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【Nanoscopy技术篇I】受激发射损耗显微术（STimulated Emission Depletion，STED）
2015-12-02DannyChen Nanoscopy Nanoscopy
在这个系列里，小编将介绍主要几种常用的超高分辨显微技术，其中包括：（1）受激发射损耗显微术（STimulated Emission Depletion，STED）；（2）光敏定位显微镜（PhotoActivated Localization Microscopy, PALM）以及随机光学重建显微镜（STochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）；（3）结构光学显微镜（Structured-Illumination Microscopy, SIM）；（4）光学涨落超分辨成像技术（Superresolution Optical Fluctuation Imaging，SOFI）；等等。
提到荧光超分辨显微成像，不得不提的一个人便是下面这位大牛Stefan Hell了，一看照片就知道他有多么聪明（jue ding）了：），他&他的团队在超分辨显微发展史上起到非常重要的作用！
由于小编白天还要做自己的超分辨成像实验，偷个懒引用一下以下《超高分辨率显微镜：显微镜发展史上的新突破》（https://www.wendangku.net/doc/a315926135.html,/news/show/11786.html）以及《STED 显微镜：超高分辨不再是梦想》（https://www.wendangku.net/doc/a315926135.html,/archives/24042）中的部分内容：
Stefan Hell打破了物理学界的传统看法
自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。
1994年，Hell在《光学快报》（Optics Letters）上发表了他关于STED的理论文章。不过直到多年以后，这项理论才得以在实践中被证实。在那段时间里，Hell一面继续研究工作，一面四处奔走筹集科研经费，还卖掉了他4Pi 显微镜的专利。
但是那个时候Abbe的衍射极限理论仍然在学界占统治地位，许多物理学家对Hell的理论都持怀疑甚至批评态度，因此他们也都将研究重点放在其它的成像技术上。尽管如此，Hell 还是在1997年与马普生物物理化学研究所签订了一份长达5年的合同，以继续他的STED 研究。
1999年，Hell将他的研究成果分别投给了《自然》（Nature）杂志和《科学》（Science）杂志，不过都被退稿。当时两位杂志的主编都没有意识到他的研究成果将会改变整个显微镜领域。
直到2000年，事情才终于有了转机——《美国国家科学院院刊》（PNAS）发表了Hell 的科研成果。采用Hell的STED技术，人们第一次得到了纳米级的荧光图像。Hell的工作由此获得了广泛的肯定，2002年，他获得了马普研究所的终身职位。从此，Hell一直在马普研究所从事成像技术的研究工作。
受激发射：超越阿贝极限的关键
什么是受激发射呢？在前面我们提到，当一束蓝光照射进来时，电子吸收了它的能量，从“五层”也就是自己的基态，跳到了“六层”——激发态。当电子正要将身上多余的能量以绿
产生荧光的光斑尺寸虽然大于阿贝极限的200纳米（左），但是与产生受激发射的环形光斑叠加后，
荧光的光斑尺寸大大减小（右）。
STED显微镜（右）可以获得比传统的光学显微镜（左，此处展示的是荧光共聚焦显微镜得到的图像）
更高的分辨率。
Tweezers），双光子成像（Two-photon），荧光相关光谱（FCS），等等。当然，它还有其他一些优势，例如：（1）在小视野下具有较高的时间分辨率；（2）较深的成像深度（需使用近红外STED光波长配合双光子激发）；（3）其分辨率与STED光功率有关，因此对于荧光材料而言，可以通过无限增加STED光功率来获得更高的空间分辨率（小编在此不考虑光漂白这一因素）；（4）可以实现in vivo 活体小鼠脑成像；等等。
当然，小编也要告诉大家一些STED技术的缺点，例如：（1）STED光功率太大，导致荧光蛋白，染料等fluoresphores快速漂白掉，同时也不那么适合活细胞成像（当然一种STED 技术的衍生物－基于荧光开关蛋白实现的RESOLFT技术相对更加适合活细胞成像）；（2）STED技术一般基于点扫描实现，因此与其他超分辨技术相比而言，其在视野或者通量上并不占据优势；（3）虽然STED技术无需算法重构，但是对光子是一种浪费的过程，因此如果要获得更连续，更高信噪比的图像，跟反卷积图像算法相配合效果更佳；（4）系统搭建挺复杂，且价格并不那么亲民；等等。
因此，小编的建议是：Application－based原则，选择STED适合的科学问题，取其所长，避其所短！
［P.S.］目前，我国有多个课题组在开发和发展STED显微技术，据小编所知，有例如北京大学，浙江大学，中科院化学所，中科院苏州医工所，福建师范大学等实验室。当然，也有多个显微镜公司出售STED显微镜，例如Leica, Abberior, PicoQuant等。根据小编的实验经历而言，小编曾使用过Leica TCS SP8 3X，对于小编的实验而言，亲测好用！