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生物工艺学实验

实验一实验一 淀粉水解糖含量测定淀粉水解糖含量测定淀粉水解糖含量测定

一. 目的和要求

1. 掌握工业生产中使用淀粉制葡萄糖的基本原理。

2. 学习和掌握淀粉水解的工艺流程及其测定方法。 二. 基本原理

淀粉是由数目众多的脱水葡萄糖单位(C 6H 10O 5)n ,经由糖苷键缩合而成的多糖。由淀粉质原料生产葡萄糖,很早以来人们就采用无机酸(通常用盐酸)为催化剂,在高温条件下使淀粉发生水解反应,转变为葡萄糖。葡萄糖醛基在碱性溶液中可使高价铜还原成低价铜。当高价铜量固定时,被样品中葡萄糖还原后,剩下的高价铜可用标准葡萄糖溶液滴定借以定量样品中的葡萄糖(实际为还原糖总和)。

1. 水解:淀粉包括淀粉、戊糖、半纤维素(主要指多聚戊糖)用盐酸加水分解转化成还原糖。

HCl

(C 6H 10O 5)n + nH 2O nC 6H 12O 6

2. 中和:将余酸中和至pH6~7,在碱性溶液中糖会分解,影响分析结果。

3. 当斐林氏甲、乙液混合时,生成氢氧化铜沉淀。

CuSO 4 + 2NaOH NaSO 4 + Cu(OH)2

氢氧化铜再与酒石酸钠作用

COONa COONa

HC-OH HC-O

+ Cu(OH)2 Cu + 2H 2O

HC-OH HC-O

COOK COOK

糖液滴入后铜盐被还原成红色氧化亚铜沉淀

CHO COONa COOH COONa

(CHOH)4 HCO (CHOH)4 HCOH

+2 Cu + 2H2O +2 +Cu2O

CH2OH HCO CH2OH HCOH

COOK COOK

Cu2O+ K4Fe(CN)6+ H2O K2Cu2Fe(CN)6 + 2KOH

CHO

(CHOH)4 + + H2O

(CH3)2+(CH3)2Cl-

CH2OH 氧化型(蓝色)

CHO

(CHOH)4+ + HCl

(CH3)23)2

CH2OH 还原型(无色)

斐林氏溶液全部被还原后,滴入的糖液便与次甲基兰指示剂作用,将其还原成无色化合物而达终点,为了加速反应,在斐林氏溶液中加入黄血盐,使反应生成氧化铜红色沉淀变成可溶解状态,加速反应,并使终点由原来的蓝色转红色变为淡黄色,便于辨认。

此法受操作条件影响很大,如温度高低,沸腾时间长短,pH高低等等。为了得到较准确的结果,必须保持操作尽量相对统一。另外,为避免酒石酸钾钠在强碱溶液中还原铜,影响结果,甲乙液必须现用现混。

三.试剂

1.斐林氏A液:CuSO4·5H2O 35g ,次甲基兰0.05 g溶解后定容至1000毫升。

2.斐林氏B液:酒石酸钾钠117 g ,氢氧化钠126.4 g ,亚铁氰化钾9.4 g ,各自溶解后定容至1000毫升。

3.0.1%标准葡萄糖溶液:于100~105 o C烘干恒重而无水葡萄糖称取1000毫克加水溶解,并加5毫升浓盐酸防腐,定容至1000毫升。

此溶液使用期间如发现混浊应重新配制。

四.测定方法

1.称取1.000克样品(湿淀粉1.500克),置于250毫升三角瓶中加100毫升水,20%盐酸10毫升,瓶口装一长玻璃管作为回流冷凝

用,在水浴上加热3小时取出放冷,滴酚酞指示剂,用1N NaOH

中和至淡红色,移入250毫升容量瓶中定容。

2.预备滴定:各取甲、乙斐林氏溶液4毫升于三角瓶中混匀加热至沸腾,滴加0.1%标准葡萄糖溶液至蓝色消失,记下体积数。

3.空白滴定:各取甲、乙斐林氏溶液4毫升于三角瓶中混匀,加入比预备滴定少1毫升的标准葡萄糖溶液,加热沸腾后,继续用标

准葡萄糖溶液滴定至终点。

4.样品滴定:各取甲、乙斐林氏溶液4毫升于三角瓶中混匀,加入5毫升转化后的样品溶液,用空白滴定的方法滴至终点。

五.计算方法

(V1—V2)×0.1×0.9 (V1—V2)×4.5 淀粉(%)= =

W W

×5

250

式中:V1—空白滴定耗去标准葡萄糖溶液的毫升数

V2—样品滴定耗去标准葡萄糖溶液的毫升数

W—样品重量

0.9—葡萄糖折成淀粉的换算系数

六.思考题

1.缩小测定误差的关键是什么?

2.除了利用酸水解葡萄糖外,还有那些常用水解葡萄糖的常用方法?

实验二实验二 谷氨酸发酵液中谷氨酸含量测定谷氨酸发酵液中谷氨酸含量测定谷氨酸发酵液中谷氨酸含量测定

一. 目的和要求

1.了解瓦氏呼吸计的结构以及在工业生产、科学研究上的应用。 2.学习与掌握瓦氏呼吸计的操作技术。 二. 基本原理

瓦氏呼吸计广泛地应用在呼吸作用,光合作用,酶的活性测定等方面的研究中。其基本原理是在一密闭的一定温度体积的系统中进行样品中气体变化的测定。当气体被吸收时,气体分子减少,则压力降低。相反,当产生气体时,则压力上升。此压力的变化,可以在测压计上表现出来。由此,可计算产生气体或吸收气体的数量。

L —谷氨酸脱羧酶专一地催化L —谷氨酸脱羧,释放出CO 2,每分子L —谷氨酸产生一分子CO 2,用瓦氏呼吸计测得释放出的CO 2量,即可求得L —谷氨酸的量。

COOH COOH

CH 2 CH 2 L —谷氨酸脱羧酶

CH 2 CH 2 + CO 2 37 o C pH 4.8~5.0

CHNH 2 CH 2NH 2

COOH

本实验所用L —谷氨酸脱羧酶为大肠杆菌丙酮粉。 三. 材料及试剂

(一) 大肠杆菌丙酮粉。

1.将活化的大肠杆菌由试管斜面培养基接种到10只200毫升茄形瓶培养基上,于37 o C 培养16~18小时,培养基的配方如下:蛋白胨10g ,牛肉膏浓缩液5g ,NaCl5g ,琼脂20g ,溶解后混合,用蒸馏水定容至1000毫升。

2.于每一茄形瓶中加入少量0.9%NaCl 溶液,洗下菌体(可洗二次),菌体悬液离心(2500 rpm ),弃去上清液沉淀(菌体)悬浮于少量盐水中,置冰箱中冷却。

3.向已冷却的菌体悬液中加入10倍体积的冷丙酮(-10 o C )加毕,剧烈搅拌10分钟。静置,待菌体沉淀后,倾去上清液,菌体用布氏漏斗抽滤。并用冷丙酮洗菌体一次。滤渣置真空干燥器内减压干燥。所得大肠杆菌丙酮粉装于密封瓶内。冰箱保存,数月内有效。

(二) pH5.0 3M 醋酸缓冲液,先配制A 、B 液。

A 液:称取NaAc ·3H 2O 40.8g 溶于蒸馏水稀释至100ml 。

B液:12gHAc加蒸馏水100ml。

将A、B两溶液按7∶3(V/V)混合即得。使用时最好用pH 计校正。

(三)pH5.0 0.5M醋酸缓冲液。

用pH5.0 3M醋酸缓冲液稀释制得。稀释后也需要用pH计校正。

(四)大肠杆菌悬液。

用pH5.0 0.5M醋酸缓冲液配成2%大肠杆菌丙酮粉悬液。

(五)L—谷氨酸被测样。

(六)布洛的(Brodic)氏溶液。

称取NaCl 23g及牛胆酸钠5g,溶于蒸馏水并稀释至500ml,再加伊凡兰0.2g及麝香草酚溶液数滴。此溶液比重应为1.033,如

偏低可加NaCL调节,偏高可加蒸馏水调节。

四. 操作方法

1.将三套已知瓶常数的测压计的编号填入下表,取下反应瓶,按下表加

入试剂。

2.测压管下端贮液器装一小段乳胶管,管的另一段用一小段玻棒塞住,

测压计注入适量布洛的氏溶液。

3.反应瓶侧臂玻璃和测压管磨口外均涂一薄层真空活塞油,将侧臂塞

好,再将反应瓶与测压管相接,侧臂玻塞及反应瓶与测压管连接处皆

不得漏气,并用橡皮筋勾住,使测压管与大气相通。

4.将测压计固定于振荡器上,并使测压计下端的乳胶管在螺转夹中,反

应瓶浸在37o C恒温水浴中,保温振荡10分钟,关闭三通活塞,调节

螺转夹,使左右两侧测压管中布洛的氏液高度不同(左侧开口端液面

约在260mm处),记下液面高度。6~10分钟后,检查液面是否有变

化。如无变化,表示测压计不漏气。

5.确认测压计不漏气后,转动三通活塞使与大气相通,调节液面在

260mm处。振荡5分钟与外界平衡,关闭三通活塞,调节螺旋夹,

使右侧(闭管)管内液面在150处(参比点),振荡5分钟记下左侧

(开口端)管内液面高度,此为反应前读数。

6.将测压管取下,用食指按住测压计开口端,将反应瓶侧臂中的酶液倾

入反应瓶,立即将测压计装到恒温振荡器上,保温振荡。

7.10分钟后,停止振荡,用螺旋夹将闭管液面调至150mm记录开口端

液面高度。再保温振荡10分钟,再读数,直至读数不变(一般需要

20~30分钟),最后所得即为反应后的读数。

8.将反应前、后读数之差乘以瓶常数,即释放出的CO2量(ul),每22.4ul

CO2,相当于1 umol L—谷氨酸。

9.由于恒温水浴温度可有细微变化,还需用温度计校正(校正管)。如

温度计读数有变化,即表示温度有细微变化。如测压计液面升高

2mm,需将测压管读数减去2mm,反之加2mm。余类推。

反应瓶读数

编号项目

3M HAc 样品蒸馏水反应瓶侧臂

酶液

标准管0.2ml 0.1~0.2ml 1.9~1.8ml 0.3ml

测压管0.2ml 0.1~0.2ml 1.9~1.8ml 0.3ml

校正管0.2ml 0 2.0ml 0.3ml 将测定各数据填入下表。

瓶号瓶常数

(K G)反应前读

(mm)

反应后读

(mm)

液面差h

(mm)

L—谷氨酸

(mg/ml)

校正管读

(mm)

h=反应后读数-反应前读数±校正值

五. 计算方法

K×h×147,130

L—谷氨酸(mg/ml)样品= ×n

22,400,000×V

h

= K G××n

V

式中:

K—瓶常数(ul/mm)

h—反应前、后两读数之差(mm)

n—样品稀释倍数

147,130—谷氨酸毫摩尔分子量

K G—谷氨酸瓶常数(mg/mm)

V—样品量(ml)

22,400,000—1mol气体标准状况下微升数

六. 思考题

1.影响实验结果的主要因素有哪几点?

2.影响反应瓶常数的主要物理因素是什么?

实验三实验三 氨基酸发酵及发酵条件试验氨基酸发酵及发酵条件试验氨基酸发酵及发酵条件试验

一. 目的要求

1.掌握发酵条件的控制对代谢产物的影响及摇瓶发酵操作技

术。

2.学习发酵过程中各参数的测定方法。

二. 材料与器材

1.摇床,721分光光度计,精密试纸,定糖器材一套。 2.肉汤斜面培养基,摇瓶培养基(详见下述方法) 3.黄色短杆菌(谷氨酸产生菌)ATCC14067

三. 基本原理概述

葡萄糖在谷氨酸产生菌的各种酶系作用下,经已糖酵解,单磷酸已糖,三羧酸循环,乙醛酸循环等途径,根据发酵条件的影响,既可产生谷氨酸也可在谷氨酰胺合成酶的作用下转向生成谷氨酰胺。

四. 方法步骤

(一) 基本培养条件和方法 1.斜面种子培养基组成

葡萄糖 0.1% 蛋白胨 1% 牛肉膏 1% 氯化钠 0.5%

琼脂 2% 调节pH=7.0 用自来水配制,115o C 灭菌15分钟制成斜面接种,32o C ±0.5o C ,培养箱内培养18小时,待用。

2.发酵培养基组成(发酵液)

葡萄糖 铵盐 玉米浆 磷酸氢二钾 磷酸二氢

钾 硫酸亚铁 硫酸锰 硫酸镁 硫酸锌 维生素B 1 碳酸钙 3.发酵条件

500毫升三角烧瓶装发酵液30毫升,接种量为一环,发

酵培养基的初始pH 调节至7.2~7.4,接种后,置于往复式摇床机(振幅7cm ,频率130次/分),32O C ±0.5O C 发酵42小时。

(二) 谷氨酰胺发酵条件试验

1.谷氨酰胺发酵最适玉米浆(生物素)量的试验

a . 发酵基础培养基配制

葡萄糖 11% 硫酸铵 6% 磷酸氢二钾0.05%

磷酸二氢钾 0.05% 硫酸亚铁1mg% 硫酸锰 0.002%

硫酸镁 0.05% 硫酸锌 10mg/L 维生素B 1 100γ/L 碳酸钙 5%

b.条件试验(同上述发酵条件)

在上述发酵基础培养基中,分别加入0.4%、1.2%、

2.4%玉米浆,进行发酵试验。

2.不同类铵盐对谷氨酰胺发酵的影响(Cl-的影响)

a.发酵基础培养基配制

葡萄糖11% 磷酸氢二钾0.05% 磷酸二氢钾

0.05%

硫酸亚铁1mg% 硫酸锰0.002% 硫酸镁0.05%

硫酸锌10mg/L 维生素B1 100γ/L 玉米浆1.2%

碳酸钙5%

b.试验条件(同上述发酵条件)

在上述发酵基础培养基中,分别加入4%NH4Cl和5%(NH4)2SO4 。

(三) 试验结果测定

在各个发酵期测定pH值,OD.,RG(残糖),产物及副产物。

1.PH:用精密pH试纸测定。

2.OD.(光密度)

取0.25毫升发酵液加4.75毫升1N HCl,摇匀后测定610nm

的OD值,如样品液菌体数量太多,可再加入1N HCl后

稀释。

3.RG(残糖,见定糖实验)。

五.实验结果

1.谷氨酰胺发酵适合玉米浆量的试验。

PH(h)OD(h)RG(h)Gln(%)玉米浆量

(%)

12 24 36 12 16 20 24 36 24 36 42 24 36 42

0.4

1.2

2.4

六.思考题

氨基酸发酵过程中有哪些主要参数?它们是如何测定的?

实验四实验四 发酵液中谷氨酰胺的分析发酵液中谷氨酰胺的分析发酵液中谷氨酰胺的分析

一.实验目的

学会用纸层析法定性和半定量分析发酵液中氨基酸的方法。

二.基本原理

纸层析展开剂由水和有机溶剂组成,层析时,水是静止相,滤纸是静止相的支持物,有机溶剂是流动相,将样品点于滤纸原点,展层时,样品中的

各种溶质在两相中不断进行分配,由于它们的分配系数不同

固定相中的溶质量

(K= ),因而它们的移动速率不同,从而达

流动相中的溶质量

到分离的目的。 三. 材和试剂

层析缸、层析滤纸、微量进样器(10ul )、电吹风、喷雾器、展开

剂(体积比为 苯酚∶水 = 4∶1)、显色剂(0.5%茚三酮乙醇溶液)。

四. 操作步骤

1.点样:取25×25cm 新华1号滤纸,在距底边3cm 处用铅笔划直

线,样品点距为2cm ,发酵液及标准溶液点样1ul ,每1ul 样品液分3次以上点完,每次待干后再点,并在适当位置点上标准液。 2.展开:将点好的滤纸卷成筒形,用细铜丝连起来,点样面朝外,

放入层析缸中盛有展开剂的玻璃皿里展开,待溶剂至距滤纸顶端4cm 取出(需12小时左右)。

3.干燥显色:用电吹风吹干滤纸,用0.5%茚三酮乙醇溶液喷雾在滤

纸上,放入70o C 烘箱内显色。

4.定性、半定量:计算斑点的R f 值,与标准品对照确定其是何种氨

基酸,观察显色斑点大小与颜色深浅,与标准色斑比较,进行半定量,写出结果。 5. 五. 思考题

1.从本次实验结果看,谷氨酰胺发酵培养基的最佳组成是怎样的? 2.合适的发酵周期是多少?

实验五实验五 离交法分离提取谷氨酸离交法分离提取谷氨酸离交法分离提取谷氨酸

一. 目的要求

学习阳离子交换树脂分离提取发酵液中氨基酸的操作方法和基本原理。 二. 基本原理

各种氨基酸分子的结构不同,在同一pH 时与离子交换树脂的亲

和力有差异。因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱下来,达到分离的效果。 三. 器材

1.层析管(柱):3.0×3.0cm 一套; 2.试管:40支(包括试管架); 3.精密pH 试纸; 4.分光光度计。 四. 试剂与材料

1.强酸型阳离子树脂(732型); 2.2 M 盐酸溶液; 3.2 M 氢氧化钠溶液; 4.谷氨酸发酵液;

5.0.5%茚三酮乙醇溶液; 6.4.0% NaOH 液 五. 操作发法

1.层析柱的准备

将干的732树脂(钠型)水浸过夜或搅拌2小时,使充分溶胀,再用4倍体积的2M 盐酸浸泡1小时或搅拌0.5小时,倾去清液,洗至中性,再用2 M 氢氧化钠溶液处理作法同上,再重复一次酸碱处理。最后使成为氢型,洗至近中性待用,用蒸馏水装入层析柱(约2/3高度),然后将处理好的树脂边倒入边搅拌,使树脂逐渐均匀地沉积在管内。装至离顶端14cm 处,并使树脂不脱水。最后用水冲洗5分钟,检查树脂柱有否断裂、孔隙、气泡,而走短路(注意:防止干柱)。

2.发酵液的处理

离心除去菌体等固形物,用水稀释至含量在2.5%左右,用稀HCl 调pH 至5~5.5待用。 3.上柱交换

将处理过的发酵液用高位引入层析柱,此时应将流束控制在25滴/分钟左右,并对流出液体作pH 检查和茚三酮反应,检查如有反应应立即停止加样。发酵液加完后,用蒸馏水冲洗交换柱至流出液清澈即可(注意:防止冲洗过量造成pH 上升,以至谷氨酸流失)。 4.洗脱

用4%氢氧化钠液引入柱内,流速控制在20~25滴/分,并严格检查流出液pH 值,当pH 达到2以上时立即开始用试管收集(试管

编号),每管收40滴,并记下每管pH值,直至pH值达11以上为止(约40管),待用。

5.谷氨酸的洗脱曲线制作

在收集管中各取0.5~1 ml与另外试管,然后加入10滴茚三酮乙醇溶液,浓度高时可适当稀释,放入65o C水浴中保温15分钟,冷却至室温,加入 5 ml蒸馏水,以收集管第二管为对照管,测定670nm波长的光吸收值。以每管光吸收值和每管pH值为纵坐标,以收集管管号为横坐标,绘制洗脱曲线。

6.树脂的再生

用500ml左右的水洗,然后用2 M HCl处理再生(略)。六. 思考题

1.谷氨酸洗脱峰的pH值应该是多少?为什么?

2.依据本次实验的柱量,计算上柱量?酸碱用量?

实验六糖化曲的制备及测定

一、目的要求

(1) 掌握糖化曲的制备过程

(2) 掌握糖化力的测定方法

二、材料

(1) 恒温恒湿箱,电热干燥箱,电炉

(2) 架盘药物天平,滴定管,磁板,三角瓶,试管,烧杯,石棉网(3) 斐林氏液,甲基兰,葡萄糖,可溶性淀粉,碘液

(4) 菌种(东酒一号)

三、方法步骤

(一)糖化曲的制备

1、培养基的制备

(1) 斜面培养基(学生了解制备过程即可)

a.制取15~16°Bx的米曲汁

b.取麸皮一份,水六份搅拌均匀后于电炉上煮沸半小时,用纱布过滤,

取滤液备用。

c.取米曲汁加麸皮滤液,使浓度为13°Bx,再加2%琼脂,融化后分装

试管。115℃灭菌30分钟,取出制斜面。

(2) 三角瓶种曲培养基

取麸皮10g,加水12-13g充分搅匀,120℃灭菌60分钟。分装入250ml 三角瓶中。每瓶装5g左右,塞好棉塞,用牛皮纸包好后,120℃灭菌45分钟,冷却备用。

(3) 三角瓶麸曲培养

取麸皮20克加30g水充分搅匀,分装两只500ml三角瓶,120℃灭菌60分钟。

2、接种与培养

(1) 斜面菌种培养:30℃恒温培养5天

(2) 三角瓶种曲培养:用接种环将斜面菌种接入麸皮培养基上,接种量为一、二环,充分摇匀后置于30℃恒温箱中培养,在8小时以前堆积培养,8小时后摊平,待18~22小时后表面长满菌丝,结成块状时“扣并”(使结块翻身)。继续培养4-5天,待完全长满孢子时,即为成熟的种曲。(3) 三角瓶麸曲培养,按0.5%的接种量,把上述种曲接到麸曲培养基上,充分摇匀,置于30℃恒温恒湿箱中培养,具体操作与种曲操作相同,待培养32小时长满菌丝即可。

(二)液化力的测定

1、样品的制备:把上述已培养好的麸曲称取相当5g的孢子曲,放入烧杯中,加90ml水和醋酸——醋酸钠缓冲液。在30℃浸泡1小时,浸泡时应经常搅拌,用脱脂棉花过滤,取滤液备用。

2、液化力测定:于大试管内加10ml 12%可溶性淀粉液,水35ml 摇匀,在30℃水浴锅中保温10分钟(以试管内液温达到30℃为准),添加上述制取的酶液5ml,记下加酶液的时间,以后每隔1分钟取出1滴置

于白磁板上,与一滴稀碘液混合,当碘液不变色时即为终点。

(三)糖化力测定

1、于大试管A中加25ml 12%可溶性淀粉液和20ml水

2、于大试管B中加45ml水

3、将A、B管置于30℃水浴锅中保温10分钟(以管内液温达到30℃为准),然后分别加入酶液5ml,在30℃下糖化1小时,届时迅速吸取糖化液5ml,用取代法定糖。

(四)取代法定糖(参考水解糖含量测定实验)

1、预备滴定:吸取斐林氏甲、乙液各5ml放入250 ml三角瓶中,加水25 ml,加糖化液5 ml,混合后在电炉上加热后沸腾以滴定管逐渐滴入0.25%葡萄糖液,滴定时应保持试液沸腾。待试液兰色即将消失时,滴加1-2滴甲基兰指示剂,试验液变成兰色,再缓慢地滴入葡萄糖液至兰色完全消失,试液呈鲜红色时为止,记录所消耗葡萄糖液的量,整个滴定操作限于在4分钟内完成。

2、正式滴定

取斐林氏液甲、乙液各5ml于250 ml三角瓶中,加水25 ml加糖化液5 ml,混匀后,用滴定管加入葡萄糖液其量比预备滴定时所消耗的少1毫升。在电炉上加热至沸腾加1-2滴甲基兰指示剂,保持沸腾2分钟。再滴入葡萄糖液,但需4~5秒钟1滴的速度滴定至兰色完全消失。试液呈鲜红色时为止。整个滴定操作应在1分钟内完成,滴定时应保持试验液沸腾状态,记录所消耗葡萄糖液的量。

(五)计算

(B-A)×25×50

糖化力≈=(B-A)×100

0.25×5

式中:

A——A管内糖化液5 ml所消耗0.25%糖的毫升数。

B——B管内糖化液5 ml所消耗0.25%糖的毫升数。

2.5——每ml 0.25%葡萄糖液含的葡萄糖毫克数。

0.25——5 ml酶液相当于0.25克绝干曲。

糖化力单位:1克绝干曲在30℃糖化1小时产生的葡萄糖毫克数。

四、实验结果

1、样品的糖化力单位为多少?

2、两次滴定值相差多少?(实验记录数据)

五、思考题

1、在测定前需将样品用醋酸——醋酸钠缓冲液浸泡这是什么作用?

2、前面液化不彻底,是否会影响到后面的糖化能力?

实验七酒精发酵试验及测定

一、 目的要求

1、通过实验进一步理解糖的无氧酵解途径

2、掌握测定酒精发酵力的方法

二、 材料

1、蒸馏烧瓶,冷凝管,容量瓶,量筒,电炉

2、酒精表0-12%,温度计0-50 ℃

3、酵母菌,淀粉酶

三、 基本原理概况

在无氧的培养条件下,酵母菌利用已糖发酵为酒精和二氧化碳的作用,称为酒精发酵,它的总反应式为:C6H12O6→2C2H5OH+2CO2。在酿造工业中,由于酵母的种类不同,对碳源的利用也有差异,酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。因此测定发酵过程中生成的二氧化碳的量及最终产物酒精的量,可以来测定酵母的发酵能力。

四、 方法步骤

(一) 酒母的培养

1、培养基的制备

(1) 试管斜面培养基

将浓度为13 °Bx的麦芽汁100 ml,加入2%琼脂,融化后分装试管。

0.1MPa灭菌30分钟。

(2) 液体试管培养基:将浓度为13°Bx麦芽汁8ml,分装于试管中,0.1MPa灭菌30分钟。

(3) 三角瓶扩大培养基:将浓度为13°Bx麦芽汁80ml分装三角瓶中,以8N硫酸调节PH值至4.1~4.5,0.1MPa灭菌30分钟。

2、接种与扩大培养

(1) 将酵母菌移接于试管斜面,28~30℃培养48小时。

(2) 将上述培养好的斜面,接一环于液体试管中,30℃培养24小时。(3) 将上述液体酵母接种于三角瓶中扩大培养,28~30℃培养20~24小时。

3、酒母质量检查

镜检时要求形态整齐,细胞内原生质稠密,无空泡,无杂菌。细胞数0.8~1.0亿/ml,出芽率17~20%,死亡率小于2%。

(二) 淀粉的液化与糖化

1、以1:35的山芋粉和水的比例,用70~80℃的温水调粉浆1000ml,加淀粉酶0.1%(调匀后浆液温度应高于65℃)于电炉上加热至90~100℃,保持5~10分钟,继续加热煮沸1小时,使其充分液化,并补充水分。

2、将上述液化醪冷却至60~62℃,加入10%麸曲糖化30分钟后,分装三角瓶,每瓶装糖化醪400毫升。

3、糖化醪质量检查,要求糖度15~17°Bx,还原糖4~6%酸度2-3°。(三) 发酵

将培养成熟的酒母以无菌操作接入到盛有400ml糖化醪的瓶中,30℃

培养68~72小时。

(四) 生成二氧化碳产生量(即失重量)

1、培养前,揩干三角瓶外壁,置于1/100G的受皿天平上称重,记下

重量为W1。

2、培养完毕后,取出三角瓶轻轻摇动,使二氧化碳尽量逸出。在同一架受皿天平上再称重,记下重量为W2。

3、二氧化碳

重量=W1-W2

(五) 酒精度的测定

1、首先按图2装好蒸馏装置

2、准确量取100ml发酵液于500ml蒸馏瓶中,同时加入等量的蒸馏水,连接好冷凝器,勿使漏气,用电炉加热,馏出液收集于100ml容量瓶中。待馏出液达到刻度时,立即取出量并摇匀,然后倒入100ml量筒中,以酒精表与温度计同时插入量筒。测定酒精度和温度。

五、 实验结果处理

1、绘制发酵速率曲线,以产生CO2的量为纵坐标,发酵时间为横坐

标。

2、CO2生成量g

3、蒸馏液的酒精度为度,温度为℃

经换算成20℃的酒精度为度

六、 思考题

1、酒精发酵为什么要在无氧条件下进行?

2、当酒精发酵终了时,发酵液的PH值有什么变化?为何?

实验八柠檬酸发酵

一、 目的要求:

(1) 了解柠檬酸发酵过程;

(2) 掌握柠檬酸发酵的条件控制。

二、 基本原理:

黑曲霉可以由糖类、乙醇、醋酸等发酵产生柠檬酸,这是一个非常复杂的生理生化过程。柠檬酸是经过EMP途径、丙酮酸羧化和三羧酸循环形成的。

三、 材料与仪器:

黑曲霉柠檬酸生产菌、薯类淀粉、尿素、三角瓶、台称、接种环、滤纸、灭菌锅、培养箱。

四、 操作步骤:

菌种斜面培养基:4波美麦芽汁,2%琼脂斜面,33℃培养5-6天。

发酵培养基:15g薯类淀粉,19ml水,13ml(含0.06g尿素)水。

在250ml三角瓶中,准确称入15g薯类淀粉渣(粒径约2-4mm),加入19ml水,拌匀,瓶口扎上双面绒布与牛皮纸,在1公斤/厘米2蒸汽压灭菌40分钟,待瓶料冷却后,加入无菌水13ml(含尿素0.06g),拌匀,接入生酸菌(无菌室接种),摇匀,在33℃培养室培养72小时,加入123ml 沸水,浸取1小时(其间间歇搅拌,拌碎曲料)用滤纸过滤,测定滤液中柠檬酸的百分比酸度,再以料:浸水=1:10计算料的生酸率。

五、 思考题:

1、为什么在加沸水浸取时要拌碎曲料?

2、发酵培养基在补水时为什么水中要含0.06g尿素?尿素为什么不

在灭菌前加入?

实验九柠檬酸的测定

一、 目的要求:

1、掌握柠檬酸测定的基本原理、方法。

2、了解柠檬酸测定过程及注意点。

二、 基本原理:

柠檬酸在醋酐存在下,与吡啶生成黄色,从而利用比色法测定曲中或成品中柠檬酸含量。

三、 试剂与仪器:

试剂柠檬酸、醋酐(化学纯)、吡啶(化学纯)

72型或724型分光光度计。

四、 操作:

1、柠檬酸标准曲线制备:

a、精确称取105℃烘至恒重的柠檬酸1克,定溶于1000ml容量瓶。分别吸取1,2,3,4,5ml于各试管中,用蒸馏水稀释至10毫升,摇均匀。

b、从1中各管分别吸取1毫升至5只比色管中。

c、空白吸取蒸馏水1毫升入比色管。

2、样品制备:

a、柠檬酸钙样品制备:

精确称取105℃烘至恒重的柠檬酸钙样品0.25克(精确至0.0001克),溶解于10毫升6N盐酸中,再用蒸馏水洗至500毫升容量瓶,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,吸取1毫升入比色管。

b、曲样品制备:

精确称取25克曲,加100毫升热水浸取1小时,用滤纸过滤,吸1毫升滤液定溶于100毫升容量瓶,摇匀,吸1毫升到比色管。

3、测定:

在标准柠檬酸比色管与样品比色管中加入1.3毫升吡啶,摇匀,再加5.7毫升醋酐,塞上塞子振荡摇匀,放入32℃水浴中,保温30分钟,取出在420nm分光光度计测定,记下光密度读数,作标准柠檬酸曲线,再从曲线上查得样品柠檬酸含量(F)。

五、 计算方法:

柠檬酸钙样品中柠檬酸百分含量= F×500 ×%

W1

曲中柠檬酸百分含量= F×(100+W2×G%)×100 ×%

W2×(100%-G%)

W1 = 烘至恒重柠檬酸钙重

W2 = 曲重

六、 思考题:

1、柠檬酸醋酐-吡啶法测定的基本原理?

2、为什么柠檬酸测定中曲样品制作时要用热水浸泡?

3、曲中柠檬酸的测定计算方法?

实验十紫外线诱变育种

一、 目的要求

1、掌握紫外线诱变育种的原理。

2、掌握紫外线诱变育种的方法。

二、 材料

1、15瓦紫外线灯,电磁搅拌器,电动离心机。

2、培养皿,吸管,试管,漏斗,三角瓶,玻璃珠离心管。

3、诱变出发菌株。

三、 方法步骤

(一) 杀菌曲线的制作(计算致死率)

由于不同菌种对紫外线的敏感性不同,因此在进行诱变处理前,要事先制作紫外线杀菌曲线,即一定紫外线灯功率与被处理样品间隔一定的距离。测定不同时间的致死率。

1、融化固体培养基制平板

2、取已经24小时肉汤培养的新鲜菌液10ml,离心,菌体用生理盐水洗几次再定容至10ml,加入盛有玻璃珠的100 ml三角瓶中,充分摇动15分钟,使菌体均匀分散。

3、用稀释法计数,使每毫升达20~30个菌落数的浓度,取1毫升于培养皿中。

4、在黑暗条件下进行紫外线照射处理。

5、照射处理前,先开紫外线灯20分钟,使灯的功率稳定(如灯的功率为15瓦,则照射距离为15~30厘米,30瓦,则照射距离为30~50厘米)。

6、将待处理的菌悬液培养皿,置于电磁搅拌器上,放在紫外线中下方,先将整个平皿照射1分钟后,打开皿盖开始记时并启动电磁搅拌器,准确计算照射时间。

7、取样浇平板:经过一定时间照射处理后(按下表时间)取样适当稀释后,每皿加入0.1毫升,涂布后用黑纸包好,置于30℃恒温培养24~48小时,计数菌落。

(二) 紫外线照射诱变应用,抗性突变株的筛选

1、以上述曲线选择存活率在20%以下的稀释菌液,取0.1 ml涂布于药物的平板上。置于30℃恒温培养48小时计数抗性菌落数。

2、计算正变异率

正变异率=

抗性菌落数

×%原存活数

四、 实验结果

1、紫外线照射处理后的存活数。

处理时间菌落数稀释度对照

5’ 10’ 15’ 20’ 25’ 30’

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

2、紫外线照射处理后的存活率

存活率%

五、 思考题

1、紫外线诱变处理为什么要在暗室中进行?

2、紫外线的诱变机理是什么?

3、为什么要用生理盐水洗涤?

实验十一NTG诱变育种

一、 目的要求

1、掌握化学诱变剂进行诱变育种的原理。

2、掌握化学诱变剂进行诱变育种的基本方法。

3、了解诱变育种的器皿后处理。

二、 烷化剂诱变机理

使DNA中鸟嘌呤受到烷化作用,形成7-烷基鸟嘌呤。复制时烷化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对(正常鸟嘌呤与胞嘧啶配对),从而导致突变。

烷化复制复制

G :C ———→7-烷G :C ———→7-烷G :T ———→A :T

三、 材料和试剂

1、诱变剂NTG,碱液,生理盐水及培养基所需的全部试剂。

2、培养皿,吸管,漏斗,三角瓶,玻璃珠,离心管,离心机。

3、诱变出发菌株。

四、 培养基

1、种子培养基:葡萄糖2%,牛肉膏1%,蛋白胨1%,NaCl 0.5% PH

7.0;

2、空白平板培养基:葡萄糖1%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,

Mn 2PPm,Zn 2PPm,Fe 2PPm,尿素0.2%,V B1100r/l,生物素100r/l,琼脂2%,PH 7.0。

3、抗性平板培养基:在空白平板培养基中添加所需的抗性药物。

五、 操作方法

1、诱变出发菌一环于装有10ml种子培养基的100ml三角瓶中,培养

14小时。

2、将培养好的菌体倒入离心管中,离心,除去上清夜,再用生理盐水洗涤菌体,直到培养基全部洗净,(一般洗涤二次)

3、将洗净的菌体定容至原体积,菌体量在108个/ml;

4、把此菌悬液倒在玻璃珠三角瓶中,分散菌体。

5、取分散的菌体各1毫升于二个试管中。

a、一个试管中加入已配制的NTG(250r/ml)4ml制成含200r/ml,NTG 的处理液30 ℃保温,振荡处理30分钟;

b、另一个试管中加入4ml H2O作平行处理。

6、将通过NTG诱变处理的菌液用生理盐水洗涤几次,终止其反应,然后将a,b各按100,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5稀释处理后各取0.1 ml 涂于空白平板和抗性平板上。

7、将平板置于31℃培养箱培养3-4天,观察长菌情况并计菌落数。

8、所有接触过NTG的器皿均须用1~2N的NaOH液解毒处理。浸泡过夜后用大量水冲洗。

六、 实验结果及计算:(均在稀释倍数相同下对照)

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