效的去除大部分的有机物或微生物。而微生物可附着在树脂上，并以树脂作为培养基，使得微生物可快速生长并产生热源。因此，需配合其他的纯化方法设计使用。 四．离子交换树脂 离子交换树脂一般呈现多孔状或颗粒状，其大小约为0.1~1mm。其离子交换能力依其交换能力特征可分： 第八章离子交换法 一、填空题 1、离子交换剂由、和组成。平衡离子带 为阳离子交换树脂，平衡离子带称阴离子交换树脂。 2、常见的离子交换剂有，，等。 3、离子交换树脂的基本要求有、、 、和。 4、影响离子交换选择性的因素主要有、、 、、等。 5、请写出下列离子交换剂的名称和类型：CM-C的名称是，属于交换纤维素; DEAE-C的名称是，属于交换纤维素;。 6、色谱聚焦（chromatofocusing）是一种高分辨的新型的蛋白质纯化技术。它是根据，结合，能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦效应浓缩，分辨率很高，操作简单。 7、写出下列离子交换剂类型：732 ，724 ，717 ，CM-C ,DEAE-C ，PBE94 。 8、在采用多缓冲阴离子交换剂作固定相的离子交换聚焦色谱过程中，当柱中某位点之pH 值下降到蛋白质组分值以下时，它因带电荷而，如果柱中有两种蛋白组分，pI值较者会超过另一组分，移动至柱下部pH较的位点进行。 9、影响离子交换选择性的因素有、、、 、。 二、选择题 1、用钠型阳离子交换树脂处理氨基酸时，吸附量很低，这是因为（） A.偶极排斥 B.离子竞争 C.解离低 D.其它 2、在酸性条件下用下列哪种树脂吸附氨基酸有较大的交换容量（） A.羟型阴 B.氯型阴 C.氢型阳 D.钠型阳 3、在尼柯尔斯基方程式中，K值为离子交换常数，K＞1说明树脂对交换离子吸引力（） A.小于平衡离子 B.大于平衡离子 C.等于平衡离子 D.其它 三、名词解释 1、蛇笼树脂： 2、尼柯尔斯基方程式： 3、偶极离子排斥作用： 四、问答题 1、简述离子交换纤维素的特点有哪些？ 2、请以CM-C 为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各种方法的洗脱原理。 3、请以DEAE-C 为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各种方法的洗脱原理。 4、由下图，利用给出的两种离子交换剂（E 1，E 2）分离3种蛋白质（P 1、P 2、P 3），用箭头流 程图表示(并指出E 1，E 2的类型)。 5、下图为离子交换法应用实例，请填写生产工艺流程中的空格（可选因素：阴离子交换树脂，阳离子交换树脂， 0.05mol/L 氨水，0.1mol/L 氨水，2mol/L 氨水）。简述从“滤液”开始，以后步骤的分离原理？ 实验二离子交换法制备纯水 一、实验目的 1．了解离子交换法制纯水的基本原理，掌握其操作方法； 2．掌握水质检验的原理和方法； 二、实验原理 离子交换法是目前广泛采用的制备纯水的方法之一。水的净化过程是在离子交换树脂上进行的。离子交换树脂是有机高分子聚合物，它是由交换剂本体和交换基团两部分组成的。例如，聚苯乙烯磺酸型强酸性阳离子交换树脂就是苯乙烯和一定量的二乙烯苯的共聚物，经过浓硫酸处理，在共聚物的苯环上引入磺酸基(–SO3H)而成。其中的H+可以在溶液中游离，并与金属离子进行交换。 R–SO3H + M+R–SO3M + H+ R：聚合物的本体；–SO3：与本体联结的固定部分，不能游离和交换；M+：代表一价金属离子。阳离子交换树脂可表示为： 如果在共聚物的本体上引入各种胺基，就成为阴离子交换树脂。例如，季胺型强碱性阴离子交换树R–N+(CH3)3OH–，其中OH–在溶液中可以游离，并与阴离子交换。 离子交换法制纯水的原理就是基于树脂和天然水中各种离子间的可交换性。例如，R–SO3H 型阳离子交换树脂，交换基团中的H+可与天然水中的各种阳离子进行交换，使天然水中的Ca2+、Mg2+、Na+、K+等离子结合到树脂上，而H+进入水中，于是就除去了水中的金属阳离子杂质。水通过阴离子交换树脂时，交换基团中的OH–具有可交换性，将HCO3–、Cl–、SO42–等离子除去，而交换出来的OH–与H+发生中和反应，这样就得到了高纯水。 交换反应可简单表示为： 2R–SO3H + Ca(HCO3)2→ (R–SO3)2Ca + 2H2CO3 R–SO3H + NaCl → R–SO3Na + HCl R–N(CH)3OH + NaHCO3→ R–N(CH)3HCO3 + NaOH R–N(CH)3OH + H2CO3→ R–N(CH)3HCO3 + H2O HCl + NaOH → H2O + NaCl 本实验用自来水通过混合阳、阴离子交换树脂来制备纯水。 [实验用品] 仪器：离子交换柱(也可用碱式滴定管代替)。 材料：玻璃纤维(棉花)、乳胶管、螺旋夹、pH试纸。 固体药品：717强碱性阴离子交换树脂、732强酸性阳离子交换树脂。 液体药品：NaOH(2mol·L-1)、HCl(2mol·L-1)、AgNO3(0.1mol·L-1)、NH3–NH4Cl缓冲溶液(pH=10)、铬黑T指示剂。 三、实验步骤 1．树脂的预处理 将717(201×7)强碱性阴离子交换树脂用NaOH(2mol·L-1)浸泡24小时，使其充分转为OH-型（由教师处理）。取OH-型阴离子交换树脂10mL，放入烧杯中，待树脂沉降后倾去碱液。加20mL 蒸馏水搅拌、洗涤、待树脂沉降后，倾去上层溶液，将水尽量倒净，重复洗涤至接近中性(用pH 试纸检验，pH=7～8)。 将732(001×7)强酸性阳离子交换树脂用HCl(2mol·L-1)浸泡24小时，使其充分转为H+型（由教师处理）。取H+型阳离子交换树脂5mL,于烧杯中,待树脂沉降后倾去上层酸液，用蒸馏水洗涤树脂，每次大约20mL，洗至接近中性(用pH试纸检验pH=5～6)。 最后，把已处理好的阳、阴离子交换树脂混合均匀。 2．装柱 实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。pH7.2 ～7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 5.0.02 ％NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。 2 ．装柱 （ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。 4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面 蛋白纯化离子交换层析 研究生的生活，单调的科研，重复的脚印，匆匆的轨迹，踩着早上的时光一如往常的走进实验室，摊开实验记录本，写上日期，就像每天写日记一样开始计划今天的实验日记，用笔似乎要绘制一副有关实验的画面。 如果你处在这样的科研氛围里，慢慢的就会体味到科学本身就像窗外的大自然一样的美，绿色撩人，诗意陶醉…… 今天，我们写下的实验日记——蛋白纯化离子交换层析法，文章详细的总结了离子交换层析的定义、离子交换层析的原理、离子交换剂的种类，似乎要提醒一下脑子要保持清醒了，不然，看完之后，你能分清楚阴阳离子交换剂的概念，熟知它们的区别么？ ————你会创造规律科研生活的美 我，生在春天里，刚发芽的地方是实验室 知了也睡了，而我刷夜实验室 因为我在等待秋天收获的季节 虽然有可能错过成功的喜悦，却收获心灵上的成长 离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静 离子交换树脂的制备方法 离子交换树脂的发展是以缩聚产品开始的，然后出现了加聚产品，在合成离子交换树脂的初期，主要是以缩聚型为主，但是合成的树脂难以成球状并且化学稳定性较差，机械强度不好，在使用过程中常有可溶性物质渗出。现在使用的离子交换树脂几乎都是加聚产品。 一、苯乙烯系离子交换树脂的合成 苯乙烯系离子交换树脂是苯乙烯和二乙烯苯（DVB）在水相中进行悬浮共聚合得到共聚物珠体，然后向共聚体中引入可离子化的基团而合成的。苯乙烯系离子交换树脂的用量占离子交换树脂总用量的95%以上，这是因为苯乙烯单体相对便宜并可大量得到，并且不易因氧化、水解或高温而降解。聚苯乙烯树脂以聚苯乙烯为骨架，与小分子的功能基以化学键的形式结合，因此既保留了原有低分子的各种优良性能，又由于高分子效应可增添新的功能，这使得离子交换树脂的性能大幅度提高，品种成倍地增加，应用范围迅速扩大，大大促进了化工企业、制药工业、环保等行业的发展，对世界经济、政治、军事的发展产生了巨大的影响【1】。 将苯乙烯，二乙烯苯进行悬浮共聚，加入分散稳定剂，在搅拌的条件下可以得到粒度合适，大小均匀的球状共聚体（PS）。稳定剂的性质、搅拌条件、温度等因素对悬浮聚合的影响很大。用难溶性无机物微粉末作悬浮稳定剂时，得到的聚合球粒大小比较均匀，并且在微粉末稳定剂用量相同时，粉末越细，得到的球粒越小。在苯乙烯，二乙烯苯悬浮共聚时加入沉淀剂、良溶剂或线型高聚物等做致孔剂，聚合结束后将致孔剂提取出来，得到多孔性的共聚物【2】（Pst型，称为大孔树脂）。把这种共聚物进一步制成离子交换树脂，发现其离子交换速度加快，机械强度增大，稳定性增强。由于这类树脂其具有与活性炭类似的吸附能力【3】，可以回收吸附质，所以被广泛用于有机物的分离纯化【4】、工业有机废水的处理【5-6】、生化产品【7】等。值得注意的是，在合成大孔共聚物时，为保证孔结构的稳定，交联剂用量比合成凝胶型时要多。王亚宁等【8】以液体石蜡、甲苯和环己酮作致孔剂，采用悬浮聚合合成大孔吸附树脂，研究了单体和致孔剂组成对孔结构的影响。V everka等【9】将大孔型低交联苯乙烯-二乙烯苯（PSt-DVB）共聚物（DVB含量在2 % ~ 8 %之间）在二氯乙烷、硝基苯或其混合溶剂中充分溶胀后，在一定温度及催化剂存在下与交联剂发生后交联反应，制得高比表面积（约1000m2/g）及包含微孔、中孔结构的超高交联聚苯乙烯树脂。 二、丙烯酸系离子交换树脂的合成 1. 丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂的合成 丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与二乙烯苯进行自由基悬浮共聚合，然后在强酸或强碱条件下使酯基水解，可得到丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂。由丙烯酸甲酯制得的弱酸性阳离子交换树脂有较高的交换容量，因此应由也较广。 2. 丙烯酸系碱性阴离子交换树脂的合成 聚丙烯酸甲酯与多胺反应，形成含有氨基的弱碱性阴离子交换树脂。多乙烯多胺中的任何一个氨基都有可能与酯基反应。一个多乙烯多胺分子中也可能有多于一个的氨基参与反应，结果产生附加交联。由于附加交联的形成，由丙烯酸甲酯与二乙烯苯形成的共聚物与多乙烯多胺反应，仍可形成机械强度高的弱碱性阴离子交换树脂。 三、缩聚型离子交换树脂的合成 1．缩聚型强酸性阳离子交换树脂的合成 可通过两种方法由苯酚、甲醛和硫酸合成缩聚型强酸性阳离子交换树脂。第一种方法为甲醛与苯酚缩聚，然后用硫酸磺化酚醛缩聚物；第二种方法为先合成苯酚磺酸，接着与甲醛缩聚。 第二种方法更可取。具体合成方法是：将硫酸加到苯酚中，在100℃搅拌4h，生成苯 离子交换层析实验原理及步骤 离子交换层析实验方法 阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。 1. 剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。 下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法 2. 膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。 表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系 血清样品量（ml） DEAE需用量（g） 选层析柱规格（cm） 选脱液量（ml） 1~2 2 1×25 100~150 5 5 2×12 200~300 10 10 2×20 300~400 20 20 2×37 400~800 称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。 3. 平衡 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。 4. 装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10∶1～20∶1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。 装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。 5. 上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。 样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的—球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。 第七节离子交换色谱 离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEC)是发展最早的色谱技术之一。20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在表面，造成有效交换容量很小；②树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性；③树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。 20世纪50年代中期，Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-）纤维素和二乙氨乙基（DEAE-）纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力，而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交 换容量，而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱，因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后，多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成，包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等，以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷，极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。 一、离子交换色谱相关理论 (一)基本原理 离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换 剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。 图6.7-1 离子交换色谱原理 梯度缓冲液中的离子；极限缓冲液中的离子； 待分离的目标分子；▲需除去的杂质 1- 上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；2- 吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3- 开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4- 完全解吸阶段，目标分子被洗脱；5- 再生阶段，用起始缓冲液重新平 衡色谱柱，以备下次使用 蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化，即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换，带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。 (二)基本理论 1 . 离子交换作用 离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成，在水溶液中，与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、 1离子交换法合成m-LiMnO2 在空气中高温固相反应合成了层状单斜结构前驱体α-NaMnO2,在不同条件 下进行离子交换反应, 得到m-LiMnO2。 2.2.1.1 Mn2O3的制备以电解MnO2为原料在高温下煅烧，温度控制在800℃， 煅烧时间为12h，然后将样品随炉冷却至室温 2.2.1.2 α-NaMnO2前驱体的合成将Mn2O3和无水Na2CO3按物质的量比1∶1.1 混合，于玛瑙研钵中充分研磨使其混合均匀，然后于箱式电阻炉中进行煅烧。在空气中升温至指定温度（800℃）后恒温24h，在空气中淬火。充分研磨后，再于800℃焙烧24h，制得NaMnO2，样品随炉冷却。 2.2.1.3 m-LiMnO2的合成按摩尔比8∶1 称取一定质量的LiBr和α-NaMnO2，将LiBr在一定正己醇中完全溶解，配制为5mol/L溶液，然后加入α-NaMnO2摇匀，在145-154 ℃下加热沸腾回流8h左右。冷却至室温，将混合液过滤，沉淀物用1-正己醇和乙醇洗涤，然后干燥备用。 2实验部分 以Co(NO3)2、Ni(NO3)2、MnAc2 和LiNO3 为原料，按r(Li: Co:Ni:Mn)=1.05:0.10:0.10:1.80 进行配料，溶解混匀后置于超声场（220 W，32 kHz）中作用20 min，同时逐滴滴加氨水调节pH 值为7.5，得到前驱物沉淀（同时作无超声作用的对比），然后在可控电炉上于110℃蒸发浓缩至干燥得前驱物。前驱物在350℃烧结2 h，取出研磨后于550℃预烧10 h，780℃下通空气烧结50 h，再于500℃回火5 h。所得产物采用高锰酸钾容量法[9]、硫酸亚铁铵容量[10]作Mn 含量和平均价态的容量分析；采用JL—1166 型激光粒度测试仪测定产物的粒度分布和平均粒径；用Philips 公司X`PertproMPD X 射线衍射仪作物相分析；用日本日立扫描电镜（S—450）和美国X 射线能量色散谱仪（EDAX 9100/60）作形貌观察和元素含量半定量分析。将产物按ζ（掺杂锰酸锂（活性物）:导电炭黑（导电剂）:LA132（粘结剂）） 仲恺农业工程学院Array论文题目：离子交换与离子交换色谱 论文作者：陈维权万辉 作者学号：201111014228 201111014229 所在院系：化学化工学院 专业班级：应用化学112班 指导老师：刘展眉 离子交换与离子交换色谱 摘要 本文对离子交换与离子交换色谱技术进行了综述。简要介绍了离子交换剂的作用原理；重点系统的论述了有机离子交换技术和无机离子交换技术的研究进展。并展望了有机离子交换技术和无机离子交换技术的发展方向。 关键词 离子交换色谱离子交换剂有机离子交换无机离子交换 Abstract This article by ion-exchange chromatography and ion exchange technologies for review. Brief description of the action principle of ion exchanger; key system deals with organic and inorganic ion-exchange technology of ion-exchange technology advances. And the prospect of organic ion exchange technology and development trend of inorganic ion-exchange technology. Keywords Ion Exchange Color spectrum Ion exchanger Organic ion exchange Inorganic ion exchanger 引言 随着科学技术的发展，现代分析化学的分析对象越来越复杂，待检测组分含量越来越复杂，待检测组分含量越来越低，在地球和宇宙科学、环境科学、生命科学、材料科学以及医学和考古学中，经常要求检测μg∕g,nm∕g,pg∕g甚至更低含量的组分。目前虽然有许多灵敏度和选择性很高的仪器分析方法，但在分析实践中，常常由于存在基体效应以及其他各种干扰而难以得到准确的结果，因此在分离富集仍然是分析方法中不可缺少的重要环节。 回顾化学的发展历史便可以发现：化学的发展离不开分离富集。元素周期表中的各个元素的发现，经典的化学分离和提纯方法都曾经起着重要作用。从二十世纪开始，各种天然放射性元素的逐个发现，人工放射性元素的获得，原子核裂变现象的最终确认，几乎都离不开各种化学分离技术。今年来生命科学的许多重要成就，也都与分离科学有着紧密联系。在大多数分析实验中，对复杂物料的分析或痕量、超痕量分析一般均采用样品制备-分解-分离富集-测定-数据处理的分析流程，也就是说，分离富集是分析流程中必不可少，而且往往是相当困难而又关键的环节。从分析仪器的研制和发展趋势看，分离富集技术与测量技术紧密结合是仪器分析的必然趋势。目前最有成效的是气相色谱仪、高效液相色谱仪、离子色谱仪以及测汞仪等，它们都是集分离- 8生物制药工艺学习题集-离子交换法 第八章离子交换法 一、填空题 1、离子交换剂由、和组成。平衡离子带 为阳离子交换树脂，平衡离子带称阴离子交换树脂。 2、常见的离子交换剂有，，等。 3、离子交换树脂的基本要求 有、 、 、 和。 4、影响离子交换选择性的因素主要有、、 、、等。 5、请写出下列离子交换剂的名称和类型：CM-C 的名称是，属于交换纤维素; DEAE-C的名称是，属于 交换纤维素;。 6、色谱聚焦（chromatofocusing）是一种高分辨 的新型的蛋白质纯化技术。它是根 据，结合，能 分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦效应浓 缩，分辨率很高，操作简单。 7、写出下列离子交换剂类型： 732 ， 724 ， 717 ， CM-C ,DEAE-C ，PBE94 。 8、在采用多缓冲阴离子交换剂作固定相的离子 交换聚焦色谱过程中，当柱中某位点之pH值下 降到蛋白质组分值以下时，它因带 电荷而，如果柱中有两种蛋白组分， pI值较者会超过另一组分，移动至柱下 部pH较的位点进行。 9、影响离子交换选择性的因素 有、、 、 、。 二、选择题 1、用钠型阳离子交换树脂处理氨基酸时，吸附量很低，这是因为（）A.偶极排斥B.离子竞争C.解离低D.其它 2、在酸性条件下用下列哪种树脂吸附氨基酸有较大的交换容量（） A.羟型阴 B.氯型阴 C.氢型阳 D.钠型阳 3、在尼柯尔斯基方程式中，K值为离子交换常 A.小于平衡离子 B.大于平衡离子 C.等于平衡离子 D.其它 三、名词解释 1、蛇笼树脂： 2、尼柯尔斯基方程式： 3、偶极离子排斥作用： 四、问答题 1、简述离子交换纤维素的特点有哪些？ 2、请以CM-C为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各种方法的洗脱原理。 离子交换层析法 一、原理 离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 二、方法与步骤： 1.实验试剂与仪器：可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水，层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂...... 2.实验步骤 （1）装柱： 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，用去离子水冲洗填料5个柱体积; （2）柱的平衡与上样： 用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6;对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合; （3）洗杂蛋白： 用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测; 分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL 的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； （4）解离目的蛋白（洗脱）： 分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测; （5）柱的清洗与保存： 用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml;用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。 三、适用范围与应用 离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生 离子交换层析 1、定义 2、发展 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。 3、基本信息 离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 4、具体操作 预处理和装柱 对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。 洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。实验2 离子交换法制备去离子水
离子交换柱层析原理
离子交换色谱
离子交换法47802
8生物制药工艺学习题集 离子交换法
离子交换法制备纯水
离子交换层析
蛋白纯化离子交换层析法
离子交换树脂的制备方法
离子交换层析实验原理及步骤
第七节离子交换色谱
离子交换法合成
离子交换与离子交换色谱
8生物制药工艺学习题集-离子交换法
离子交换层析法
离子交换层析