线虫RNA干扰的基因沉默

线虫RNA干扰的基因沉默

一、实验背景及目的

1、RNA干扰（RNAi）是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中，RNA干扰因为简单快速成为研究基因功能的有效手段。

2、秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约1mm，直径70um，由959个细胞组成。它具有生活周期短、易培养和保存等优点。秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。其基因组大小为80Mb，包含13000个基因。

秀丽线虫在20℃时生活周期为3.5天，25℃时约为3天，15℃时约为6天。受精卵经过胚胎发生孵化出L1、L2、L3 、L4，最后成为成熟的幼虫。当食物缺乏或群体密度过大等环境不良的条件时，L2会不进入L3而成为dauer幼虫来抵御不良环境，当环境恢复后dauer幼虫不经过L3直接进入L4。因此可以利用该特性保存线虫品系。

3、RNAi是一种基因knock down 技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA 通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。当线虫以此大肠杆菌为食时，他们就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。

4、本实验将利用表达tag--214dsRNA大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag--214基因功能以及观察实验效果的目的。

二、实验材料及试剂

1、材料：

1）秀丽线虫（C.elegans）rrf-3突变体（RNAi敏感型）

2）大肠杆菌（E.coli）野生型菌株OP50

3）带有tag-214发夹结构质粒的HT115菌株。

2、试剂：

1）NGM普通固体培养基

2）含有Amp+和IPTG的NGM固体培养基（用于RNAi）

3）LB培养基

4）M9缓冲液

三、实验操作

由于此次试验培养基配制以及大肠杆菌培养等的前期过程是由两个大组分别进行的，我询问了第二大组的实验相关步骤，但还是会有纰漏，所以有些实验过程和实际的操作会有差错，有些细节也会省略。

1、配制NGM固体平板，M9缓冲液，LB培养基

具体配制所需要的成分和用量在实验书上均有，需要在比例和一些操作上多加注意。

1）NGM普通固体平板每组需要配制500ml（实际上配少了），其中的细菌蛋白

胨为peptone。胆固醇以及磷酸钾缓冲液要在其他组分混合并且高温灭菌之后加入，统一倒平板，放置20h左右至表面干燥。

2）LB培养基中的胰蛋白酶冻是typtone，我们每组配制了500ml，121℃高压蒸汽灭菌。

3）Amp+为200mg/l tet+为100mg/l IPTG为1Mm ,均需要抽滤之后放入离心管中。

4）第二大组配制LB培养基（Amp+ tet+）NGM固体平板（Amp+）IPTG浓度为4mM。

2、大肠杆菌的培养

1）在NGM普通固体平板上划线培养大肠杆菌OP50

2）在NGM固体平板（Amp+ tet+）上划线培养大肠杆菌HT115(对照组和实验组)

3、大肠杆菌的活化

1）大肠杆菌OP50的活化：挑取少量的大肠杆菌OP50到LB普通液体培养基中，37℃振荡培养20h。之后铺到NGM普通固体平板。

2）大肠杆菌HT115的活化：挑取少量的大肠杆菌HT115(对照组和实验组)到LB 培养基（Amp+ tet+）中，37℃振荡培养20h。

3）大肠杆菌HT115的再活化：吸取1mL的大肠杆菌HT115(对照组和实验组)到LB培养基（Amp+ tet-）中，37℃振荡培养20h。之后铺到NGM固体平板（Amp+ tet+）上。

4、rrf-3突变体的培养：

将线虫rrf-3突变体接种到含有大肠杆菌OP50的NGM普通固体平板上，20℃培养。

5、线虫扩繁（用到chunck）

选择线虫rrf-3突变体培养基中未受到污染而且线虫长势较好的部分切下一小块(手术刀蘸酒精，酒精灯烧，重复三次)，接到大肠杆菌OP50的NGM普通固体平板上。20℃培养（由于线虫长势问题，培养了接近三天）

6、线虫生长周期的同步化

1）取3mL的M9缓冲液加入到线虫rrf-3突变体的NGM普通固体平板，反复轻

轻地晃动平板，将平板上的线虫冲洗下来，然后将含有线虫的M9缓冲液转移到15mL的离心管中。

2）向离心管加入2mL的Naclo溶液和1mLNaOH(5mol/L)溶液，之后马上盖紧盖子剧烈晃动离心管。当发现溶液中的线虫身体呈现弯曲状，并且还没有出现絮状物时，加入M9缓冲液至15mL以终止反应。3000r/min离心1min。

3）弃上清，加M9缓冲液至15mL，3000r/min离心1min，重复。

4）弃上清，小心吹打沉淀，并将沉淀滴入未铺菌的NGM普通固体培养皿中央，20℃培养16-20小时。

7、收获L1幼虫及chunck

1)培养16-20h后，NGM平板上的线虫发育成L1幼虫。取500uL的M9缓冲液冲洗平板中的线虫，并将冲洗下的L1幼虫放到1.5mL的离心管中。将L1幼虫平均分为两份，分别接到大肠杆菌HT115(对照组和实验组)的平板中。20℃培养。

2)将培养线虫的培养基选择无污染且线虫长势较好的部分切下来一小块，接到OP50平板上，对照组和实验组分别接1个大板，普通的小板两个（培养线虫留着做后续的实验的）。

8、Single worm（挑单个虫）

睫毛依次蘸取Naclo 、70%乙醇、无菌水/M9缓冲液，在显微镜下分别挑取实验组和对照组的线虫，分别放在两个含有OP50的NGM固体培养板上，每个平板里两只线虫（我们有的平板里会多挑取一只）。

9、观察RNAi的表型和效率

第二天在显微镜下观察并且对实验组和对照组平板内的卵进行计数。

四、实验结果

这是我们计数得到的结果

对照组实验组

1 2 1 2

虫卵数35813 1

接虫数2322

虫卵数/接虫数17.527 1.50.5

我将对照组和实验组的虫卵数/接虫数取了平均值，并运用EXCEL做成了柱状图进行明显的比较。

五、结果分析

从数据以及图标结果看来，对照组平均产卵比例远高于实验组的产卵比例，说明tag--214基因有控制线虫产卵的功能，当这种基因被沉默掉后，线虫的产卵率明显下降，另一方面也说明此次的RNA干扰实验做的比较成功，得到了与理论相一致的结果。但是在实验过程中，我们也出现了一些问题，包括有平板的杂菌污染，最后得到的去做RT-PCR的菌也较少，所以，在下面，主要对这些细节错误以及过程中的注意事项进行分析：

1、在实验过程过需要配制的试剂以及其它溶液要根据配方和用量，按照一定比例配，在秉着不浪费的前提下可以多配制一些，以备不时之需。

2、在对大肠杆菌或者线虫进行培养或者操作的时候，一定要在超净台，而且不要通过其他方式造成污染。在后面chunck的时候，由于好多平板上都被污染，干净的平板已经不够了，所以我们最后缺少的平板只能挑选污染最小用，这也给我们后来的实验造成了很大的干扰，因为污染并没有排除，而是越来越重，导致培养的线虫不能用。

3、冲洗L1幼虫并分板培养的时候，尽量把幼虫的量平分，否则有的板长出来的虫多，有的少，而我们虫多的平板被污染了，所以后面RT-PCR的线虫是使用老师提供的线虫进行的实验。

4、在挑取线虫的时候，睫毛要按照顺序依次蘸取Naclo 、70%乙醇、无菌

水/M9缓冲液，顺序不要错也不要落下，最后在计数的时候可以选择在平板表面进行十字划线计数法，这样计数可以简单方便一些。

RNA的提取、鉴定以及RT-PCR

一、实验背景

1、RNA的制备是通过cDNA途径克隆目的基因，了解基因在不同的组织或细胞中的表达水平，以及研究基因转录调控等必不可少的实验技术。RT-PCR是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链扩增相结合的技术。

2、本次试验利用Trizol法提取RNA ，Trizol的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可以裂解细胞，促进核蛋白体的解离，并将RNA释放到溶液中；苯酚会使蛋白质变性，加入氯仿后可抽提苯酚，促使RNA进入水相。

3、RNA是一类极易被降解的分子，因此要得到完整的RNA必须要最大限度的抑制提取过程中内源或者外源的RNA酶活性。提纯得到的RNA可以使用非变性和变性凝胶电泳进行检测。非变性RNA凝胶电泳可避免使用有毒的物品，但是由于RNA分子相互作用形成大量的双链结构，故无法判断RNA的相对分子质量。在完全变性的条件下，RNA分子完全伸展，其电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子相对分子质量时，一定要用变性凝胶。

4、在总RNA分子中以rRNA最多，占80%-85%，完整为降解的RNA分子的电泳图谱可以清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三条带。如果28s和18s 条带明亮，条带边缘清晰，且28s条带的亮度是18s条带的两倍以上，则认为RNA没有被降解。经过鉴定未降解的RNA分子可通过RT-PCR反应对某一特定的基因进行扩增。RT-PCR反应由两部分组成，首先是以RNA为模板合成cDNA，然后以cDNA为模板通过PCR扩增目的片段。用于逆转录的引物有随机引物、Oligo dT以及基因特异性引物。Oligo dT适合具有polyA尾巴的RNA，不能用于原核生物的RNA，真核生物的rRNA 和tRNA等。

5、本实验的目的是以线虫为实验材料，通过提取总RNA，利用RT-PCR技术扩增线虫的acting 基因的片段，学习并掌握RNA提取和鉴定，以及RT-PCR反应的基本原理和实验技术。

二、实验材料与试剂

1、实验材料：秀丽隐杆线虫野生型N2

2、实验试剂：Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、琼脂糖、DNA上样缓冲液、RT试剂盒，Premix Tap酶。

三、实验操作

一）RNA分子的提取

1、2 mL M9溶液1500 r/min，离心1 min收集线虫；将虫体转移到无RNA酶的研钵中，加入液氮研磨。其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。

2. 收集研磨的粉末，按50~100 mg组织/mL Trizol 加入Trizol，室温静置5 min。

3. 12,000 r/min 4 ℃离心10 min。

4. 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀)。

5. 加入氯仿（200 μl氯仿/mL Trizol），盖紧管盖，用力震荡15秒，再室温静置3 min。

6. 12,000 r/min 4℃离心10 min。

7. 从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中。

8. 向上清中加入异丙醇（500 μL异丙醇/mL Trizol)，上下颠倒充分混匀后，室温静置10 min。

9. 12,000 r/min 4℃离心10 min。

10.小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l mL，轻轻上下颠倒离心管，12,000 r/min 4℃离心5 min后，小心弃去乙醇。

11.室温干燥沉淀2～5 min后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。

12.待RNA沉淀完全溶解后进行RT-PCR反应。

二）通过甲醛变性凝胶电泳鉴定提取的RNA

这一部分是老师为我们完成的，具体的操作步骤就是按照ppt上的来看的。

1.将电泳槽和制胶用具在0.3% H2O2中浸泡30 min，取出后用DEPC水冲洗并晾干。然后用75%乙醇冲冼一遍，晾干备用。

2．配制琼脂糖凝胶：

（1）称取0.5 g琼脂糖，置干净的100 mL锥形瓶中，加入36 mL DEPC水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。

（2）胶冷却至60~70 ℃后，依次向其中加入9 mL甲醛、5 mL 10MOPS缓冲液和3 μL溴化乙锭（1g/L），混合均匀。

（3）倒入已放置好梳齿的胶板内，于室温放置30 min以上使凝胶凝固。凝胶凝固后，小心取出梳齿，将胶放入电泳槽中，加入1×MOPS 缓冲液使凝胶刚好浸没。

3．样品准备：

（1）取DEPC处理过的500 μL小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2 μL、甲醛3.5 μL、甲酰胺（去离子）10 μL、RNA 样品4.5 μL，混匀。（2）将离心管置于60 ℃水浴中保温10 min，再置冰上2 min。

（3）向管中加入3 μL上样缓冲液，混匀。

4．上样：

将上述处理好的样品依次加入凝胶的各加样孔中。

5．电泳：

将样品加入加样孔后，以3~4 V/cm电压降电泳，当溴酚兰移动到胶的3/4处停止电泳。

6．检测和分析：

电泳结束后，在紫外灯下检查结果。

三）RT-PCR反应

1. 逆转录RT反应

（1）取3 μg RNA ，2μgOligo dT至eppendorf 管中，70 ℃10 min，高速离心5 sec 后置于冰上，目的是打开RNA的二级结构；

（2）按下列顺序在一新管中加入以下试剂（20 μL体系）：

MgCl2（25mmol/L） 2.4 μL

5×Reverse Transcription buffer 4 .0μL

dNTP mixture（10 mmmol/L） 1.0μL

Recombinant RNasin RibonuClease inhibitor 1.0μL

AMV Reverse Transcriptase 25 U/μL 0.6 μL（15 U）

RNA 1 μg 用RNase-free ddH2O补足至20 μL

（3）反应过程：25℃ 5min ,42℃ 1h ,70℃ 15min ,4℃放置继续或者—20℃保存。

2. PCR反应（反应体系为25uL）

Premix Ex Taq 12.5 μL

Sense引物(10 μM) 1 μL

Antisense 引物(10 μM) 1 μL

cDNA 5uL(稀释5倍)

用ddH2O补足体积至25 μL

PCR反应条件为：

94 ℃1 min

94 ℃30 sec

55 ℃1 min

72 ℃30 sec（从94 ℃30 sec至此步骤重复30次）

72 ℃5min

3. DNA琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR实验结果。

四、实验结果及分析

本次实验结果主要是根据RNA和DNA电泳结果来判断成功与否的。所以在接下来附上电泳结果。

电泳结果图：

1、RNA甲醛变性凝胶电泳鉴定图

2、DNA琼脂糖凝胶电泳检测图

五、实验结果分析

一）RNA甲醛变性凝胶电泳鉴定图

在电泳图中与MAKER条带对比可以发现三条条带，由远及近分别为18srRNA、18srRNA、5srRNA。其中，5srRNA含量少，所以条带较暗，很不清楚；18srRNA、28srRNA条带均很亮，条带边缘比较清晰，而且28srRNA条带的亮度可以达到18srRNA条带亮度的2倍，说明我们组提取的RNA没有被降解。但是在上样孔处有一条暗暗的条带，查阅资料说，上样孔处如果有条带，说明有DNA污染。整个组基本上都存在或明或暗的条带，但是从后面的结果来看，其他大多数组都没什么影响，只有我们组出现了一条杂带，所以，我认为，少量的DNA污染对实验结果的影响较小。不过，不能排除影响的存在，所以在RNA沉淀以及沉淀分离的过程中一定要多加注意，要把上清弃的干净些，否则稍有的才能留可能会造成很大的影响。

二）DNA琼脂糖凝胶电泳检测图

我们是第一大组第四小组，从最后的实验结果来看，我们组确实获取到了RNA，逆转录得到了cDNA,因此也在PCR之后扩增得到了Acting 的基因片段。但是，唯一的缺憾是，我们的电泳条带中竟然多出了一条较清晰明亮的杂带，第3小组也有，但是亮度很暗，我也看了第二大组的结果，未出现相同的状况。

通过在网上查阅资料，分析在该过程中出现杂带的原因：1、内参引物的特异性不好，可能是非特异性扩增导致。2、反转的cDNA里面含有较多的基因组DNA，可能是RNA提取质量不到位导致，碰巧这对内参引物横跨了内含子，从而导致PCR出现2条带。加上之前RNA 点用的结果，整体分析，我觉得出现杂带的原因是之前RNA提取的不到位，含有少量的DNA ，在整个过程中，大家所添加的引物都是相同的，所以，应该不会产生非特异性扩增，在之前的RNA电泳结果中，我们组的上样孔处有杂带，是有DNA污染的迹象。不过，其他组的RNA电泳结果也存在DNA污染，最终的DNA电泳结果却未出现杂带，排除宏观因素，如果是在我们添加引物的时候我们出现问题，添加过少、之后未被混匀等的因素，也是有可能。

六、实验注意事项

1、由于RNA酶是极易被降解的，所以整个过程一定要带手套和口罩。而且用试剂的时候一定要仔细看好了，在添加的时候一定要添加去RNA酶的等经过处理的。

2、在加入异丙醇沉淀RNA要混匀，使RNA充分沉淀，弃上清，要干净，再加入乙醇后，也要充分混匀并将上清弃的干净，否则若残留DNA，对后面实验的会产生影响。

3、提取到的RNA要待RNA沉淀完全溶解后再进行RT-PCR反应。

4、其余步骤主要按照实验书和老师授课的认真做。

七、思考题

1、如何防止提取过程中RNA的降解？

1）尽量避开RNA专用操作区，离心机、移液器、试剂等均专用，并保持清洁。2）操作过程中应始终戴一次性PE手套，并经常更换，戴口罩避免交谈。

3）尽量使用一次性已去除RNA酶的塑料制品、吸头、离心管等以防交叉感染。4）配制用的酒精、异丙醇、TRIS等应采用未开封的新瓶。

5）玻璃和金属器皿需要180℃干烤6-8h。

2、提取的RNA 有什么应用？

1）逆转录形成cDNA，PCR扩增后可用于基因工程。

2）成为dsRNA，用于RNA干扰技术。

3、确定RNA质量的方法有几种？

1）检测RNA溶液的吸光值

A260/280=2 时为纯的RNA

A260/280=1.8时为双链DNA

A260/280>2.2,时RNA已水解为单核酸

2）RNA电泳图谱：变性凝胶电泳，与Maker进行对比。

RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法

RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法 RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默[1]。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi 具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)[2,3]。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。 1.RNAi的作用机制 目前关于基因沉默的假说认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效应阶段和倍增阶段。 1.1起始阶段 外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入双链核糖核酸(dsRNA)，在细胞内特异性与RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸内切酶) Dicer结合，dsRNA被切割成21~23nt 长度的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA，即小干扰RNA(siRNA)。 1.2效应阶段 双链siRNA可以与含Argonauto（Ago）蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。在A TP供能情况下，激活的RISC 将siRNA的双链分开，RISC中核心组分核酸内切酶Ago负责催化siRNA其中一条链去寻找互补的mRNA链，然后对其进行切割。反义链先与同源mRNA配对结合，然后RISC在距离siRNA 3'端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默[1]。 1.3 倍增阶段 siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA，可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。并作用于靶mRNA。如此反复倍增，从而使RNAi的作用进一步放大。因此少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果[4]。2.RNAi的设计及合成

RNA干扰设计

什么是siRNA和RNAi 双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。 RNAi技术发展历程 1998：植物基因中基因沉默现象的发现 2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现 2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一 2003：动物体内观察到RNA干扰作用 2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展 2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND 2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND 2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果 2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破 2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家 2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估 截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验 RNAi 2006诺贝尔医学奖述评 ——年轻的获奖者—— 2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制，解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。 —— RNAi的殊荣—— 2001年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的RNAI掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年以后的今天，Andrew Fire和Craig Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见RNAi在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。 —— RNAi的机制——

RNA干扰综述

RNAi研究及其进展 公光业M110107259 前言 RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。本文综述了该研究的最新进展。正文 RNAi的发现： 上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现

象称为消除作用(quelling或基因压制)。 1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R- NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。 RNAi作用机制: 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作

RNA干扰技术的原理及应用

RNA干扰技术的原理与应用 RNA干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。 1 RNAi现象的发现及发展 1995年, Guo等用反义RNA阻断秀丽新小杆线虫的part 1基因的实验中发现, 正义和反义RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义RNA技术的解释相反。1998年2月卡耐基研究院的F i re 等将双链RNA ( double stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的mRNA发生了降解,证实高度纯化的ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链RNA至少高2个数量级,首次揭示了Guo等遇到的现象,即为RNAi。 随后研究发现, RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。 在短短几年中,对RNAi的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功

应用RNAi技术抑制基因表达, 开创了RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小组首次报道了应用RNAi 技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组siRNA文库新技术和应用基因组siRNA文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量RNAi研究。这些研究成果愈来愈表明, 生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相当一部分RNA。 2 RNAi的作用机制 细胞中ds RNA 的存在是RNAi形成的先决条件。ds RNA可以通过多种途径在细胞核或细胞质中产生。通过对RNAi所进行的遗传学和生物化学的研究,现已初步阐明了其作用机制。RNAi的作用机制可分为三个阶段:起始阶段、效应阶段和级联放大阶段。起始阶段:由RNA 病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生的ds RNA分子在细胞内被一双链RNA酶!型内切酶也叫Dicer酶或Dicer核酸酶同源物剪成21~ 23 nt siRNA, 3’ 端带有2个碱基突出的黏性末端, 5’ 为磷酸基团,此结构对于siRNA行使其功能非常关键。剪切位点一般在U处, 具特异性。效应阶段: RNAi特异性的核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶、辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与siRNA结合成RNA诱导沉默复合体R I SC ( RNA inducing silence complex , R I SC)识别靶mRNA,其中的反义

RNA干扰作用机制

RNA干扰机制主要分为两个阶段： 1：RNA干扰的启动阶段，即RNA核酸酶与双链RNA结合，并把它酶切成为多段大小为21~25个碱基对的小RNA片段（siRNA）。 2：RNA干扰的效应阶段，即siRNA与一种多聚核酸酶复合物，RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合，并通过驾驭RISC到相应的mRNA位点，随即RISC执行RNA干扰的效应功能，酶切降解mRNA，使转录的基因表达终止。 第一步：双链RNA加工成为siRNA 参与该反应的酶是Dicer蛋白复合物，具有结合和酶切双链RNA的活性，与双链RNA结合的区域位于Dicer的羧基末端 第二步：siRNA的扩增 siRNA能通过细胞内的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的作用，以RNA干扰起源的双链RNA分子，或者以目标mRNA分子作为模板，合成出新的双链RNA分子，再通过Dicer的加工作用，产生出大量的siRNA，补充细胞内消耗和降解的siRNA分子。这种现象称为siRNA的扩增。 第三步：降解目标mRNA 在这一阶段，从双链RNA切割下来的siRNA与一种RNA干扰的特异蛋白复合物结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物（RISC）。该复合物在A TP存在的条件下被激活，siRNA解链，留下反义链导向RISC与目标RNA互补结合，并酶切目标RNA分子，完成RNA干扰的过程。酶切位置常常在siRNA双链的中间部位，故，若siRNA链中间的碱基与目标不符，则会影响siRNA的沉默效应。 siRNA与RISC复合形成一种小干扰核糖蛋白粒子（siRNP） RISC与Dicer的异同点 两者都具有RNA酶活性，但是它们的作用底物不同，前者常常针对单链RNA分子，而后者则是针对双链RNA分子；另一方面，它们的酶切方式和产物也不同，前者属于RNA 的外切酶，而后者则是RNA的内切酶 另外，一些RNA干扰效应阶段的mRNA降解物，反过来可以作为RdRP的模板，合成双链RNA分子，加入到RNA干扰的启动阶段，从而放大RNA干扰的作用。

百度百科RNA干扰

RNA干扰 科技名词定义 中文名称：RNA干扰 英文名称：RNA interference;RNAi 定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA 被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科） 定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 RNA干扰模式图 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 目录

简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 展开 编辑本段简介 近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 编辑本段发现 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 RNAi实验图片 中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA（sense RNA）和反义RNA均能 有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。

RNA干扰

RNA干扰 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链RNA(doublestrandedRNAs，dsRNAs)引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 1.作用机制 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应， 其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA 结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi 的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。 怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。 研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。 RNA干扰现象的机理[8] RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA 复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解[9][10]。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分

RNA干扰iRNA技术及其应用

RNA干扰iRNA技术及其应用 摘要：RNA干扰(interference RNA，iRNA)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。RNA具有特异性和有效性。iRNA技术作为功能基因组学强有力的研究工具，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变。随着对现代分子生物学研究的发展，该技术的应用领域逐步扩展到医学，农业，林业，渔业，畜牧等多个领域，具有巨大的科研，经济和社会价值，本文主要论述RNA干扰技术在医学领域方面的应用。 关键字：RNA干扰转录后基因沉默RNA 诱导的沉默复合物 正文：今年来，对RNA干扰技术的研究已经成为热点，预测未来10年间最后可能出重要成果的领域之一，并被《Science》评选为2002年度最重要科技突破的首位。RNA干扰技术之所以有如此重要的地位，与其运用到的领域有关。21世纪初，人类完成了基因组计划，破译人类全部的遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面认识自我。因此，很多疾病的病因也将揭开神秘的面纱，这位这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。因此，利用RNA干扰技术抑制基因组的基因表达的技术手段，有可能在基因治疗方面开辟一条心的途径，克服医学上许多疑难杂症，例如，病毒性疾病，肿瘤心血管疾病和遗传性疾病。 1.RNA干扰的发现:首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans的研究。1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。这个奇怪的现象直到3年后才被解开。1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默，该小组将这一现象称为RNA干扰。现在RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞，这种情况揭示了iRNA现象很可能出现于生命进化的早期阶段。后来在果蝇细胞中的实验进一步揭

RNA干扰实验技术相关探讨

文章编号： 06-（2004）063002101-10 中图分类号：Q344 中国生命科学论坛分子生物学版精华 RNA干扰(RNAi)实验技术相关探讨 马志杰 (maziwise) 编写小瘪修改 (中国生命科学论坛分子生物学版第1版主 ) [责任编辑：TILS007] 摘要：RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA所引起的序列特异性基因沉默。它是真核生物中基因转录后沉默作用的重要机制之一。RNAi技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。本文就其作用机制、基本实验程序及注意事项作了较详细的综述，对其存在的相关问题和前景亦做了展望。 关键词：RNAi；siRNA；转染 小RNA作用与应用研究继2001，2002连续两年被美国Science杂志评为年度10大突破技术以来，近年来继续热度高涨，名列前矛。其核心技术RNA干扰（RNAi），即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，不仅如此，它还为基因治疗开辟了新的途径。此外，RNAi沉默机制的探索也取得了相当的进展。目前，在大致勾画出生物体内源性小RNA的重要作用框架后，进一步阐述其作用细节、探索小RNA对细胞行为的调控、如何利用RNAi进行疾病防治等等都成为生物学家研究的一大热点。 1、RNAi的作用机制

通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA 片段(small interfering RNAs， siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer的酶，是RNase III家族 中特 图1、RNAi的作用机制 异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理见（图1）： 2、RNAi基本试验程序及注意事项 2.1、siRNA的设计 2.1.1、目标序列的筛选