土壤真菌分离计数

兼用于土壤真菌的分离和计数：孟加拉红琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基(PDA)、麦芽浸汁琼脂培养基(MEA)和牛胆汁琼脂培养

孟加拉红琼脂培养基是一种组合培养基，成分准确，其上发育的真菌数量及种类较多，放线菌及大部分细菌易被孟加拉红和链霉素所抑制，但真菌菌落较小，是最常用的土壤真菌分离和计数培养基。然而由于孟加拉红琼脂培养基对真菌菌落和繁殖器官形成的限制，以及染料影响在原始平皿上正常识别某些真菌，与酸性培养基相比，必须转移更多的菌落到其它的培养基上。

PDA和MEA均为酸化的天然培养基，能抑制全部细菌和放线菌。但由于酸度过高。有些耐酸性较弱的真菌，在其上不能发育，因此出现的数量及种类都比孟加拉红琼脂培养基上低。

牛胆汁琼脂培养基上菌落发育不大，放线菌和细菌也全部被抑制，数量准确，但由于结晶紫的影响，不易在培养基上直接鉴定。

土壤真菌常用的分离方法：

1、稀释法

此种方法在土壤真菌分离中最常用，用无菌水将土壤稀释后得到10-3～10-4的悬浮液，将一定量稀释悬浮液均匀涂抹于培养基上，菌落长成后，将单个菌落挑出、培养、鉴定。

这种方法对土壤中产孢量大的半知菌、子囊菌和接合菌，如青霉属Penicillium，曲霉属Aspergillus和毛霉属Mucor等有利，所分离到的主要是以孢子形态存在于土壤的真菌，以菌丝体形式存在的则较难分离到。这种方法分离的真菌并不能代表土壤中真菌的真实存在情况，因为部分真菌的孢子和菌丝经常附着在土壤颗粒上，没有被充分洗脱下来，因而也就无法继续培养，这样有可能丢失了很大部分真菌。

2、土壤平板法

将一定量土壤(一般1.5~5 mg)移入灭菌的培养皿中，涂平，然后倒入冷却至45℃的培养基，摇匀后培养；或将土壤直接加在冷却后的培养基表面培养。

稀释法分离过程中，附着在矿物粒子或埋藏在腐殖质内的真菌不易分离到，此种方法可较全面获得土壤中的真菌，除了以休眠孢子存在的真菌还可以分离以菌丝存在的真菌。若土壤中存在腐霉（Pythium）、木霉（Trichoderma）或毛霉（Mucor）等真菌，由于生长过快，会很快覆盖培养皿而不易分离得到其他生长相对慢的真菌，因此该方法对生长较快的真菌有利。

3、菌丝分离法

一定量土壤充分冲洗后，过孔径50μm的筛，残留筛上的土粒置于培养皿中，体视镜下观察，将黏附于土粒上的菌丝或菌丝块取出，置于培养皿中，然后倒入培养基培养，将生长的新菌丝顶端切下后再培养，这种方法分离的真菌一般都是前两种方法未分离到的。

该方法对以下真菌的分离有利：菌丝较粗；不易断裂；颜色较深。但这种方法获得的分离物在培养过程中，经常作为不育菌丝的形态存在，难以产孢，因此无法鉴定，而且费时、费力，不是很常用。

4、诱饵法

这是一种生物学的方法，适合于从土壤中分离数量较少的特定真菌，即将“诱饵”埋入土壤一段时间，取出后直接培养以此获得所需要的真菌。分离的真菌不同，所选用的诱饵也不同，如大麻种子就是分离水生菌以及腐霉属Pythium很好的诱饵；而凤梨的茎和叶子能够诱集Phytophythora cinnamomi；胡萝卜的圆片可以诱集Thielaviopsis basicola；土豆的块茎诱集Phytophthora infestans；喜角质的壶菌常用的诱饵为人的毛发。

5、其他的分离方法

孢子悬浮法：最初用来分离长蠕孢属Helmithosporium，也适于分离其他以孢子状态存在土壤的真菌。

干燥法：通过将土样用氯化钙干燥后，进行分离。该种方法分离获得的是在土壤中以孢子状态存在的真菌，而以菌丝状态存在的真菌则因为干燥失水死亡。

埋管法和Rossi-Cholodny埋片法：这两种方法中，生长旺盛、对低氧忍耐较强的真菌比较容易分离到，较易分离以活跃菌丝存在的种类，如立枯丝核菌Rhizocotoniasolani。

土壤真菌计数法

直接计数法培养后测定菌落数【稀释平板法、土粒法以及最大概率数值法】

间接计数法土壤真菌染色后在显微镜下计数【Rossi-Cholodny埋片法、Jones-Mollison 法、Thornton-Gray (Ratio)法、土壤切片法、荧光抗体法以及电子显微镜直接观察法、荧光显微镜观察法等】

直接计数法

稀释平板法

根据土壤中真菌的数量，一般采用的稀释度为10-1~10-3，同时称取待测土样10g左右，经105℃烘干8h，置于干燥器中，待冷却后称重，计算土壤含水量的百分数。用混菌法和刮刀法将土壤悬液接种在培养皿中，重复4次，于28~30℃恒温箱中培养5~7d，选取菌落数在10~100的培养皿进行计数(剔除扩散性真菌菌落占据琼脂表面15%的培养皿)。

最大概率数值法

以烟草黑腐病菌根串珠霉(Thielaviopsis basicola)为例，取烘箱干燥土样10g。用每毫升含60μg金霉素的灭菌蒸镏水配制每级10倍的稀释液至10-5或10-6。在铺有滤纸的培养皿内放3片10mm厚的胡萝卜片，用直径23mm的打孔器在上面打出一凹穴，加入稀释液1mL，重复3次。接种6~7d，记录发病胡萝卜饼数目。若2~6次稀释度中获得阳性结果(5，4，2，0，0)。以p1为5，p2为4，p3为2的值，查表得近似值2.2。

土粒法

对于不产孢子的真菌，采用将土粒接种在选择性培养基上的方法来分离计数。取少量土样加无菌水调成糊状，用圆头玻璃棒在平板上点样，适温下培养一定时间后，观察生长情况，结果以百分数表示。此方法只能得到不同土壤之间同类真菌数量的比较粗略的数据。

间接计数法

Rossi-Cholodny埋片法

将载玻片埋在土壤中，经过一定时间后镜检测定载玻片表面生长的微生物的半定量方法。真菌一般放大400~600倍，每枚标本片观察100~400个视野，以检出真菌的视野数与总视野数之比表示生育量(检出频率%)。此方法适用于测定不同时期不同土壤中真菌菌丝体丰度，然而不能测定每单位重量土壤的菌数(生育量)。

毛细管法

根据微生物利用土壤本身的毛细管系统输送的空气和养分而生存的原理。将灭菌的毛细管插入融化的0.2%琼脂中，然后安装在支架上，插入土壤中，一定时间后取出，用5%碳酸赤藓红染色，在显微镜下观察。此方法能显示出天然生境下的微生物区系，并分离出许多未能为平板法所揭示的微生物种，但得不出单位重量土壤中所含真菌数量。不过，反映出的数量仍可作为不同土壤之间的相对比较。

Jones-Mollison法

依据Thornton(1934)等人的观点将土壤悬浮液与溶化的琼脂充分混合，再制成薄片，使土壤粒子与菌体均匀分散，提高测定总菌数的精确度。本方法适用于土壤中的真菌的菌丝量的检出频率的测定。

以上3种方法由于菌体和有机物质同样被染色，要求操作熟练，但制成的标本保存时间较长。上述3种显微镜直接计数法用酸性染料染色可将菌体和土壤颗粒分开，但无法区分活菌和死菌。

荧光显微观察法

Strugger(1948)利用吖啶橙荧光显微镜技术区分活菌和死菌。一般情况下，活菌比死菌吸收染料少，在荧光镜下分别显示亮绿色和暗红色。此法可进行土壤真菌的定量测定。克拉西里尼科夫提出在土壤样品表面，直接滴加吖啶橙溶液，在落射光照明的显微镜下观察，可以在不破坏土壤结构的情况下研究真菌在土壤中空间分布的状况。还可利用添加熄灭剂来减弱土体的自体发光。Fradkin等观察小麦根腐病菌禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)和其它植物病原菌的分生孢子与菌丝繁殖时，用吖啶橙或铕螯合物染色，在荧光显微镜下可以明显区分真菌的各种结构。常用的荧光染料还有异硫氰酸、1-苯胺、8-萘酚磺酸镁盐、二醋酸盐和萘啶酮酸，其中后两者只染活的微生物。

荧光抗体法

用抗体和荧光素结合制成的荧光抗体试剂处理土壤样品，荧光抗体和存在于样品中的相应抗原产生特异性反应，在荧光显微镜下产生特定的荧光。如果事先制备多种模式的荧光抗体。就可对土壤样品中的相应抗原进行检验。并且荧光抗体可长期保存。本方法由荧光抗体的制备和荧光抗体标本的染色两部分组成，适用于涂抹标本、印片标本、土壤本身、埋片和土壤切片。真菌多使用菌丝的匀浆作为抗原来制备抗体。荧光抗体的染色方法有直接法、间接法及补体法等。本方法可进行土壤真菌的定量测定，并且能够了解土壤真菌的组成情况。

电子显微镜直接观察法

利用电子显微镜观察土壤悬液，用热吸附法制片，可观察到少见的真菌。此方法比稀释平板法的测定结果高几百倍。但改变了土壤的自然状态，且不能得到纯培养，不能直接作菌种的鉴定。

土壤切片法

利用各种固定剂在不破坏土壤结构的条件下将土壤样本固定，制成观察微生物的剖面或薄片，再进行镜检。自从Kubiena(1938)用塑性物质固定土壤，做了直接观察土壤微生物的试验以来，其后Haarlov & Weis-Fogh(1953，1955)等人试验以琼脂固定制作土壤薄片。Mindermpn(1956)用明胶固定土壤，再以氟化氢处理，除去砂质，可制成7.5~10μm的薄片，再用Johansen(1940)的四重染色法，可将线虫、真菌、细菌、变形虫、土粒等区分清楚。Alexander和Jackson(1954，1958)等人发明了用合成树脂固定土壤的方法，包括土样的采集、染色和洗涤、干燥、固定、切断、薄片的制作及向玻片上埋片。Heppele和Burges(1956)及Burges和Nicholas(1960)等人使用Bukelite聚合树脂S.R.17497，设计出更简便的方法，测定土壤真菌菌丝量，并用于研究土壤层次与菌量的关系。Jones和Griffiths(1969)根据Alexander 等人的方法做成土壤薄片样本，进行了土壤团粒中微生物存在状态的研究。

从土壤中分离分解纤维素的微生物

从土壤中分离分解纤维素的微生物 实验目的 1、利用特定的选择培养基和鉴定培养基从土壤中分离分解纤维素的微生物； 2、掌握刚果红染色的机理和操作。 实验原理 1、以纤维素喂唯一碳源的选择培养基能选择分离分解纤维素的微生物； 2、刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，而不与水解后的纤维二塘和葡萄糖发生这种反应。 实验仪器与用具 除实验五中用到的外，还需要恒温振荡培养箱 实验材料和试剂 取自湿地或原生林地的土样（大于20g） 羧甲基纤维素钠，酵母粉，磷酸二氢钾，蛋白胨，琼脂粉，氯化钠，刚果红，硝酸钠，硫酸亚铁，硫酸镁，磷酸氢二钠，纤维素粉，蔗糖（也可以用廉价的秸秆磨成粉末代替纤维素粉） 实验步骤 将称量好的0.1g蔗糖，0.002g硫酸亚铁，0.1g硫酸镁，0.2g磷酸氢二钠，0.2g硝酸钠，2g纤维素粉（秸秆粉）倒入500ml锥形瓶内，再加入200ml蒸馏水，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀，得选择培养基，备用。

讲称量好的1.5g羧甲基纤维素钠，0.2g蛋白胨，0.1g酵母粉，0.25g 氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，0.1g硫酸镁，4g琼脂粉加入另一个500ml 锥形瓶内，再加入200ml蒸馏水，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀，得鉴定培养基，备用。 用5ml微量可调移液器向编号为1--5号的试管内分别加入9ml蒸馏水，塞上棉塞，备用。 讲配制好的选择培养基，鉴定培养基，5支装有蒸馏水的试管，包好的培养皿（最少9个），枪头放入灭菌锅内在121度下灭菌20min。灭菌后，取出灭菌锅内物品，放入超净台内，用酒精棉球擦拭超净台面和实验者的双手，点燃酒精灯，在酒精灯火焰附近将称量好的20g 土样加入到选择培养基中，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀。 将选择培养基放入恒温振荡培养箱内培养48h（震动培养箱转速为200r/min，控制温度为30度）。 等鉴定培养基冷却到不烫手时，在超净台内酒精灯火焰附近往每个培养皿内倒入20ml左右鉴定培养基，在超净台面轻轻摇匀，熄灭酒精灯，等培养基凝固后，将培养基平板倒置于超净台上。 48h后从恒温振荡培养箱中取出选择培养基，置于超净台上点燃酒精灯，再用1ml微量可调移液器移取1ml选择培养基的菌液到1号试管内，得到稀释10-1的稀释液，并用此方法依次稀释10倍，在5号试管内得到10-5的菌液稀释液，再用1ml微量可调移液器移取3号试管中的菌液，滴加2滴到平板上，用涂布器在平板上均匀涂布（注意

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离 实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 实验材料： 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。 配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。 2.土壤中放线菌的分离 （1）待测样液的制备 选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌 取2支1毫升移液管分别从10-5、10-4菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-5、10-4的培养皿内。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3）涂布平板法分离土壤中放线菌 取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、10-5）、组别、姓名、操作

土壤中的微生物

1．土壤是微生物生长和栖息的良好基地 土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地：其原因在于土壤舍有丰富的动植物和微生物残体，可供微生物作为碳源、氮源和能源。土壤台有大量而全面的矿质元素，供微生物生命活动所需。土壤中的水分都可满足微生物对水分的需求。不论通气条件如何，都可适宜某些微生物类群的生长。通气条件好可为好氧性微生物创造生活条件；通气条件差，处于厌氧状态时又成了厌氧性微生物发育的理想环境。土壤中的通气状况变化时，生活其问的微生物各类群之间的相对数量也起变化。土壤的pH值范围。3．5～10．0之间，多数在5.5～8．5之间，而大多数微生物的适宜生长pH也在这一范围。即使在较酸或较碱性的土壤中．也有较耐酸、喜酸或较耐碱、喜碱的微生物发育繁殖，各得其所地生活着。土壤温度变化幅度小而缓慢．夏季比空气温度低，而冬季又比空气温度高，这一特性极有利于微生物的生长。土壤的温度范围恰是中温性和低温性微生物生长的适宜范围。 因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。事实上，许多对人类有重大影响的微生物种大多是从土壤中分离获得的，如大多数产生抗生素的放线菌就是分离自土壤。 2．土壤中的微生物数量与分布 土壤中微生物的类群、数量与分布，由于土壤质地发育母质、发育历史、肥力、季节、作物种埴状况、土壤深度和层次等等不同而有很大差异。lg肥沃的菜园土中常可含有108个甚至更多的微生物，而在贫瘠土壤如生荒土中仅有103～107个微生物，甚至更低。土壤微生物中细菌最多，作用强度和影响最大，放线菌和真菌类次之，藻类和原生动物等数量较少，影响也小。 (1)细菌 土壤中细菌可占土壤微生物总量的70％～90％，其生物量可占土壤重量的 1/10000左右。但它们数量大，个体小，与土壤接触的表面积特别大，是土壤中最大的生命活动面，也是土壤中最活跃的生物因素．推动着土壤中的各种物质循环。细菌占土壤有机质的1％左右。土壤中的细菌大多为异养型细菌，少数为自养型细菌。土壤细菌有许多不同的生理类群，如固氮细菌、氨化细菌、纤维分解细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸盐还原细菌、产甲烷细菌等在土壤中都有存在。细茼在土壤中的分布方式一般是黏附于土壤团粒表面，形成菌落或菌团，也有一部分散布于土壤溶液中，且大多处于代谢活动活跃的营养体状态。但由于它们本身的特点和土壤状况不一样．其分布也很不一样。 细菌积极参与着有机物的分解、腐殖质的合成和各种矿质元素的转化； (2)放线菌 土壤中放线菌的数量仅次于细菌．它们以分枝丝状营养体缠绕于有机物或土粒表面，并伸是于土壤孔隙中。1g土壤中的放线菌孢子可达107～108个．占土壤微生物总数的5％～30%．在有机物含量丰富和偏碱性土壤中这个比例更高。

实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养

实验报告 课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验 实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察 学生姓名：专业：环境工程学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点：实验日期：2018 年 10月16日 一、实验目的和要求 1.掌握微生物接种培养技术 2.掌握微生物分离纯化技术 3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。 二、实验内容和原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。 1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离 与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分 离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的 混入。 2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且 采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微 生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可 以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数 3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表 面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落 的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。用途一般多用于筛选菌株。一般用 于平板培养基的回收率计数。优点是可以计数，可以观察菌落特征。缺点是吸收量较少，较麻烦，平板不于燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度天的话，长不出单菌落。 4.稀释倒平板法：稀释倒平板法是将细菌与液态的培养基混合后倒入培养皿再冷却凝固，使样品中 的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，单个细胞及聚在一起 的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物 的数量。所以细菌在培养基的内部和表面都有,适合厌氧型微生物。 5.菌种保藏：菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征 和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一-般是选用它的休眠休，如孢 子;芽孢等等，并且要创造一一个低温;干燥; 缺氧;避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体 能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，

大学土壤微生物分离实验报告

从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定 实验报告 生物科学与技术系 09食品（2）班 姓名：xxx 学号：xxx

从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定 【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。 【关键词】细菌放线菌霉菌划线分离培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言： 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出 具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原 有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的： 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物分离、纯化培养，根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。实验原理： 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。通过如下几种方法可以分离纯化微生物：稀释倒平板法(pour plate method)、涂布平板法(spread plate method)、稀释摇管法(dilution shake culture method)、平板划线分离法（stesak plate method）。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细

土壤中微生物的分离纯化(电子版实验报告)

微生物实验报告 土壤中微生物的分离与纯化 指导教师：李海花 周四晚第四组 实验成员: 杜玉琪180112010009 董天涵180112010008 蒋怡菲180112010018 逄颖180112010035

【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和 纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化 【关键词】土壤、微生物、菌落观察、分离纯化 1.实验目的 （1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 （2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。 （3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。 2.实验原理 （1）培养基的配制与灭菌 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 （2）微生物的培养及鉴定 接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。 鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。 （3）平板分离与活菌计数 倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。 划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，菌种在平板上划线。通过划线将样品在平板上稀释，培养后能形成单独的菌落。平板计数法是将测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计并记录菌落数。 （4）细菌的分离与纯化 为了得到单一菌种，要对培养的菌分离和纯化。用接种环挑起培养基里少量菌在无菌条件下接种到新的培养基上，划线，继续进行培养，从而得到新的单一菌落。 3.实验器材 （1）器材： 培养皿、载玻片、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种

环境中微生物的检测和分离纯化

环境中微生物的检测和分离纯化 姓名：王韬 班级：生76 组号：7-2组 同组人：袁堂谧 实验日期：2009-11-12 一、实验目的： 1.熟悉常用微生物培养基配置方法。 2.联系无菌操作技术。 3.学习单菌落划线分离法。 4.通过实验认识环境中微生物的分布。 二、实验原理： 1.微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的 过程称微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧的条件要求不同，而供给他们适宜 的培养条件，或加入某些抑制剂造成一支其他菌生长而利于此菌生长的环境。 2.平板菌落计数法：平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分 分散成单个细菌，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长 繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品的一个单细胞。该计数法 最大的优点是可以获得活菌的信息。 三、实验材料： 土壤悬液（稀释100倍），未知菌菌落平板，无菌水，取液器，培养箱，培养皿，无菌涂棒，接种环，接种针，酒精灯。 四、实验步骤： (一)培养基的制备（提前准备）： 肉汤蛋白胨培养基： 牛肉膏2g 蛋白胨4g NaCl 2g 蒸馏水400mL 琼脂8g 1.称量：按上述配方称量各类物质。 2.溶解：在400mL水中溶解牛肉膏、蛋白胨和NaCl，混合加热溶解。 3.调pH值：调至7.2-7.4 4.过滤（本实验无需过滤） 5.加凝固剂：加入称量好的琼脂，混合均匀。 6.分装 7.包扎和灭菌 8.倒平板 (二)从土壤中分离微生物 1.采土样（已事先准备）：选择较肥沃的土壤，铲去表层土，挖5-20cm深度的或

人教版高中生物选修一2.2《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》word教案

专题2 微生物的培养与应用 课题2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一、【课题目标】 （一）知识与技能 利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数 （二）过程与方法 分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性 （三）情感、态度与价值观 形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯 二、【课题重点】 对土样的选取和选择培养基的配制 三、【课题难点】 对分解尿素的细菌的计数 四、【教学方法】 启发式教学 五、【教学工具】 多媒体课件 六、【教学过程】 （一）引入新课 上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。 （二）进行新课 1．基础知识 1．1 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2，这是因为细菌能合成脲酶。 1．2 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。 〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的的是尿素，琼脂的作用是凝固剂。 〖思考2〗该培养基对微生物具有（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是 只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。

1．3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。 【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。 公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量 1．4 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30～300 的平板进行计数。 〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数。 〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。 〖思考5〗第二位同学的结果接近真实值。你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。 1．5统计的菌落数比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数来表示。 1．6设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 1．7对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。 〖思考6〗请设计本实验的对照实验组： 方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。 方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。 2．实验设计 2．1 实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。 2．2 根据图示2－7填写以下实验流程： 2．3 土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。 2．4 分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为102、103、104。 2．5 培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。 2．6 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。 2．7菌落的特征包括形状、大小、隆起程度、颜色等方面。

【全国三卷地区适用】精品讲练含答案：选修一 微生物的筛选、鉴定、分离与计数

重点题型1 目标微生物的筛选与鉴定 1.分离微生物的原理与措施 (1)原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的细胞与其他细胞分离，再给细胞提供合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。 1

(2)常用措施 ①接种过程中尽量使细胞分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。 ②运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。 2.选择培养基四种常见制备方法或实例 2

【例证1】(2017·全国卷Ⅰ，37)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题： (1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_______________ ___________________________________________________________________， 但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_____________(答出两点即可)。 (2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_________________________________________________________________ ____________________________________________________________________。 3

土壤微生物的分离和纯化

土壤微生物的分离和纯化 一、实验目的 1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。 3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。 二、实验原理 土壤是微生物生长和栖息的良好基地。土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于培养细菌。链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。 三、实验器材 1、材料：10cm左右深层土壤。 2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基 3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚、无菌水。 四、实验步骤 1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。 2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释10－2的土壤悬液。然后进行十倍梯度稀释，依次制备10－ 3、10－ 4、10－ 5、10－ 6、10－7 稀释度的土壤稀释液。 3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。灭菌后分别倒3个平板。（高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素） 4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。细菌选用10－4、10－ 5、10－6 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2 、10－3、10－4三个稀释度，分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。（一个稀释度一个平板） 5、培养：细菌平板于37℃恒温培养1～2d，放线菌于30℃培养2～3d，霉菌于30℃培养3～5d ，观察。 6、计数：用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，报告细菌总数/(CFU·ml-1) 7、纯化：挑取典型菌落接种于相应平板，培养条件同上，培养纯化。 五、思考题

从土壤中分离微生物

从土壤中分离微生物 环境工程（1）班 一、试验目的 1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。 2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。 二、实验原理 土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。 三、实验器材 (—)培养基 肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌） 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌） 查氏培养基（培养霉菌） (二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。 (三)土壤样品、天平、称旦纸。 （四）恒温箱、气体流量计 四、试验程序 1、倒平板 将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板； 2、制备土壤稀释液 准确称取土样10g，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液

3、涂布 将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。再用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌玻璃涂棒，更换稀释度时需将玻璃涂棒灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换涂棒。 4、培养 在28℃条件下倒置培养3—5天。 5、挑菌落 将培养后生长出的单个菌落分别挑取少量细胞划线接种到平板上。28℃条件下培养3—5天后，再次挑单菌落划线并培养，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物，如果发现有杂菌，需要进一步分离、纯化，直到获得纯培养。 五、注意事项 1.制备混合液平板时，不要再注入培养基前让链霉素液与土壤稀释液相混。 2.制备混合液平板时，倾注的培养基温度不能太高，过高的温度会烫死微生物。 六、培养过程及革兰氏染色观察成果 1.培养24h后的情况：马铃薯葡萄糖培养基长出菌种，经判断为细菌，马铃薯蔗糖培养基长出菌种，为酵母菌。其他培养基没长菌种，拍照如下

分离自土壤的裸囊菌科真菌中国及大陆新记录种

分离自土壤的裸囊菌科真菌中国及大陆新记录种 总结得到一致树，用TreeView（Page 1996）查看。同时在软件MEGA 6中采用最大简约法（MP）和邻接法（NJ）经1 000 次bootstrap 验证构建系统发育树[22]。 2 结果与分析 2.1 形态描述 2.2 系统发育分析 构建的裸囊菌科三个主要类群的系统发育树（图4）明显表明，采用最大简约法、邻接法和贝叶斯推理法构建的系统发育树具有相似的拓扑结构。该系统树分为I、II、III和IV四支。分支I包含了9种14个小孢子菌菌株，其中本研究菌株布拉尔小孢子菌Microsporum boullardii MH57288（菌株号L19.3，干培养物HMAS 255405）与报道的菌株以82/87/0.89的支持率聚在一起;分支II包含弯奈尼兹皮菌Nannizzia incurvata，本研究菌株MH577289（菌株号K82.3，干培养物HMAS 255403）与其余三个弯奈尼兹皮菌以高支持率99/100/1聚在一起;分支III包含了5种9个小孢子菌Microsporum菌株，这些菌均分离自染病动物上;分支IV 包含了3种6个帕拉癣菌属Paraphyton菌株，其中本研究菌株MH577290（菌株号L6.7，干培养物HMAS 255404）与本种另外三个菌株以较好的支持率90/99/0.99聚在一起。因此，系统发育结果支持了本研究三个菌株的分类地位。 3 结论与讨论 裸囊菌科Arthrodermataceae常见类群主要是小孢子菌属Microsporum及其相关属帕拉癣菌属Paraphyton、奈尼兹皮菌属Nannizzia和毛癣菌属Trichophyton，具有亲土性、亲动物性和亲人性等特点，可引起人和动物发生头癣、体癣等感染病害[16]。有研究表明，

土壤微生物的分离与平板菌落计数

土壤微生物的分离与平板菌落计数实验二土壤微生物的分离与平板菌落计数 一、实验目的 (1)几种常用分离纯化微生物的基本操作技术 (2)掌握倒平板 (3)学习平板菌落计数的基本原理和方法 二.实验原理 微生物的分离与纯化是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。分离纯化微生物的常用方法有平板表面画线法、平板表面涂布法和琼脂培养基浇注法等，因为其方法简单、设备简单、分离效果好，所以一直被实验室普遍选用。 活菌计数的基本方法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。 三.实验器材 1.材料:土壤 2.培养基:牛肉膏蛋白胨培养基 3.仪器或其他用具:无菌培养皿，盛有9ml无菌水的试管，1ml移液器，玻璃涂布器，恒温培养箱 四.实验步骤 (一)采样 取表层以下5-10cm处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4 ?冰箱中暂存。

(二)倒平板(无菌操作) 培养基加热溶化，待冷至55-60? ，然后在无菌操作条件下倒入培养基于无菌培养皿中，并在各培养皿上作好标记。 (三)制备土壤稀释液(无菌操作) 1.制备土壤悬液 用电子天平称取 5g土于装有45ml无菌水的三角瓶中，振摇约20min,使土壤与水充分混匀 2.梯度稀释 取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管，以此类推制成10-1 、10-2、10-3等不同稀释度的土壤溶液。 (四)平板分离单菌落(无菌操作) 选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌的土壤悬液，在酒精灯旁进行划线操作，用左手控制培养皿，右手捏接种环，在标记处划3-4条连续的平行线作当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。将烧去残余菌样后的接种环在平板培养基边缘冷却以下，然后将培养基另一区转至划线位置，将接种环通过菌源区而移至现在的划线区，依次类推划上几次。然后烧去接种环上的残菌。最后平板倒置，恒温培养:细菌培养37?，1-2d;放线菌培养28?，5-7d;霉菌培养28?，3-5d。 (五)活菌计数 从10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各管中，分别吸出1ml菌液加至相应编号的平板表面上。用左手控制培养皿，并将皿盖开启一缝，右手拿涂布玻璃棒把培养皿上的一滴菌液轻轻涂开、均匀铺满整个平板，并防止平板培养基破损。最后平板倒置，恒温培养:细菌培养37?，1-2d;放线菌培养28?，5-7d;霉菌培养28?，3- 5d。

如何从土壤中分离出微生物

如何从土壤（污水）中分离出微生物 把污水加蒸馏水分别稀释10，100，1000倍，然后加入培养基中培养，如果培养出来菌落重合，菌非常多，无法分离，就加大稀释倍数，直至获得清晰可分离的菌落，有时甚至是非常小的菌落，要用倒置显微镜操作。而培养基则根据要分离的菌的营养类型进行配置，若要获得多种微生物就要配置多种培养基进行如上操作。对于土壤加水溶解，对溶解液进行如上操作，不溶的部分就不用管了 1.取以少许土壤（一地表以下10cm处为宜）与适量无菌水混匀备用 2.做浸出液的梯度稀释 3 .涂平板 4.划线分离 5.接平板，接斜面 6.检测 从土壤中分离微生物 环境工程（1）班 一、试验目的 1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。 2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。 二、实验原理土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑

是十分必要的。 三、实验器材 (—)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）高氏一号琼脂培养基（培养放线菌）查氏培养基（培养霉菌） (二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。 (三)土壤样品、天平、称旦纸。 （四）恒温箱、气体流量计 四、试验程序 1、倒平板将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板； 2、制备土壤稀释液准确称取土样10g，加入装有90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、等一系列稀释菌液 3、涂布将无菌平板编上10- 4、10- 5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(教案)

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ★课题目标 （一）知识与技能 利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数 （二）过程与方法 分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性 （三）情感、态度与价值观 形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯 ★课题重点 对土样的选取和选择培养基的配制 ★课题难点 对分解尿素的细菌的计数 ★教学方法 启发式教学 ★教学工具 多媒体课件 ★教学过程 （一）引入新课 上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。 （二）进行新课 1．基础知识 1．1 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2 ，这是因为细菌能合成脲酶。 1．2 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。 〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的的是尿素，琼脂的作用是凝固剂。 〖思考2〗该培养基对微生物具有（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。

1．3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。 【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。 公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量 1．4 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 的平板进行计数。 〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数。 〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。 〖思考5〗第二位同学的结果接近真实值。你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。 1．5统计的菌落数比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数来表示。 1．6设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 1．7对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。 〖思考6〗请设计本实验的对照实验组： 方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。 方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。 2．实验设计 2．1 实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。 2．2 根据图示2－7填写以下实验流程： 2．3 土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。2．4 分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为102、103、104。 2．5 培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。 2．6 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结

土壤真菌的分离

土壤真菌的分离 实验目的:掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法，从而获得真菌纯培养技能;了解基本接种技术。建立严格的无菌操作概念，掌握无菌操作技术。 实验原理:土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。真菌在土壤中的数量仅次于细菌和放线菌，主要在有机质丰富、透气性好的偏酸性土壤中较多。分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大，容易扩展，技术准确性较低。本实验采用加有链霉素(或氯霉素、庆大霉素)和孟加拉红的马丁氏培养基分离及计数土壤中的真菌。在此培养基上，放线菌和细菌被链霉素和孟加拉红所抑制，但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小，从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。实验器材和材料: (1) 器材:台秤、电子秤、烧杯、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、 移液管、移液枪、1mL无菌吸管、无菌培养皿、接种环。 (2) 材料:新鲜土样、无菌水、马丁-孟加拉红培养基。试验方法和步骤: 1. 培养基的制备 (1) 配方: 葡萄糖10.0g 、蛋白胨5.0g 、琼脂 20g 、KHPO24 1.0g、MgSO7,O 0.5g 、1/3000孟加拉红水溶液100mL、 ? 42 0.03?链霉素稀释液100mL、自来水800mL。 (2) 操作步骤: 1) 用搪瓷杯量取自来水500mL置小铝锅中，在电炉上加热。 2) 按配方分别称取各种药品，加入自来水中，边加边搅拌，然后 量取100mL1/3000孟加拉红水溶液加入。 3) 加入20g浸洗过的琼脂煮沸至溶化。 4) 总体积定容至900mL，无需调节pH值。

5) 趁热分装于18mm×180mm试管，每管15mL，塞好棉塞，贴 好标签，装入小铁丝筐，并用旧报纸将棉塞部分包好。 6) 高压蒸汽灭菌，121?灭菌30min。 注意: 1) 取国产链霉素1g/瓶，用无菌吸管吸入10mL无菌水溶解，得到 10%链霉素溶液。取0.3mL该溶液定容于100mL灭菌容量瓶即可 得到0.03%链霉素溶液。 2) 使用前，将上述培养基熔化冷却至55,60?，按每10mL培养 基加入1mL0.03%链霉素溶液，即可使每毫升培养基含30ug链 霉素。 2. 土壤稀释液的制备 -5用“稀释平板计数法”中的方法进行，将土样稀释至10。 称取土样10g放入盛90mL无菌水的三角瓶中，振摇约20分钟，使土与水充分混合，将菌分散。在无菌操作条件下，用1mL无菌移 -1液管吸取lmL10浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗三 -2-5次，摇匀即为10浓度菌液。同样方法，依次稀释到10。 注意:在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同的吸管。 3. 平板分离 (1)倒平板 将加入链霉素溶液的马丁氏培养基倒平板(方法:右手持盛培养基的试管或三角瓶，左手拿平皿并松动棉塞，用小指和无名指夹住拔出，试管(瓶)口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开少许，迅速注入培养基约15mL左右，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板)。 (2)涂布