参附改善大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞激活的研究
参附改善大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞激活的研究
柴跃龙,龚建平,涂兵（400010重庆，重庆医科大学附属第二医院肝胆外科）
[摘要]目的观察参附（Shenfu,SF）注射液预处理对大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞中糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)、核转录因子κB（NF-κB）表达的影响，探讨参附预处理保护缺血再灌注损害（ischemia reperfusion injury，IRI）的机制。方法将雄性SD大鼠按完全随机分组法分为正常对照组、缺血再灌注组、SF组，其中缺血再灌注组、SF组建立肝移植缺血再灌注模型，于缺血再灌注后6h分离培养受体移植肝脏的Kupffer细胞。
通过RT-PCR、Western blot和激光共聚焦显微镜技术、免疫荧光法、ELISA等实验技术检测Kupffer细胞GR的mRNA 和蛋白表达，NF-κB的蛋白表达，培养上清中TNF-α的含量。结果缺血再灌注组Kupffer细胞GR mRNA和蛋白表达均明显低于正常对照组（P<0.01），缺血再灌注组NF-κB、培养上清TNF-α表达量(830.19±71.34)明显高于正常对照组NF-κB、培养上清TNF-α表达量（65.41±37.63，P<0.01）。与缺血再灌注组相比，SF组GR水平明显上升（P<0.01），NF-κB活性、TNF-α表达量(543.59±41.27)明显下降（P<0.01）。结论缺血再灌注损伤会导致Kupffer细胞GR的表达下调，NF-κB的激活；参附预处理可以改善肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞的激活。
[关键词]Kupffer细胞；肝移植；缺血再灌注损伤；参附；糖皮质激素受体；核因子-κB
[中图法分类号] [文献标志码] A
Regulation of Shenfu on activation of Kupffer cells on ischemia-reperfusion injury of transplanted livers in vitro experiments of rates
Chai Yuelong, Gong Jianping, Tu Bing (Department of Hepatobiliary Surgery, Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University,Chongqing,400010, China)
[Abstract]Objective To observe the protective effects of Shenfu injection (SF) pretreatment on the expressions of glucocorticoid receptor (GR) and nuclear factor kappa B (NF-κB) in Kupfer cells (KCs) after liver transplantation in order to elucidate the protective mechanism of SF pretreatment against ischemia-reperfusion injury (IRI).Methods SD rats were randomly divided into there groups: the control group (n=6) did not perform any surgery, donor animals of the the SF group (n=6) were treated with SF （2ml/100g, iv）1h before surgery, and the ischemia-reperfusion group (IR) (n=6) were treated with physiological saline.KCs were isolated from normal rat liver and liver grafts at 6h after transplantation. The expression of GR, NF-κB in KCs and TNF-α secret ion were measured by RT-PCR, Western blot ,laser confocal scanning microscope and ELISA. Results The mRNA and protein expression of GR in the IR group were significantly lower (P<0.01), and the NF-κB expression and TNF-α level (830.19±71.34) were obviously higher as compared with the control group （TNF-αlevel 65.41±37.63,P<0.01). SF treatment (TNF-α level 543.59±41.27) significantly reversed the changes in IR group (P<0.01). Conclusion IRI can down-regulate the expression of GR and up-regulate NF-κB and TNF-α level in Kupffer cells, SF pretreatment can meliorate activation of KCs after IRI.
[Key words]Kupffer cell;liver transplantation;ischemia reperfusion injury;ShenFu;glucocorticoid reccptor;NF-κB
[基金项目]国家自然科学基金（30772098）
[通信作者] 涂兵，E-mail：bing_tu@https://www.wendangku.net/doc/ac13774820.html,
Supported by the National Natural Science Foundation of China(30772098).Corresponding author：Tu Bing, E-mail:bing_tu@https://www.wendangku.net/doc/ac13774820.html,
肝移植是治疗终末期肝病的重要技术，可以使晚期肝病患者重获生机。但是肝移植术后的再灌注损伤可导致各种并发症，严重影响患者的预后[1-2]。供体肝植入受体前是处在缺血缺氧期，类似于器官缺血休克期。再灌注时供体肝脏Kupffer 细胞的激活，其自由基的大量产生和细胞内钙超载等都可能是肝移植缺血再灌注的发病环节。缺血再灌注可能创造了一种炎症环境，而相应的抗炎机制的减弱也加重了炎症效应。近年来研究表明，休克性肝脏的糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)数目减少，同时伴有靶细胞对糖皮质激素反应性降低，而参附可以增强失血性大鼠GR 功能而起到抗休克作用[3-5]。关于GR的变化是否也参与了肝移植的缺血再灌注损伤，以及参附是
否同样对大鼠肝移植缺血再灌注GR有作用尚少见报道。本研究采用大鼠原位肝移植模型，模拟供肝缺血再灌注损伤，观察GR以及核转录因子κB（NF-κB）在Kupffer细胞中的表达变化，探讨参附在大鼠肝移植缺血再灌注损伤中的作用并对缺血再灌注治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物雄性Spraque Dawley大鼠30只，鼠龄3月余，体质量180 ~220g,由重庆医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 主要试剂 GR抗体（兔多克隆抗体）购自Abcam 公司，Trizol Reagent(15596-026)购自美国Invitrogen 公司，RT-PCR试剂盒购自Cwbio公司，大鼠核因子-κB
抗体（NF-κB的兔多克隆抗体）购自Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒、免疫荧光二抗购自康为世纪公司，TNF-αELISA测定试剂盒均购于美国Active Motif公司。
1.1.3 药物参附注射液（SF）由雅安三九药业有限公司提供。
1.2 缺血再灌注模型制备和实验分组
大鼠原位肝移植模型采用Kamada’s袖套法改良技术，术前12 h禁食但不禁饮。采用原位灌注切取术，经门静脉灌注0~4℃生理盐水20 ml(含肝素100 U)，肝脏中心温度为0~4℃。①供体手术：乙醚吸入麻醉，游离门静脉和肝上下腔静脉，结扎肝动脉，完成胆管内支架插管，灌洗供肝后，连同上述血管一起切取供肝。在水浴中完成门静脉、肝下下腔静脉袖套准备。②受体手术：切除原肝，原位植入供肝，用7-0带线缝合线两点法端端吻合供肝、受体的膈肌腔静脉环，肝下下腔静脉采用袖套法吻合(内径0.3 cm的聚乙烯管)，门静脉重建采用套管法（0.2 cm长的聚乙烯管），胆总管重建采用插管法（0.5cm长的硬膜外导管）。供肝的冷缺血时间60 min，无肝期为（19.11±2.71）min。
分组：①正常对照组(n=6)，取正常大鼠KCs为实验对象；②SF组，供受体各6只，供体于术前1h经尾静脉注射药物（2ml/100g），取受体（n=6）再灌注后6h的KCs 为实验对象。③IR组（缺血再灌注组），供受体各6只，以同等量的生理盐水于术前1h经尾静脉注射处理供体，取受体（n=6）再灌注后6h的KCs为实验对象。
1.3实验方法
1.3.1Kupffer细胞的分离和培养 Kupffer细胞的分离培养按照文献[6]方法加以改动，大鼠从下腔静脉抽血后，剪断下腔静脉，门静脉穿刺，肝脏原位灌注PBS及0.05％Ⅳ型胶原酶，取下肝脏用显微镊划碎肝脏，0.05％Ⅳ型胶原酶进一步消化约40min，加入20 ml RPMI1640制成混合细胞悬液，于4℃、50 g离心3 min后将肝实质细胞与非实质细胞分开。将含非实质细胞的细胞悬液，4℃、300×g离心5min后弃上清液，采用Percoll原液9份和浓PBS（10倍浓度）1份混合配成等渗的Percoll(SIP)，把混有非实质细胞的RPMI1640细胞悬液加到25％：50％SIP梯度的Percoll液上，4℃、500×g离心15 min，25％与50％SIP液之间为Kupffer细胞悬液。收集Kupffer细胞悬液，用RPMI1640洗涤3次，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，接种于培养板。1h后，洗去非贴壁细胞，再次培养4h后，检测细胞蛋白及RNA及细胞上清液TNF-α。
1.3.2 KCs的鉴定用空白对照组KCs进行吞墨法鉴定，培养于6孔板的KCs，加入1/1000浓度碳素墨汁，光学显微镜下观察KCs的细胞形态，是否有巨噬细胞吞噬功能。
1.3.3 KCs的GR-mRNA检测采用Trizol试剂盒提取KCs总RNA，具体方法按试剂盒说明，以2μg RNA产物进行逆转录反应，产物－70℃保存。GR引物序列：上游引物5＇-AGCAGAGAATGTCTCTAC-3＇,下游引物5＇-GGAATTCAATACTCATGGTC-3＇(扩增产物376bp)。β-actin 内参：上游引物5＇-TTGTCACCAACTGGGACGATAGG-3＇,下游引物5＇-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3＇(扩增产物764 bp)。按RT-PCR试剂盒操作说明进行RT-PCR。程序设定为：94℃ 5min DNA变性,55 ℃ 1 min退火,70℃ 1 min延伸，30个循环，70 ℃延长7 min。电泳并凝胶成像，图像分析并半定量计算PCR产物的相对表达量，结果以各组目的基因与β-actin mRNA比值表示。
1.3.4 KCs的GR蛋白Western blot检测每孔15 l 样品，12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至PVDF膜，在5%牛血清白蛋白的TBS缓冲液中封闭1 h，加入兔抗GR 多克隆抗体（1∶250），于37 ℃摇床上平缓摇动2 h，加入以1∶1000的HRP标记的羊抗兔IgG，于37℃摇床上平缓摇动2 h，DAB显色约5 min后，利用GeneGnome凝胶成像分析系统进行成像和图形分析，测出各蛋白条带灰度值,与β-actin灰度值的比值作为蛋白相对表达量，定量分析GR蛋白表达。
1.3.5 免疫荧光间接法检测KCs的GR和NF-κB蛋白表达甲醛固定，Trution穿透，羊血清封闭，一抗4℃过夜。GR 蛋白用荧光二抗（RBITC标记）显示，50%甘油封片，激光共聚焦扫描显微镜扫描成像。KCs蛋白加HRP标记的二抗，DAB显色，细胞板镜下检测。图像结果用专业Image-Pro 软件分析。
1.3.6 细胞培养上清液TNF-α检测具体步骤参照试剂盒（美国Active Motif公司）说明书进行。
1.4 统计学分析
采用SPSS 10.0统计软件分析，计量资料以x±s表示，组间两两比较行t检验。
2 结果
2.1 KCs形态观察和吞噬功能鉴定
KCs细胞随时间变化形态结构也发生变化。新分离的
KCs悬浮于培养液中，类圆形，细胞形状不一。37℃恒温室培养 1 h，细胞即可完全贴壁、伸展，体积增大，外形不规则。镜下持续观察1h，可见粘附细胞的胞质内吞噬大量碳素墨汁颗粒，证明所养细胞为具有吞噬功能的KCs。（图1）。
图1 Kupffer 细胞的吞墨实验（×400）
2.2 KCs的GR表达分析
2.2.1 RT-PCR检测GR mRNA的表达结果显示，对照组KCs细胞中有高水平的GR mRNA(1.72±0.07)，IR组细胞GR mRNA含量明显降低（0.63±0.02），SF组GR mRNA （1.38±0.04）与IR组比较，明显上升（P﹤0.01，图2）。
图2 RT-PCR检测GR mRNA的表达
2.2.2 GR蛋白在各组Kupffer细胞的表达Western blot检测KCs细胞GR，结果显示，IR组细胞GR蛋白相对表达量(0.43±0.034)，而对照组GR蛋白相对表达量（1.15±0.066）和SF组GR蛋白相对表达量（1.01±0.09）明显高于IR组GR蛋白表达，具有统计学意义（P﹤0.01，图3）。
图3 Western blot方法检测各组Kupffer 细胞内GR蛋白表达2.2.3 GR蛋白在各组Kupffer细胞的分布经免疫细胞荧光检测，激光共聚焦显像提示GR蛋白在各组Kupffer
细胞内有表达，图像分析阳性区域显示，IR组（图4A）细胞内GR分布含量少，细胞核与细胞质的GR代表亮度同时降低，细胞平均荧光强度为79.35；对照组（平均值为110.42，图4B）和SF组（平均值为102.94，图4C）与IR 组相比，细胞中GR显著增加，差异有统计学意义（P﹤0.01）。
A：IR组；B：空白对照组；C：SF组
图4 各组Kupffer细胞内GR免疫荧光染色（×400）
2.3 Kupffer细胞中NF-κB的表达/活性的变化
经免疫组织化学检测，在对照组和SF组NF-κB主要表达于细胞质；在IR组NF-κB表达较其他2组差异有统计学意义（P﹤0.01）,且部分细胞出现了核转位，核内NF-κB蛋白表达增多。SF组较IR组NF-κB表达/活性明显降低（P﹤0.01，图5）。
A：空白对照组；B：IR组；C：SF组
图5 各组Kupffer细胞NF-κB免疫组化染色观察（×400）2.4 细胞培养液中TNF-α的水平
IR组(830.19±71.34)比对照组(65.41±37.63)TNF-α含量显著增加（P<0.01），SF组(543.59±41.27)较IR组TNF-α含量明显下调（P<0.01）。
3 讨论
近年来在对肝移植缺血再灌注损伤(IRI)发生、发展的研究中，学者们发现以下几种主要机制都与Kupffer细胞密切相关：①细胞级联反应机制：大量证据证明Kupffer细胞、中性白细胞与内皮细胞相互作用从而激活核转录因子-κB以及下游大量炎性细胞因子如TNF-α等在缺血再灌注损伤的发病机制起重要作用[7-8]。NF-κB是调控多种炎性介质基因表达的枢纽，这些炎性因子形成“瀑布式的反应”，将引起炎症反应的放大乃至组织损伤。②氧自由基：Kupffer细胞以及黏附的中性白细胞是肝移植缺血再灌注的氧自由基的主
要来源[9]。氧自由基可经其中间代谢产物不断生成新的自由基，引起内皮细胞损伤并导致微血管完整性的缺失和微循环紊乱。③钙超载：缺血再灌注初期Ca2+通透性增加, 大量流入胞内引起钙超载除了引起肝组织实质细胞坏死、凋亡，同时也促进Kupffer细胞活化，激活NF-κB，进一步加重缺血再灌注损伤[10]。
虽然肝移植IRI发生发展比较复杂，但是过度炎症被证实是导致IRI最主要的原因。Kupffer 细胞作为寄居在肝血窦的特殊巨噬细胞，它通过大量释放细胞因子TNF-α和其他细胞因子在炎症中起到关键作用[11-12]。而Kupffer细胞的活化和NF-κB的激活紧密相关。有研究发现，抑制Kupffer细胞中的NF-κB基因可以起到对IRI的保护作用[13]。
参附注射液(SF)其有效成分为人参皂苷和乌头类生物碱。近年一些研究表明SF具体有抗炎、能明显减轻缺血性损伤对肝脏结构和功能上的破坏，提高机体耐受缺血再灌注损伤的能力。参附注射液也可通过保护肝窦内皮细胞，降低TXA2／PGI2比值及减轻肝窦内炎性反应，改善肝脏微循环灌注。大量研究证实参附注射液可以抑制肝缺血再灌注中NF-κB的活化[14]。我们先前研究也发现参附注射液保护大鼠肝移植缺血再灌注损伤[15]，但具体机制不清楚。究竟参附注射液如何抑制NF-κB的激活？本研究发现参附注射液可以上调Kupffer细胞中的GR蛋白以及抑制NF-κB激活。
GR是细胞内的一种可溶性蛋白，属核受体超家族的重要成员，也是一种典型的激素依赖性转录调节因子。GR与激素结合后通过和靶基因中的糖皮质激素反应元件相互作用，调节靶基因表达，引起各种生物学效应。研究发现，GR的变化与病情的严重程度有关，GR表达下调越明显，器官衰竭越多，病情越重，致病死率增加[16]。以往研究提出，糖皮质激素(glucoeorticoid，GC)与其受体GR的复合物是机体内部最重要的抗炎机制，GR 减少是体内抗炎机制减弱的主要原因[17]，它与SIRS的发生密切相关[18]。
本研究在SD大鼠原位肝移植IRI模型上研究GR蛋白和mRNA的表达变化，更能贴近实际临床肝移植模型。本实验是在前期预实验基础上[14]，选取适宜的SF注射剂量为2ml/100g。本研究采用在大鼠原位肝移植模型上，用Western blot和细胞免疫化学检测Kupffer细胞GR蛋白的表达分布情况，结果显示，缺血再灌注损伤刺激后，Kupffer 细胞内可能出现GR的合成减少或者消耗增加，SF 注射液处理后提取的Kupffer细胞，其GR水平较IR组明显上调。GR蛋白含量的增加与mRNA上调一致，表明SF处理后Kupffer细胞内GR蛋白明显高于IR组，可能是新合成的GR补充。细胞免疫组化分析细胞内的NF-κB的表达和分布，IR组NF-κB的表达明显增加，意味着下游炎症因子的激活和抗炎机制的减弱。而SF组NF-κB的表达较IR组明显下调，提示SF可能是抑制了调控多种炎症介质的靶点NF-κB的活化。细胞培养液中TNF-α的含量在3组Kupffer细胞内的变化符合NF-κB的变化趋势。NF-κB是调控多种炎性介质基因表达的枢纽，同时也是GR作用的靶基因之一[19]。GR通过反式阻抑(the transrepression/the tethering mechanism）机制来调节NF-κB[20]。参附注射液在肝移植缺血再灌注中保护作用的关键点可能是促进GR表达，抑制NF-κB激活，从而减少对Kupffer细胞的激活/活化。
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（收稿：2010-12-02；修回：2010-12-26）
（编辑张维）
肝脏缺血再灌注的损伤机制及和防治
肝脏缺血再灌注的损伤机制及和防治 摘要：缺血再灌注损伤是Jennings第一次提出的，是指组织或器官在缺血后紧接着得到血液供应，但是这时血液的供应不利于缺血的组织、器官的功能的恢复，甚至加重了代谢的障碍、结构的破坏。本文的肝脏缺血再灌注损伤是肝脏术后肝功能异常、原发性肝移植无功能、肝衰竭的重要原因之一【1】。肝脏缺血再灌注损伤的后果往往取决于缺血时间的长短、肝脏储备功能的强弱等【2】。目前。肝脏缺血再灌注损伤是肝脏外科的研究热点，普遍认为其病理机制是多种机制共同作用的结果，防治主要是缺血预处理、药物预处理和缺血后处理。 1.肝脏缺血再灌注损伤的机制 肝脏缺血再灌注损伤的发生可能有部分原因是由于肝脏缺血过程中的损伤，另一部分原因是当缺血的肝脏得到血流再灌注时产生一系列损伤。研究指出，缺血再灌注使得肝细胞和kuffer细胞、中性粒细胞、肝窦状隙内皮细胞、贮脂细胞等细胞之间发生相互作用【3】。另外，血小板、补体也有参与。活化的细胞释放大量的促炎因子、脂质炎性因子，导致炎性介质反应和细胞的凋亡。损伤会使得肝窦状隙内皮细胞被破坏，肝脏微循环障碍，进而加重肝脏微循环的缺血且导致肝细胞再生受阻【4】。 2.肝脏缺血再灌注损伤与氧自由基 研究指出，氧自由基在肝脏缺血再灌注损伤的时候发挥了较为重要的作用，主要来源于kuffer细胞、中性粒细胞和黄嘌呤氧化酶，主要包括超氧化物自由基、氢氧根离子、过氧化氢等。氧自由基造成肝细胞损伤的机制主要是：通过对细胞膜磷脂双分子结构中脂质的氧化，改变细胞膜通透性及流动性，从而直接损伤肝细胞；同时氧自由基损伤肝脏血管内皮细胞，特别是肝窦状隙内皮细胞，引起血液中血小板以及粒细胞等在微血管中聚集，阻碍肝脏微循环，氧自由基还可抑制线粒体氧化磷酸化，使肝细胞供能减少。 3.肝脏缺血与细胞内钙超载
稳定大鼠原位肝移植模型的建立
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２００９年５月第６卷第１３期 图１腹主动脉灌注图２修肝及套管 圈３肝脏血管系统吻合完成 当延长供肝的冷缺血时间并不明显增加术后死亡率及并发症的发生。而术中过多地牵动供肝则会明显影响供肝的质量嗍。手术分离时尽可能去除血管壁周围的筋膜、结缔组织等。防止再通后造成套管腔狭窄及血栓形成。 ３．２供肝灌注 先松开门静脉夹，再松开肝下下腔静脉夹，均缓慢松开。灌洗压力过大容易引起供肝的细胞器肿胀、细胞坏死和淋巴细胞浸润，导致细胞内钙超载和能量代谢障碍．从而影响移植肝的质量。本研究采用的是经腹主动脉的灌注法。以１￣２ＩｌｉＯｎ的速度灌注腹主动脉，灌注液体经过肝动脉和门静脉系统回流入肝脏，从而保证肝脏得到充分、缓慢而均匀的灌注，提高供肝的质量。 ３．３袖套管放置 套管必须保证硬度适中、内壁光滑。由于不重建肝动脉，而胆道血供多由肝动脉供应．故供肝胆总管不应保留过长．有利于减少胆道并发症。在脾静脉水平安放门静脉袖套较为方便。在左肾静脉水平剪断ⅣＣ。有利于袖套的翻转。 ３．４受体手术 笔者在进腹时习惯取中上腹横切口，而此过程中笔者建议结扎左右腹壁下静脉，首先该血管相对较粗大，出血会影响术野，其次该血管的出血量相对于只有１２一１３“血容量的大鼠来讲会是术后出血性休克死亡的重要原因。受体术前１５ｒｎｉｎ常规给予阿托品对于预防术后肺炎、肺不张有较好的效果ｆＩｑ。供肝恢复血供后对于肝门部的处理，使用血供较好的大网膜覆盖，既有加压防止出血、使胆漏和胆道感染局限化的作用，同时可以适当供给胆道血供，可以预防胆道并发症的发生【ｌｌｌ。受体阻断门静脉后，经门静脉注入羟乙基淀粉 ?论著? 注射液可将肝内残存的血液及时推人体循环。起到“自身输血”的作用。在ＳＶＣ的吻合过程中，缝线不宜过紧。防止血管狭窄。供肝门静脉及ＩＶＣ“套管法”吻合前，必须排出阻断夹后方的一段积血。以防止血栓栓塞。Ｐａｅｈｅｃｏ等旧研究表明，随门静脉淤血时间的延长。再灌注后闲肠道内菌群移位而使内毒素骤升。如此可激活肝脏Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞，产生大量的ＴＮＦ—Ｏｔ及一系列的级联反应。从而对供肝及受者的肺脏产生损伤１７．Ｌａ－ｌ川。同时．ＩＶＣ阻断时间的延长会导致血钾浓度显著升高。在供肝恢复血供的过程中．应缓慢放开无创血管夹，而且应按顺序先放开门静脉。后放开肝上上腔静脉，尽量使心脏逐渐适应血容量的增加。 ４结论 重复是技巧之母．所以大量的练习是提高手术技巧的关键。认真、耐心、仔细的手术是成功的关键。对于供肝的提早冷缺血处理及对供肝植入后的细心操作。使得手术成功的机会大大增加。 【参考文献】 【１】ＫａｍａｄａＮ，ＣａＭｅＢＹ．ＡｓｕｒｇｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｗｉｔｈｆｉｖｅｈｕｎｄｒｅｄｔｈｉｒＩｙｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓｉｎｔｈｅｒａｔ【Ｊ】．Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９８３，９３（Ｐｔｌ）：６４－６９． 【２】宇汝胜，汪泳，钱海鑫．大鼠原位肝移植模型的手术操作技巧探讨阴．肝胆胰外科杂志．２００８．２０（１）：７－９． 【３】权毅，付华。徐亮．大鼠原位肝移植模型的建立和术式改进阴．中国现代医学杂志．２００６．１６（２）：２２６－２２９． 【４】ＷａｎＣＤ，ＣｈｅｎｇＲ，ＷａｎｇＨＢ。ｅｌａ１．１ｒａｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｅｔａｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｓｉｎａｒａｔｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｍｏｄｅｌ陬ＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙＰａｎｃｒｅａｔＤｉｓＩｎｔ，２００８，７（１）：２９—３３． 【５】汪根树。陈规划，朱晓峰．大鼠小体积原位肝移植模型的建立田．中国实验诊断学，２００６，（１０）：儿１９－１１２２． 【６】贾凯，徐钧．二袖套法大鼠原位肝移植术的改进们．山西医科大学学报，２００６，３７（４）：３５６－３５８． 【７】ＴｉａｎＹ，ＪｏｅｈｕｍＷ，Ｇ∞晒ｅｖＰ，ｅｔａ１．Ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＴＮＦ－Ｍｐｈａｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｅｄｉａｔｅｓｉｎｊｕｒｙｉｎｔｈｅａｒｔｅｒｉａｌｉｚｅｄｓｍａｌｌ—ｆ打一ｓｉ∞ｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＩｎｏｕｏｅ叽ＰｌｏｃＮａｉｌＡｃａｄＳｃｉ．２００６，１０３（１２）：４５９８－舢奶． 【８】ＵｍｔａＫＮａｎｙｅｎＢ，Ｂｍｕｈ＆ｅｔａ１．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｒａｔｌｉｖｅｒｔｒａｒｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｌｌｅｘｔｅｎｄｅｄｃｏｌｄｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ０ｆｐｏｒｔａｌｖｅｉｎｃｌａｍｐｉｎｇｔｉｍｅＩＪ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９８，２８（２）：３６６－３７３． 【９】邵堂雷，蔡伟耀，张明钧，等．影响肝移植鼠近期存活的术中因素分析叨．上海第－－ｇｇ科大学学报，２００１，２１（３）：２２３—２２５． 【１０】彭勇，龚建平，刘长安，等．大鼠原位肝移植模型制作过程中麻醉方法的选择【Ｊ】．中华普通外科杂志，２００３，１２０）：６７３－－６７６． 【１ｌ】常顺伍，郑树森，梁廷波，等．大鼠原位肝移植术中胆道重建方法的改进【Ｊ】．中华器官移植杂志２００７，（１）：１３—１６． 【１２】ＰａｅｈｅｅｏＥＧ，ＧｏｒａｅａＭＣ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｓＧ凡ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｌｉｖｅｒｉａｅｈａｅｍｉｅｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｉｎｃｉｒｒｈｏｔｉｃｒａｔｓｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏｈｅｐａｔｉｃｉｓｅｈａｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ【Ｊ】．ＡｅｔａＣｉｒＢｒａｓ，２００６，２１：２４－２８． 【１３】ＯｌｌｕｏｇｌｕＥ，ＫｅｒｅｍＭ，ＰａｓａｏｇｌｕＨ，ｅｔａ１．Ｄｅｌａｙｅｄｅｎｅｒｇｙｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ０ｆｉｓｃｈｅｍｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｏｎｈｅｐａｔｉｃｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓ仞．ＥｕｒＳｕｒｇＢｅｓ，２００６，３８：１１４－１２１． 【１４］Ｋａｓｈｔｉ气Ｍｅｈｒａｂｉ气ＰａｈｌａｖａｎＩＳ，ｅｔａ１．Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｖａｒｉｏｕｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅ呲忉．ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＰｒｏｅｔ２００５，３７：１８５－１８８． （收稿日期：２００９－０２—１７） ＣＨＩＮＡＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ中目医琦导囊３５ 万方数据
肝移植术后缺血型胆道病变的研究进展
内容摘要：肝移植术后的胆道并发症是肝移植的致命弱点，是阻碍肝移植疗效提高的重要因素。因此，它被肝移植先驱calne爵士称为“阿咯琉斯之踵”(the heel of achilles)［1］。随着对肝移植胆道并发症的进一步认识和外科技术的提高，因外科技术原因造成的吻合口、引流管相关并发症发生率呈下降趋势，而非外科技术原因的移植肝缺血型胆道病变(ischemic type biliary lesion，itbl)则成了肝移植术后胆道并发症的主要类型。因此，被称为“阿咯琉斯之踵再现”［2］。缺血型胆道病变是指肝移植术后移植肝非吻合技术性的胆管树的破坏，其发生率为2%～19%［2］。由于其发病原因复杂，临床处理困难，已成为影响肝移植患者长期存活及导致移植物丢失的主要原因之一［3］。为此，肝移植术后缺血型胆道病变的研究已引起了全球移植专家的高度重视［2-4］。 肝移植术后的胆道并发症是肝移植的致命弱点，是阻碍肝移植疗效提高的重要因素。因此，它被肝移植先驱calne爵士称为“阿咯琉斯之踵”(the heel of achilles)［1］。随着对肝移植胆道并发症的进一步认识和外科技术的提高，因外科技术原因造成的吻合口、引流管相关并发症发生率呈下降趋势，而非外科技术原因的移植肝缺血型胆道病变(ischemic type biliary lesion，itbl)则成了肝移植术后胆道并发症的主要类型。因此，被称为“阿咯琉斯之踵再现”［2］。缺血型胆道病变是指肝移植术后移植肝非吻合技术性的胆管树的破坏，其发生率为2%～19%［2］。由于其发病原因复杂，临床处理困难，已成为影响肝移植患者长期存活及导致移植物丢失的主要原因之一［3］。为此，肝移植术后缺血型胆道病变的研究已引起了全球移植专家的高度重视［2-4］。 1 缺血型胆道病变的发病机理 1.1 供肝缺血时间 1.2 供肝灌注方式 1.3 胆汁对胆管上皮细胞的损伤 1.4 肝动脉血供受损 胆管重建时对胆管血供的破坏可导致肝移植术后itbl的发生，这一观点已得到公认［13,17-18］。另外，任何原因引起的肝动脉供血不足，如肝动脉吻合口狭窄、血栓形成、受者肝动脉过细或变异等,均可引起胆管黏膜缺血性损伤,最终发生胆瘘或胆管狭窄。有报道［19］显示原位肝移植术后发生肝动脉血栓的患者中86%出现胆道并发症，术后早期发生的肝动脉血栓常会导致胆管壁缺血坏死和胆瘘,后期发生的肝动脉血栓多导致肝内、外胆管狭窄。 1.5 abo血型不符 在肝移植时,abo血型不符可引起体液性免疫排斥反应,导致大胆管出现局灶性坏死,最后可导致胆管狭窄或闭塞性胆管炎和小胆管消失。sanchez urdazpal等［20］报道了17例abo 血型不符的肝移植患者，9例发生itbl，发病率高达53%。 1.6 巨细胞病毒(cytomegolovirus,cmv)感染 halme等［21］研究发现itbl的发生与cmv感染密切相关。cmv感染可引起慢性炎症反应，激活单核细胞和库普弗细胞，继而对受感染的组织造成慢性炎性损害。另外因cmv抗原与人体自身抗原是类似物,使特异性的细胞毒性t淋巴细胞能产生交叉识别,将同种抗原识别为“非自身抗原”并加以损伤。此外cmv感染也可引起移植后的血管硬化、狭窄或血栓形成。当累及肝动脉时即可导致胆管狭窄或胆漏［22］。 1.7 原发肝脏疾病 有资料［23］表明受者原发疾病为原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎及meld评分≥35分的严重肝病，移植术后有较高的itbl发生率。
Removed_大鼠急性心肌缺血模型制备详细图解
模型的背景，心肌缺血模型分全心缺血和左心室缺血两种，全心缺血主要靠注射药物（如异丙肾上腺素等），左心室缺血主要靠手术对动物的冠状动脉左降支进行紧扎实现。由于左心室缺血对临床的意义更大，所以研究心肌缺血药物时这个模型是必须的。 （1）术前12小时给动物禁食 （2）将动物注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉后固定在手术台上 （3）用笔型静脉置留针进行气管插管，插好后可用手术刀柄靠近气管，如果见气雾，就证明成功，连接动物呼吸机，参数为：呼吸频率85；呼吸比1：1；潮气量为18ml （4）胸部被毛、酒精棉消毒，在胸部左侧3~4肋间剪开皮肤，如图1 （5）分离肌肉露出肋骨，切口位置有两块肌肉，胸浅肌和胸深肌，注意按照肌肉的纹路分离可以避免将肌肉扯烂，如图2
（6）在第三根肋骨下用止血钳将肌肉分离开，然后左手用止血钳挑住肋骨，右手持剪刀剪开第三根肋骨，如图3
（7）用止血钳将剪断的肋骨夹住掰开，放入开睑器，用止血钳剥离心包膜，如图4
（8）用止血钳将胸腺（心脏上面白的像脂肪一样的东西）夹住拉出，如图5 （9）在左心耳与肺动脉圆锥间穿6~0号线，拉紧丝线，形成心肌缺血，观察线扎紧的部位上下大约2mm范围的心肌是发白色的，如图6
（10）闭合胸腔，注意将胸腔内的空气挤出（这点非常关键，这个模型最容易失败导致大鼠死亡的就是这个地方），对肌肉和皮进行缝合，挤空气的手法如图7
（11）结扎术后6小时可进行TTC染色：将大鼠脱颈处死，打开胸腔，将心脏剪下，用生理盐水将心脏清洗干净并排出心脏内的淤血，沿冠状沟将心房切除留下心室，用刀片将心脏切成1mm厚的切片，放入0.1%的TTC磷酸盐缓冲液（pH 7.4）37℃水浴7~10分钟，取出切片用生理盐水冲洗数次，观察结果。非梗死区因脱氢酶还原TTC而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色，将梗死区和非梗死区分离并分别称重，梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。下图是染色的结果，图8 结扎位置，梗死的地方其实肉眼大致能看出，和其他地方相比发白，图9：
大鼠Langendroff离体心脏局部缺血再灌注模型建立及功能评价
2013年12月 第23卷第12期中国比较医学杂志CHINESE JOUＲNAL OF COMPAＲATIVE MEDICINE December ，2013Vol．23No．12 ［基金项目］国家自然科学基金（81273691）。 ［作者简介］陈婵娟（1985－），女，在读博士生，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药对心血管疾病的预防与 治疗。E- mail ：ccjqlgcj@126．com 。［通讯作者］鲁卫星（1959－），男，主任医师，博士生导师，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药防治心血管 疾病的研究。E-mail ：weixinglu918@sina．com 檵檵檵檵檵 檵檵檵檵檵殝殝 殝 殝。研究报告大鼠Langendroff 离体心脏局部缺血 再灌注模型建立及功能评价 陈婵娟1，潘昡1，赵明镜2，鲁卫星 3（1.北京中医药大学，北京100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京100007； 3.北京中医药大学第三附属医院心内科，北京100029） 【摘要】目的建立大鼠Langendorff 离体心脏局部缺血再灌注模型的方法并进行功能评价。方法将26 只Wistar 大鼠随机分成2组，对照组（control ，n =12）和模型组（model ，n =14）。两组均建立标准的Langendorff 离 体心脏灌注模型：K-H 液持续灌注（95%O 2+5%CO 2过饱和，左心室插入球囊压力管）， K-H 液持续灌注平衡20min 后对照组K-H 液持续灌注105min ；模型组同对照组平衡20min 后穿线结扎冠状动脉左前降支第一对角支下 缘部位， 造成局部停灌（缺血）30min ，而后剪断结扎线复灌（再灌注）75min 。伊文思蓝、TTC 染色观察心肌梗死、缺血面积；记录左心室压力及心率变化过程，比较各组平衡20min 、局部缺血30min 、再灌15min 、再灌30min 、再灌 75min 的血流动力学指标及灌流液中肌酸激酶（creatine kinase ，CK ）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase ，LDH ）漏 出量。结果对照组血供正常，模型组局部缺血、梗死明显；对照组、模型组平衡末心肌酶学及血流动力学各参数 无明显差异（P ＞0.05），模型组局部缺血、再灌注各个观测时刻心肌酶学及血流动力学参数均与对照组有显著差 异（P ＜0.05），说明模型组经历局部缺血、再灌注损伤，心肌酶漏出明显升高，心脏收缩功能、舒张功能受损，心肌 耗氧量升高。结论大鼠Langendorff 离体心脏局部缺血灌注模型稳定可靠，掌握制作要点及注意事项后，可顺利 快速地成功制备， 为心肌局部缺血再灌注损伤的研究提供更接近临床疾病状态的实验途径。【关键词】大鼠；Langendorff 离体心脏；局部缺血再灌注；模型制备与评价 【中图分类号】Ｒ33【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856（2013）12-0021-06 doi ：10.3969．j．issn．1671.7856.2013.012.006 Establishment and assessment of a Langendorff perfused rat heart model of ischemia-reperfusion CHEN Chan-juan 1，PAN Xuan 1，ZHAO Ming-jing 2，LU Wei-xing 3 （1.Beijing University of Chinese Medicine ，Beijig100029，China ； 2.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine ，Beijig100007； 3.Department of Cardiology ，the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine ，Beijing 100029） 【Abstract 】Objective To explore and summarize a Langendorff perfused rat heart model of ischemia-reperfusion．Methods Twenty-six Wistar adult rats were divided into two groups randomly ：control group （n =12）and model group （n =14）．Each rat underwent open-chest surgery．The hearts were removed and immediately cannulated and effectively
Ca2通路对肝移植缺血再灌注损伤的影响马俊
Ca2+通路对肝移植缺血再灌注损伤的影响马俊，李立（昆明医科大学附属甘美医院，云南昆明650100）［关键词］肝移植；缺血再灌注损伤；Ca2+通路；细胞凋亡；机制 肝脏缺血－再灌注损伤是困扰肝脏外科的一大难点，也是影响肝移植受者术后转归的重要因素。细胞凋亡是肝移植缺血－再灌注损伤的重要机制之一。Ca2+是最先被发现的在缺血－再灌注损伤过程中起作用的因子之一，Ca2+通道通过调节细胞内Ca2+浓度从而影响缺血再灌注损伤的严重性；通过对Ca2+通道的调节，进而对肝移植缺血－再灌注损伤进行调控，以减少肝移植缺血－再灌注对肝脏造成的损伤。缺血再灌注损伤是指缺血的组织器官重新获得血液供应后，并没有使组织、器官功能得到尽快恢复，反而加重其功能代谢障碍及组织结构破坏的现象。 1肝脏缺血再灌注损伤的机制 肝脏缺血再灌注损伤过程按时间可分为缺血期和再灌注期。 1．1缺血期：①线粒体损伤：线粒体是氧化磷酸化反应的主要部位，缺血缺氧首先引起线粒体的损伤，使其功能受损，细胞色素酶系统功能失调，进而形态发生改变，出现线粒体通透性改变，使线粒体内Ca2+聚集，最后导致细胞程序性死亡或坏死［1］。②无氧代谢与代谢性酸中毒：发生缺血、缺氧时，由于线粒体损伤，氧化磷酸化受到抑制，使得ATP有大幅度地减少，依赖于ATP的各种细胞活动受到影响，而因肝脏内的ATP 迅速耗尽和无氧酵解的发生，可导致乳酸、酮体等的堆积，从而引发代谢性酸中毒，pH值明显降低［2］。③Ca2+超载：生理情况下，细胞内和细胞外Ca2+浓度有明显差异，维持细胞正常生理功能的前提是细胞内保证处于Ca2+浓度的状态。缺血缺氧使ATP含量有大幅度地下降，会使细胞内外Ca2+浓度发生明显变化进行重新分布，使得Ca2+大量内流，最终造成细胞内Ca2+浓度异常增多，此种现象称为Ca2+超载。 1．2再灌注期：①氧自由基的损伤：氧自由基具有高度不稳定性的特点，生理情况下，身体内氧自由基的产生和清除相对动态平衡，肝缺血再灌注造成细胞内Ca2+超载，激活Ca2+依赖蛋白酶促进胞内黄嘌呤脱氢酶（XDH）向黄嘌呤氧化酶（XOD）转化，而黄嘌呤氧化酶利用胞内分子氧产生大量的氧自由基。氧自由基对肝细胞膜重大直接损伤，细胞遭受到严重破坏后产生出大量细胞内容物，进一步加重炎性反应过程中氧自由基的产生，氧自由基又进一步损伤到内皮细胞，最终造成丧失微循环完整性，血流也有急剧减少。②细胞因子：肿瘤坏死因子α（TNF－α），白细胞介素－1和6（interleukin1 and6，IL－1and IL－6），前列腺素（prostaglanddins，PG）等细胞因子参与了肝脏缺血再灌注损伤的病理生理过程。这些细胞因子既可通过单个形式也可通过彼此间协同作用引起肝细胞损伤［3］；激活中性粒细胞释放氧自由基；刺激单核巨噬细胞和其他细胞分泌IL－1，IL－6等炎性因子给予相关抗体能减轻肝脏炎性反应和损伤［4］。③中性粒细胞和Kupffer细胞活化：中性粒细胞在肝脏缺血再灌注损伤的早期聚集到肝脏微循环系统中被活化，加重再灌注损伤，最终会加重内皮细胞的损伤，进一步作用使得肝内微循环发生严重紊乱，造成肝脏持续性的缺血，会严重损伤到肝细胞［5］。④一氧化氮（NO）和内皮素（ET）：NO是由一氧化氮合成酶通过L－精氨酸加工而来，他在免疫调节、神经递质传递、血小板聚集等生理过程中都有重要作用［6］。NO能够激活cGMP降低血管张力，从而发挥其血管舒张因子的作用［7］，另外，NO还可以通过调节中性粒细胞粘附、血小板聚集、星状细胞的舒张等达到影响缺血再灌注损伤严重程度的作用［8］。ET浓度增高将导致微血管收缩，肝血流减少而引起肝脏微循环功能障碍，继而导致肝细胞的损伤。 2Ca2+在缺血再灌注损伤及细胞凋亡中的作用 Ca2+是最先被发现的在缺血－再灌注损伤过程中起作用的因子之一，Ca2+通道通过调节细胞内Ca2+浓度从而影响缺血再灌注损伤的严重性。在此过程中，Ca2+是某些磷脂酶、核酶、蛋白酶的激活所必须的离子，另外，在缺血再灌注损伤相关的氧化磷酸化紊乱过程中，Ca2+通过减少ATP的合成，发挥了重要的作用［9］。线粒体内钙离子的浓度变化也与肝脏热缺血－再灌注损伤的严重程度有密切关系［9］。 Ca2+是广泛存在于各种细胞内的信号分子，他不仅可以从多个方面调节细胞正常生理功能，同时也是细胞凋亡信号途径中的重要成分［10］。一些药物或化学物质，如糖皮质激素、内质网Ca2+－ATP酶抑制剂毒胡萝卜内酯（thapsigarin）以及一些肿瘤化疗药物，都是通过凋亡起始阶段暂时提高细胞内游离的Ca2+浓度、并激活细胞内Ca2+储藏细胞器释放Ca2+，从而诱发细胞凋亡［10］。此外，在处于细胞凋亡效应阶段晚期的细胞内，也可观察到游离Ca2+浓度的升高［10］。目前已经发现了一系列的Ca2+介导的细胞凋亡信号途径。 线粒体在细胞内位于接近内质网Ca2+通道附近的微小区域，当这些通道开放时，胞质内Ca2+有可能升高［11］。线粒体内Ca2+浓度上调有可能导致线粒体渗透性移位（mitochondrial permeability transition），从而进一步诱发线粒体肿胀和凋亡。例如卡配因（Calpain），他是一种依赖Ca2+存在而激活的半胱氨酸蛋白酶，已经被证实在某些刺激的作用下能够诱发细胞凋亡［12］，在此过程中，一些重要的细胞成分也参与到其中，如caspase－12［13］，Bax［14］，Bid［15］。 3钙离子拮抗剂对肝缺血再灌注损伤的作用和研究进展国内外鲜有应用钙离子通道阻断剂降低肝缺血再灌注损伤的相关研究及报道，多为理论研究，临床研究少见。 4小结 缺血再灌注损伤的机制研究较深入，如何有效减少缺血再灌注损伤是目前国内外外科学研究的重点和难点，笔者从Ca2+通道对于缺血再灌注损伤的影响方向入手，以求找到一种有效的方法，最大限度地发挥钙离子通道拮抗剂在缺血再灌注损伤病理生理过程中的保护作用。 5参考文献 ［1］Kim J，Qian T，Lemasters JJ．Mitochondrial permeability transit ion in the sw itch from necrot ic to apoptotic cell death in is-chemic rat hepatocytes［J］．Gast roentero logy，2003，124（2）：494．［2］Lemasters JJ，Thurman RG．The many facets of reperfusion injury［J］．Gast roerlogy，1995，108（4）：1317． · 729 · 吉林医学2013年2月第34卷第5期
大鼠辅助性原位肝移植的体会
【摘要】目的研究大鼠辅助性原位肝移植模型的手术技巧及术后并发症的预防。方法30只SD大鼠作供体。30只SD大鼠为受体。通过“袖套法”施行大鼠辅助性原位肝移植。结果24h存活率76％(19/25)；周存活率56％(14/25)。结论熟练的显徽外科技术是模型成功与否的关键。 【关键词】肝脏；移植；大鼠 Parital auxiliary orthotopic liver transplantation in rats LONG Guang-hui, XIAO Ping, XIE Yong, et al. Department of Hepatobiliary Surgery，Peking University Shenzhen Hospital，Guangdong，518036 [Abstract］Objective To investigate the method and technique of parital auxiliary orthotopic liver transplantation in rats. Methods 30 cases of parital auxiliary orthotopic liver transplantation in SD rats were performed using cuf-tecnique and microsurgery method. The successful rate, operation time and complications were observed. Results The general successful rate was 90%, the survival rate of post-operation 24-hour and one week was 76％(19/25)and 56％(14/25)respectively. Conclusion Meticulous and skilled microsurgical technique is the key to successful operation. [Key words］liver; transplantation; rat 近年来，辅助性原位肝移植因其手术创伤相对较小、供体来源比较容易获取以及术后不必长期服用免疫抑制剂等优点已经越来越多地受到临床医生的重视[1]。但是，该该移植方法目前也有其一定的局限。其中又以供肝与移植肝功能竞争导致移植肝萎缩最为明显[2]。因此，建立动物辅助性原位肝移植模型了解供肝与移植肝功能竞争的机理是解决这一难题的重要研究手段。70年代大鼠原位肝移植模型获得成功后[3,4]。原位肝移植的动物模型已经逐渐成熟并被实验研究广泛采用。但是，辅助性原位肝移植的动物模型尚不多见。本实
大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型的建立与评估_成玲俐
基金项目:广东省自然科学基金(06021338);广东省科技计划项目 (2007B031508003);佛山科技局(200808109) *通讯作者,Wushuhua168@https://www.wendangku.net/doc/ac13774820.html, 文章编号:1007-4287(2010)08-1163-03 大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型的建立与评估 成玲俐1,吴素华2*,李志梁1,唐 2 ,张 瑞1 (1.南海盐步医院,广东佛山528247;2.中山大学附属第一医院;3 南方医科大学珠江医院) 摘要:目的 改进和完善大鼠急性心肌缺血再灌注损伤动物模型的制备及评估。方法 健康SD 大鼠随机分为3组:假手术组(Sham 组),仅穿线,不结扎LAD;缺血组(Ischemia 组),单纯结扎LAD30min;缺血再灌注组(IR 组),结扎LAD30min,再灌注120min 。每组20只。并从造模成功率、心电图、外周血中LDH 、CK MB 的含量测定、心肌病理组织学检查等方面对改进后的模型进行评估。结果 改进后的造模成功率达到90%以上,血液动力学、心电图、外周血中LD H 、C K MB 的含量测定、心肌病理组织学检查等方式均证实改良后的动物模型成功。结论 改进后的方法能大大降低手术难度,提高模型成功率和动物成活率,准确地复制心肌缺血再灌注损伤的实验模型,简化实验操作步骤。 关键词:大鼠;心肌缺血再灌注;动物实验模型中图分类号:R541 4 文献标识码:A Im proving and Evaluating the Method of Establishing Rat Models of Acute Myocardial Eschem ia Reperfusion C HE NG Ling li ,WU Su hua,LI Zhi lian g ,et a l.(De p a rtment of Ca rdiovascula r ,Yanbu H osp ital o f Nanhai District ,Foshan 528247,China) Abstract:Objective To i mprove and evaluate the method of establishing rat models of acu te myocardial ischemiareperfusion,which had high rate of success and survive.Methods 60Sprague Dawley rats were divided into three groups at random:con trol group,Sham group and improved myocardial ischemia/reperfusi on group.The successful rate and the effectiveness of each group were observed.The hemodynamics,eletrocardiogram,Evans blue and TTC staining,myocardial enzyme spectrum and histology resul ts were used for evaluating the modified model.Results The successful rate of three groups were 90%,100%and 100%,respectively.The hemodynamics,eletrocardiogram,Evans blue and TTC staini ng ,myocardial enzyme spectru m and histology all tes tified that the models of modified method were results were successful.Conclusion The method of establish rat models of acu te myocardial ischemia reper fusion is simpleand convenient,with high successful rate and survival rate. Key words:Rats;Myocardial ischemia reperfusion;E xperimental animal models (Chin J Lab Diagn,2010,14:1163) 在动物体内阻断左冠状动脉前降支(LAD)造成急性心肌缺血,并在预定时间内恢复血供予以再灌注,是模拟人类缺血性心脏病恢复血供治疗必需的实验方法。由于大鼠在进化关系上比较接近人类,且其冠状动脉侧支循环少、心肌坏死出现早、心律失常发生率高、稳定性好,且大鼠制作模型费用低廉,从而成为制作心肌缺血再灌注损伤模型的首选,结扎大鼠LAD 形成心肌梗死是目前国内外公认的模型制备方法。但以往模型制备过程中存在诸多不便,如:手术时反复多次将心脏牵拉到胸腔外,造成动物死亡率增加,加大了实验成本,又加大了动物的创伤;阻断冠状动脉造成缺血后实现再通时,结扎线不易剪断,常导致左心耳破裂,引起心脏撕脱伤,造成大出血;文献报道冠状动脉的定位部位不一,会造成模型缺血损伤部位及损伤程度不一致等。参照不 同研究人员采用的模型制备方法[1],结合本实验室条件对该模型制作进行了改进,以提高模型制备成功率。现报告如下。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与分组 清洁级SD 大鼠,体重220-260g,雄性,合格证号:SC XK(粤)2008-0020。由广州中医药大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为3组:假手术组(Sham 组),仅穿线,不结扎LAD;缺血组(Ischemia 组),单纯结扎LAD30min;缺血再灌注组(IR 组),结扎LAD30min,再灌注120min 。每组20只。 1.1.2 主要仪器和器械 动物呼吸机ALC V8(上海奥尔科特生物科技有限公司),澳大利亚产Power lab16导生理记录仪,无创缝合针(上海医菱医疗器械有限公司);黑色医用缝合线、lOml 一次性无菌注射器、各种手术器械,如止血钳、小无齿弯钳、小镊、小眼科剪等。 1163 中国实验诊断学 2010年8月 第14卷 第8期
大鼠心缺血再灌注实验设计
题目：不同药物对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用 目的：观察抑制氧自由基生成药物（5-甲酰尿嘧啶）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察钙离子拮抗剂（硝苯地平）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 原理：多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注．不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。 心缺血再灌注损伤是指心肌缺血后再灌注期间导致的心机细胞损害，其损害程度较心肌缺血本身严重，常表现为心肌细胞收缩功能减弱和心室顺应性改变，出现心律失常，心功能低下等现象。 心肌缺血再灌注损伤与氧自由基产生增多、钙超载、及白细胞的作用有关。 抑制氧自由基生成药（黄嘌呤氧化酶抑制剂——5-甲酰尿嘧啶）具有抑制氧自由基生 成的作用，减少氧自由基生成。钙离子拮抗剂（硝苯地平）可以阻断钙的慢通道，使细胞外钙的内流减少，从而降低胞浆钙离子，可起到减少MIRI的作用。抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）可以阻断脂质过氧化可1）抗白细胞粘附;（2）保护内皮功能;（3）抗血小板粘附、聚集及脱颗粒反应。有研究证实外源性维生素E可增加心肌梗死后大鼠血浆、心脏的维生素E含量，改善心功能，并减少大鼠的再灌注心律失常。 实验对象：大鼠4只，120-200g，体格健康雌雄不限。 器材和药品：手术刀，动脉夹4个，棉线，剪子，镊子2把，玻璃分针2个，注射器及针头2个，动脉插管器械，BL-420生物机能实验系统 药品：20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g，5-甲酰尿嘧啶注射液，硝苯地平注射液，维生素C或维生素E注射液，肝素。 方法步骤：1、大鼠心再灌注损伤再灌注模型的制备 （1）取大鼠，称重，用20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g腹腔注射麻醉，仰卧位固定。 （2）1%肝素0.2ml/100g从尾静脉注射。 （3）前胸，上腹部剪毛，沿肋缘下剪开腹前壁皮肤皮下筋膜，肌肉，纵向剪开胸前壁和横向剪开胸前壁暴露心脏。 （4）经主动脉插管 （5）找到左冠状动脉用动脉夹夹闭1分钟。打开动脉夹，血液重新供应，用BL-420实验技能系统记录，观察心律心室内压等的改变。
大鼠肝脏移植模型制作
大鼠肝脏移植模型制作 大鼠原位肝移植是研究器官保存、肝脏缺血再灌注损伤、免疫抑制剂、移植排斥反应以及免疫耐受机理等方面常用的动物模型。最初由Lee在1973年报道，经过许多学者的改进，其手术基本稳定，根据肝上下腔静脉吻合方式，大鼠原位肝移植可分为“二袖套法”和“三袖套法”，下面简单的将大鼠肝脏移植的模型制作介绍一下。 一、手术器械 显微外科手术器械包，手术显微镜1台，自制S拉钩（用橡皮筋一端带弯成S形大头针）4个，眼科剪1把，其它外科器械若干及纱布、棉球、棉片和橡皮条等。 二、供、受者大鼠的选择 根据不同的研究目的选择不同的动物品系，在同种移植模型中，一般采用两种纯系健康大鼠，如Lewis大鼠，Brown Norway 大鼠（BN），DA大鼠等，国内应用Wistar，SD大鼠也比较多。如果是异种移植可以选用豚鼠－大鼠，仓鼠－大鼠等不同品系的动物。 三、术前准备 供、受者术前禁食14h，自由饮水，采用乙醚吸入麻醉麻醉的方法，提高手术的安全性，受者术前肌肉注射阿托品0.03mg，防治分泌物阻塞呼吸道。 四、供者手术 麻醉成功后，经阴茎背静脉注射50U/ml肝素稀释液3.0ml，使供者全身肝素化。十字切口入腹，经腹主动脉穿刺灌洗供肝；灌洗前，剪开膈肌，阻断腹主动脉，离断胸腔段肝上下腔静脉，灌洗至流出液澄清为止，约需灌洗液20～30ml。游离肝下下腔静脉，分离结扎离断右肾静脉和右肾上腺静脉，自肠系膜上静脉置管，缓慢注入20ml含肝素的林格氏液，于右肾静脉下方离断肝下下腔静脉，剪开胆总管前壁，近肝端插入外径1.0mm，长4.0mm 的聚乙烯管约2.0mm（可用硬膜外导管制成），结扎固定后远肝端离断之，分离结扎离断肝固有动脉；游离门静脉，结扎离断其分支幽门静脉、脾静脉，于脾静脉下方离断门静脉，锐性分离肝周韧带，结扎左膈下静脉，绕肝上下腔静脉环切膈肌及其腱膜，保留2.0mm
大鼠原位肝移植步骤及详细说明
大鼠原位肝移植步骤及详细说明 动物案例 供体：Lewis大鼠、DA大鼠； 受体：BN大鼠 造模方法 二袖套一吻合法(门静脉和肝下下腔静脉行袖套法,肝上下腔静脉行吻合法) 供肝的获取 腹采用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3ml/100g)，十字切口入腹，离断肝脏镰状韧带，将小肠移出腹腔外，以生理盐水纱布覆盖。游离胃小弯背腹侧的尾状叶盘状乳头突，近肝侧结扎并离断左膈下静脉，结扎并切断左肝至食管高位血管支，结扎右肾上腺静脉丛，并切断右肾动静脉。游离肝下下腔静脉至左肾静脉上缘，游离肝外胆管并行胆管内插管，经门静脉主干向肝脏内灌注含肝素50U 的4℃生理盐水10ml，行肝脏冷灌注。当肝脏变白时，在靠近左肾静脉入口处剪断肝下下腔静脉，形成灌注液流出道，在膈肌上方横断肝上、下腔静脉，将供肝取出，置于4℃生理盐水内。 血管袖套制备 在4℃生理盐水中将门静脉与肝下下腔静脉壁外翻，分别套在外径2.10mm和2.76mm的聚乙烯管上，用5-0丝线环扎固定，完成袖套制备。
具体步骤 大鼠麻醉后，上腹部直切口入腹，分步游离受体肝脏，游离完毕后将受体肝脏取出。将供肝自生理盐水保存液中取出置于受体原位，冰生理盐水纱布覆盖肝脏表面，以预置的7-0无损伤线吻合肝上、下腔静脉，吻合时，受体侧连同膈肌环一并缝合，先缝合后壁，从左侧开始，将缝线从血管外缝入腔内，在腔内连续缝合。针距控制在1mm，至右侧角时，将缝线穿出血管壁，在血管腔外与右侧角缝线打结。以同一缝线从右侧角连续缝合血管前壁，接近左侧角时，向肝上、下腔静脉内注入4℃生理盐水，驱出血管腔内的空气，至左侧角时，与原缝线打结。以弯血管夹在吻合口近肝侧钳夹肝上、下腔静脉，更换下小儿Satinsky心耳钳，检查吻合口是否出血。吻合成功后，经门静脉向供肝内灌注4℃生理盐水10ml，排除肝内的肝素盐水，夹闭肝下下腔静脉，将供肝门静脉套管插入受体门静脉内，开放门静脉及肝上、下腔静脉阻端夹，结束无肝期。肝下下腔静脉的吻合方法与门静脉相同，最后将供体胆管插入受体胆管插管内，按层缝合腹壁。 造模周期 约1h一对 模型成功率 95%以上
大鼠原位肝移植模型的手术技巧
大鼠原位肝移植模型的手术技巧作者：王振猛，唐乙，宋少华，陆智杰，王全兴，俞卫锋 【摘要】目的探讨建立稳定的大鼠原位肝移植模型的外科手术技巧，为研究肝脏缺血再灌注损伤提供技术支持。方法 110只雄性SD 大鼠随机配对后分别作为供体和受体，通过改良Kamada“二袖套”法施行大鼠原位肝移植。结果改良Kamada法建立大鼠原位肝移植模型共52例，7d 生存率88.5%，7例长期存活大于100 d。结论大鼠原位肝移植模型的建立需要极度的耐心和娴熟的手术技巧，模型的建立有助于研究肝脏缺血再灌注损伤，移植免疫及器官保存。 【关键词】原位肝移植；动物模型；大鼠 Abstract： Objective To improve the operation technique for orthotopic liver transplantation in rats, and illustrate the hepatic ischemia-reperfusion injury in future study.Methods One hundred and ten male SD rat were randomly paired as donor and receptor and were performed with orthotopic liver transplantation by modified Kamada’s two cuffs technique.Results As a result, 88.5% of the 52 rats with orthotopic liver transplantation survived more than 7 days and 7 ones survived longer than 100 days. Conclusion Extreme