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几种主要化学发光物质的发光性

?综 述?

几种主要化学发光物质的发光性能及其

化学发光免疫分析体系

尹东光,贺佑丰,刘一兵,沈德存,韩世泉,罗志福

(中国原子能科学研究院同位素所五十三室,北京102413)

文章综述了目前国际上免疫分析中应用的几种主要的化学发光物质的结构

、发光机理、发光性能和特点以及其免疫分析体系。

目前,在免疫分析领域中应用多种免疫分析方法,其中化学发光免疫分析(C LI A )是将免疫反应和化学发光反应相结合,藉以检测抗原或抗体的技术。它是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,免疫反应结束后,加入氧化剂或酶底物而发光,通过测量发射光强度,根据标准曲线测定待测物的浓度。C LI A 的主要优点是灵敏度高、标记物有效期长、检测范围宽,可实现全自动化等。C LI A 具有强大的生命力,在国际和国内倍受临床用户和生物医学工作者的重视。近十年来C LI A 的

发展迅猛,国外已开发出多种化学发光物质,C LI 2A 系统,以及全自动化化学发光仪。不同的化学发光物质发光机理和发光性能不同,不同的C LI A 系统原理和方法各异。本文综述了目前国际上免疫分析中应用的几种主要的化学发光物质及其免疫分析体系。

1 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类

鲁米诺(luminol )、异鲁米诺(is oluminol )及其衍生物是最早在C LI A 中使用的一种常用的化学发光物质[1-3],它们的结构如下:

这类物质的发光为氧化反应发光,它们在碱性条件下通过辣根过氧化物酶(HRP )催化,被H 2O 2氧化生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体,

当其回到基态时发出光子,以鲁米诺为例其发光机理如下:

几种主要化学发光物质的发光性

收稿日期:2002-02-06;修回日期:2002-05-23

鲁米诺的发光光子产率约为0.01,最大发射光波长为425nm 。早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体,但由于标记后发光强度降低而使其灵敏度受到影响,近年来改用HRP 标记抗原或抗体,免疫反应后,利用鲁米诺作发光底物,在发光启动试剂(NaOH +H 2O 2)作用下,鲁米诺发光,发光强度依赖于免疫反应中酶的浓度。如果不使用增强剂,鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱。1983-1984年Whitechead 和Thorpe 等首先在上述体系中加入合成的荧光素即一种6-羟基苯并噻唑的衍生物,可以使发光时间延长持续至7min ,光信号强度提高7倍,并降低本底信号强度,将信噪比提高达原来的80倍,此即为Luminol/H 2O 2/HRP/Enhance System 。1985年发现一些取代酚如对位碘苯酚、1-溴-2-萘酚、对位苯基苯酚、对羟基肉桂酸和4-苯基硼酸等是更好的增强剂,发光的持续时间可延到30-60min ,发光强度至少增加100倍以上。目前鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物应用于C LI A ,通常采用的体系是Luminol/H 2O 2/HRP/Enhance System ,即用HRP 标记抗原或抗体,以鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物,对碘苯酚或对苯基酚等作增强剂,用NaOH +H 2O 2作发光启动试剂,化学发光反应2min

几种主要化学发光物质的发光性

后,光发射强度达到最高峰;20min 后,光强度减少20%。Amersham 公司的Amerlite 化学发光免疫分析系列商品试剂盒采用Luminol/H 2O 2/HRP/p -iodphenol System 。

2 吖啶酯及吖淀酰胺类

如果吖啶环上的C -9碳原子链上取代基且该取代基能与吖啶环上的C -9和H 2O 2形成有张力的不稳定的二氧乙烷,此二氧乙烷分解为C O 2和电子激发态的N -甲基吖啶酮,当回到基态时发出光子,则这类取代吖啶化合物可做为化学发光标记物。根据取代基的不同,常用作化学发光标记物的吖啶取代物分为两类:一类为吖啶酯

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,如图Ⅰ所示;另一类为吖啶磺酰胺,如图Ⅱ所示:

图Ⅰ和图Ⅱ中的R ,R ′,R ″可能由烷基、烷烯基、芳基、烷氧基及其取代物等构成,相当于连结吖啶部分和官能团部分的空间手臂,其中R ′,R ″还可能起控制反应动力学和稳定性的作用,如果R ′,R ″含有吸电子基团,则增加反应速率降低稳定性,含有电子授予体基团,则降低反应速率增加稳定性。X 、X ′、X ″为官能团,它们起的作用是偶联抗原或抗体,并增加化合物在水中的溶解度。常用做C LI A 的吖啶酯和吖啶磺酰胺化合物[4-8]有下面几种结构:

它们的结构中都有共同的吖啶环,它们的发光机理相同:在碱性H 2O 2溶液中,当其受到过氧化氢离子进攻时,生成一个有张力的不稳定的二

氧乙烷,此二氧乙烷分解为C O 2和电子激发态的

N -甲基吖啶酮,当其回到基态时发出一最大发射波长为430nm 的光子,如下图所示

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:

这类化合物从发光的机理来说,特点是:发光反应中在形成电子激发态中间体之前,联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来,即未发光部分与发光部分分离,因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。

吖啶酯和吖啶酰胺在酸性溶液中(pH 小于4.8)都很稳定,该类化合物及其与蛋白的偶联物在室温下保存4周,其光量子产率不降低;冻干品

在-20℃下,可保存一年以上。但当pH 大于4.8(尤其是在碱性溶液中),吖啶酯和吖啶酰胺类化合物由于发生部分水解而降低其稳定性,水解机理如下图所示。在水溶液中当其受到OH -进攻时生成一假碱,假碱继续在OH -作用下酯键断裂,最后生成N -甲基吖啶酮,水解过程为不发光的暗反应过程。

吖啶类化合物在水溶液中的水解程度,随pH 值增大而增大;随温度升高而增大。大多数吖啶酰胺类化合物的稳定性较吖啶酯类高,其原因是由于C -N 键与C -O 键的键级不同,C -N 键大于C -O 键;吖啶酰胺类化合物抵抗水解的能力强于吖啶酯类。对于吖啶化合物来说,吖啶环及酚环或苯磺酰环上,不连取代基与连接不同取代基其稳定性不同。通常吖啶环或酚环或苯磺酰环上,连有甲基等取代基的吖啶酯或吖啶磺酰胺,由于空间位阻大的原因热稳定性增加,连有吸电子基团时,因有利于亲核取代反应而使稳定性降低。

吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂,在有H 2O 2的稀碱性溶液中即能发光,具有许多优越性,特别是无须一个催化过程,也不需要增强剂,从而降低了背景发光,提高了信噪比,

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干扰作用少。该类化合物作为化学发光免疫分析的发光标记物,还具有其它方面的优点,如光释放快速集中、发光效率高、发光强度大,易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少、标记物稳定,在2-8℃下可保存数月之久,因此吖啶酯或吖啶磺酰胺是一类非常有效的化学发光标记物。

这类化合物发光为闪光型,加入发光启动试剂后,0.4s 左右发射光强度达到最大,半衰期为0.9s 左右。

吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于C LI A ,通常采用的体系是Acridinium ester/H 2O 2系统,即用吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体或抗原,用H NO 3+H 2O 2和NaOH 作发光启动试剂。有些在发光启动试剂中加入Triton X -100,CT AC ,T ween -20等表面活性剂以增强发光。例如Cibo C orning 公司的Magic Lite 化学发光免疫分析系列商品试剂盒就是采用这种系统。

3 (金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物能发生化学发光的(金钢烷)-1,2-二氧乙烷[9-15],其结构可以表示如下通式:

其中T 通常为环烷烃金钢烷,起稳定过氧环的作用,X 为烷氧基,它的作用是增加2-二氧乙烷的水溶性,Y 是发光基团(也叫生色基团和荧光发色团),Z 是Y 的保护基团,它与Y 连接的化学键能被碱性磷酸酶断裂,而使Z 与Y 脱离。当酶促使Z 从分子中脱离后,二氧乙烷分解成两个羰基化合物,一个含T ,另一个含X 和Y,分解反应

放出的能量,使Y 激发形成一不稳定的电子激发态中间体,当其回到基态时发出光子。可以通过选择修饰不同取代基Y 的二氧乙烷,使发射光的波长和光量子数不同,而通过选择修饰T 和X 、Z 可改变二氧乙烷的水溶性和分解动力学性质。

常用于化学发光免疫分析的(金钢烷)-1,2-二氧乙烷有下面几种结构

几种主要化学发光物质的发光性

:

在上述分子结构中,螺旋金刚烷构成分子的稳定部分,

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带有保护基团(磷酸酯或半乳糖吡喃苷)的衍生芳香族结构,则构成易被酶解并在酶解

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后发光的部分,发光由二氧乙烷断裂分解成为一个激发态的两个羰基化合物。例如AMPPD 在碱性磷酸酶(AP )作用下磷酸酯基发生水解,脱去一个

磷酸基而得到一个中等稳定的中间体AMPPD -(半衰期2-30min ),此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金钢烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子,当回到基态时发出波长为470nm 的光,并可持续几十分钟,其发光机理如下图所示:

AMPPD 的特性:(1)在碱性环境下,AMPPD 的非酶解性的水解程度低,即本底低;(2)AMPPD 的热稳定性好,在pH =7.0的水中,30℃时的分解半衰期为142h ,活化能为21.5kcal/m ole ;(3)在pH =9.0时,AP 酶解AMPPD 的速度最快;在pH =9.5

时,虽酶解速度略低,但信噪比最低;(4)AMPPD 的酶解发光为辉光型,波长为470nm ,在15min 时强度达到高峰,15-60min 内光信号强度维持一致,变化很小,即使在12h 后仍能测定得出正确结

果;(5)加入增强剂如聚氯苄乙烯苄基二甲基铵(BDM Q )或BS A 等,能明显增强AP 酶解AMPPD 的

发光强度,增强因素达100-100000倍。增强剂的增强机理目前还不非常清楚,在理论上还没有精确的解释,文献上一般认为AMPPD 在中等极化的非质子有机溶剂(如正丁醇,二甲基亚砜等)中的发光强度和检测灵敏度较在极化的质子溶剂中,尤其是水介质中高。如在水介质中加入增强剂,增强剂包围在AMPPD 分子的周围,可能通过疏水

或离子相互作用或二者兼而有之,与AMPPD 酶解产生的发色团结合,使发色团形成一个稳定的构象。这样使发色团与水分子隔开,从而阻止发色团从激发态回到基态时,非光发射的途径如振动松驰以热能的形式释放全部或部分能量,一些天然的水溶性大分子如水溶性球蛋白BS A 、H AS 等,和人工合成的聚季铵盐如T M Q 、BDM Q 等,它们的分子结构中都含有疏水区,能提供一个疏水性微环境,具有稳定发色基团的作用,从而增强发光强度。

CSPD 和C DP -Star 是继AMPPD 后合成的AP

酶解化学发光物质,它们的发光性能优于AMPPD :CSPD 和C DP -Star 较AMPPD 稳定;非酶解性的水

解程度更低;酶解速度更快,达到最大光信号只需要相当于AMPPD 时间的一半;且发光信号更强,信噪比更高;CSPD 和C DP -Star 是目前最理想的AP 酶解化学发光物质。

(金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物[9-15]

应用于C LI A,通常采用的体系是Dioxetane/AP/En2 hance System,即用碱性磷酸酶(AP)标记抗原或抗体,用(金钢烷)-1,2-二氧乙烷或其衍生物作发光底物,在发光底物中加入增强剂。目前美国DPC公司的Immulite System和Beckman C oulter公司ACCESS Automated Immunoassay System都是采用Dioxetane/AP/Enhance System。

4 电化学发光体系

早在60年代人们就开始研究电化学发光,文献上[16-18]报导了许多物质的电化学发光,如多环芳烃类,酰肼类和联吡啶类化合物等。但最常用于EC LI A的化学物质是三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+,其结构如下所示:通过活化“手臂”实现其与核苷酸寡链的3-末端或3′和5′-末端连接,这种标记物非常稳定,且由于分子量小(~1000),可实现一分子蛋白标记多个[Ru(bpy)3]2+。[Ru(bpy)3]2+电化学发光过程如下:

[Ru(bpy)3]2+和三丙胺(TPA)分别在阳极表面氧化成[Ru(bpy)3]2+和TPA阳离子自由基(PT A+)?,(PT A+)?迅速脱去一质子形成三丙胺自由基TPA?,TPA?具有强还原性,从而把[Ru (bpy)3]3+还原为激发态的[Ru(bpy)3]2+3;后者发射一个620nm的光子回到基态,再参与下一次电化学发光,只需0.01ms就可发出稳定的光,300ms 达到最高峰,每秒几十万次的循环电化学发光大大提高了分析的灵敏度。另外,通过电极反应在线制备了不稳定的发光剂[Ru(bpy)3]3+和TPA?,避免了由于化学激发剂不稳定对分析测试的影响。

电化学发光免疫分析的突出优点是:(1)标记物非常稳定,(2)灵敏度高,(3)光信号线性好,动力学范围宽,超过6个数量级,(4)可重复测量,重现性好,(5)可实现多元检测,(6)可实现均相免疫分析,(7)快速,完成一个样品的分析通常只需18min,(8)可实现全自动化。由于电化学发光免疫分析具有优越性,是一种很有发展前途的免疫分析法,日益受到人们的重视。目前已广泛应用于抗原、半抗原及抗体的免疫检测,尤其是应用于PCR技术作DNA探针杂交分析和基因分析有它独特的优点。Bochringer Mannheim的Elecsys○R免疫分析系列商品药盒是采用[Ru(bpy)3]2+/TPA EC LI A System。

电化学发光亦可用于均相免疫分析:由于抗原-抗体结合物与游离的非结合物的立体结构不同,扩散系数差别很大,因而游离的标记物与结合物在电极作用下,两者形成电子激发态的机率差别很大,游离部分相对结合部分可忽略,因而不需要分离结合部分与非结部分而进行均相免疫分析,例如据Loranelle L报道,用均相电化学发光免疫分析TSH,检测限为0.04mI U/L。

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(范振符编委审 陈泮藻编辑)

收稿日期:2001-10-26;修回日期:2002-03-03

白细胞介素-8的临床意义

杨小翠,王永堂,刘玉泉

(陕西省安康市中心医院内科,陕西安康725000)

白细胞介素-8(interleukin -8,I L -8)是近年由多家实验室发现的细胞因子;曾有不同命名:如中性粒细胞激活蛋白(NAP -1),白细胞粘附抑制因子(LAF ),T 淋巴细胞趋化因子TCF )。I L -8在炎症因子I L -1、T NF 及脂多糖刺激下由多种细胞合成表达。内皮细胞、T 淋巴细胞、肺泡巨噬细胞、肝细胞、滑膜细胞、成纤维细胞和中性粒细胞等均可产生I L -8,其中以血单核细胞产量最为丰富。基因工程I L -8由72个氨基酸组成,分子量为8kDa 。I L -8主要功能是对中性粒细胞、T 细胞和嗜碱性粒细胞的趋化作用。嗜中性粒细胞与I L -8接触后可发生形态变化,定向游走到反应部位并释放一系列的活性物质。这些作用可导致机体局部的炎症反应,达到杀菌和细胞损伤的目的。由于I L -8对白细胞的趋化作用,表现在许多感染

性疾病过程中出现升高的趋势,因此通过测定人外周血、尿液或细胞培养上清中的I L -8水平,可作为炎性疾病的临床诊断指标[1],现分述如下。

1 I L -8水平与心血管疾病的关系

为进一步探讨冠心病的病因及防治措施,观察了50名正常人组和50例冠心病组患者血清中I L -8的含量,结果冠心病组血清I L -8水平(371.20±181.09pg/m L )显著高于正常人组(38.41±28.52pg/m L )。其中14例经皮冠状动脉腔内形成术后血中I L -8水平明显低于术前(P <0.01),并且冠状动脉狭窄程度与血中I L -8含量呈正相关(r =0.9725)。这说明I L -8与冠状动脉狭窄程度及病情变化有密切关系[2]。观察了急性心肌梗塞(AMI )组26例患者I L -8动态变化与静脉溶栓疗效的关系,结果是AMI 患者在症状发作后24h 内测出I L -8,随后迅速消失。I L -8水平随AMI 范

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