转基因小鼠肿瘤模型的研究进展
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展
沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏
[摘要] 动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。
[关键词] 肿瘤，小鼠模型，转基因
肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。
1.常规转基因（transgenic）
上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌W AP-Tag 转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白W AP
启动子和SV40 大T 抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA 突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML) 的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl 和crkl 双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl 参与了bcr-abl 所致的白血病。尽管相关的研究已经很多，然而常规转基因本身固有的缺陷如基因拷贝数的不可控性（因为是在小鼠胚胎时期植入转基因，所以无法知晓其复制的数目）以及转入的基因整合在宿主基因组的位点随机性增加了其表型分析的难度，因此现在已较少单独采用常规转基因技术来制作肿瘤动物模型。
2．可诱导表达的转基因（inducible transgene expression）
常规转基因技术通过特定启动子的选择实现了转基因的组织特异性表达，在此基础上，人们又开发了许多可诱导表达模型用以调控基因表达的时相。目前，最常用的是反式因子rtTA与四环素衍生物强力霉素结合后激活四环素操纵子表达的方法（tet-on），而tTA与强力霉素结合则起抑制四环素操纵子表达的作用7（tet-off）。这样，tet-on转基因小鼠可以通过摄入四环素的方法激活癌基因的表达；tet-off转基因小鼠则持续表达癌基因，直至因强力霉素的摄入而被特异性抑制。应用此系统已构建了可诱导性Hras-G12V小鼠黑色素瘤8,c-myc可诱导表达T细胞淋巴瘤9等肿瘤模型。Fisher等10利用四环素诱导系统建立了在肺细胞定向表达、带有K-Ras4b(G12D)癌基因的小鼠模型。在此种转基因小鼠饮食中加入强力霉素，诱导癌基因K-Ras表达，7天后肺细胞增生，2个月后小鼠肺组织中相继形成腺瘤、腺癌，并向胸膜扩散。撤去强力霉素后，K-Ras mRNA 水平急剧下降, 增生细胞和肿瘤细胞凋亡，3天后肿瘤肿块迅速缩小，1个月后检测不到肿瘤组织。
四环素诱导系统的优点在于可以对转基因的表达进行精确的调控，转基因的表达呈四环素药物剂量依赖性反应并可具有组织特异性，而只须停止给药就可恢复到对照条件。
3．基因打靶或基因删除(gene targeting)
从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。1981年Evans11等从小鼠胚胎中成功分离得到胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES)，即从着床前胚胎(孕3～5天)分离出内细胞团(Inner cell mass，ICM)细胞并摸索出维持其全能性的体外培养条件，在此基础上建立了胚胎干细胞技术。1984年，Bradly等12成功应用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。随后不久，同源重组现象被发现并很快用于内源性基因的精确修饰。1987年，Utah大学Kirk13领导的研究小组根据同源重组的原理，实现了导入外源基因的定点整合，这一技术称为“基因打靶”。
基因打靶是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因目的的一种技术14。1988年，Mansour等15通过建立一套正负双选
择标记系统（PNS）来筛选基因组内同源重组正确发生的ES细胞克隆。该载体上含有正负选择基因各一，正选择基因为neo基因（neomysine），位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达；负选择基因为HSV-TK基因（herpers simplex virus-TK），在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端。同源重组时，TK基因将被切除而丢失，而在随机整合时，所有的序列（包括TK）均保留。（图1）当加入G418和GANC后，HSV-TK由于表达的胸苷激酶可使GCV（ganciclovir）转变为毒性氨基酸，使含此基因的转染细胞死亡。同源重组后，因HSV-TK基因位于构建的打靶载体目的基因同源序列之外，所以可用GCV来筛选随机整合的阳性克隆细胞。因此经过正负双选择系统的筛选可得到同源重组已发生的阳性克隆细胞。
图1 正负双选择标记系统基因打靶技术的出现为在体内研究抑癌基因的功能提供了可能。基因敲除或称基因打靶，对象是胚胎干细胞（ES），注入ES细胞的基因片段与靶基因发生同源重组后可使该位点上的一个等位基因发生突变，携带有突变的等位基因的ES细胞重新注射到正在分裂的囊胚中，再移植到假受孕体鼠，其F1代产生的是嵌合体小鼠，近交F2代中就会产生纯合子后代。利用此方法，最先建立的抑癌基因动物模型是p53-/-小鼠16。P53-/-小鼠自发肿瘤发生早，且经化学致癌物诱发的肿瘤生长速度明显加快，这些结果提示p53具有抑癌功能。除p53基因外，相继建立的抑癌基因剔除小鼠模型还涉及Rb、Apc、Nf1和Nf2、Brcal和Brac2等基因17。p21、p16、p15等抑癌基因的突变也与多种恶性肿瘤的发生有着密切的关系，黑素瘤就是其中之一18。Shapiro19在实验中发现，p16缺失的NSCLC细胞株中出现Rb持续磷酸化，转染p16后恶性生长受到抑制，表明p16对肿瘤生长具有抑制作用。Sharpless20等发现，p16缺失的小鼠自发性或致癌物诱导性肿瘤的发生率明显增高。以上模型在应用于抑癌机理的探索过程中，常有出乎意料的结果，这可能是由于人和小鼠之间许多基本的生物学差别所造成。
4. 条件性基因打靶(conditional gene targeting)
常规的基因打靶技术无法控制靶基因的表达，外源基因的表达不具组织特异性，且许多抑癌基因的纯合缺失容易导致早期胚胎死亡。此外，在培养纯系小鼠的过程中，有些基因的互补效应也增加了表型分析的复杂性。而条件性基因打靶则是在常规的基因打靶基础上，利用重组
酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“开关”，从而使对小鼠基因组修饰的范围和时间处于可控状态。条件性基因打靶技术有效地克服了常规基因打靶的上述缺点，因而能更加真实地模拟体内抑癌基因的失活过程。
(图2)条件性打靶的示意图
条件性基因打靶的结果是使靶序列被删除或倒置。目前使用得最广的是噬菌体P1的Cre和酵母flp重组酶。它们分别识别34bp的LoxP和48bp的Frt位点。早在1983年，CoxMM就发现大肠杆菌内flp基因所表达的flp重组酶可以特异性地让其质粒DNA发生置换，此后人们利用这项发现开展了一系列条件性基因打靶研究。1993年，Gu等21以Cre-LoxP系统为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性，从而在LoxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰的目的(图2)。人们可以通过诱导剂给予时间预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。Johnson等22利用噬菌体Cre-loxP系统建立了在转基因小鼠肺组织中特异表达Ras基因的模型。此模型种，Ras癌基因一侧连接了LoxP单元和一个终止信号，并将其导入小鼠基因组中。只要终止信号存在, Ras基因就没有活性。当小鼠吸入一种含有Cre基因的重组腺病毒之后，腺病毒感染肺细胞，Cre基因与LoxP单元发生重组，LoxP单元与终止信号从Ras基因侧翼被切下, 失去终止信号的Ras基因就在腺病毒感染的肺细胞中表达了。通过控制吸入腺病毒的数量, 来控制Ras
基因在肺细胞中表达的数量。这种小鼠模型与人类癌症发生非常相似，首先是区域细胞增生，然后是非癌增生，接着发展成恶性腺癌。利用Cre-LoxP系统和Flp-frt系统也可用于特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活的表型改变研究23。
5. 基因捕获技术（gene trapping）
条件性基因打靶技术是目前被用来研究结构信息明确的基因功能的最重要的手段之一。然而，由于同源重组成功概率低、动物繁殖耗费时间长且产生的功能失活突变常常与疾病中发现的分子损伤类型不同，因此基因捕获技术更受研究者青睐。基因捕获是一种结合常规转基因技术与基因打靶技术二者优势的突变策略，即“随机基因打靶”。
基因捕获通过向基因中添加DNA片段，使基因发生随意的变异。该技术不仅能敲除基因，而且还能确定基因被敲除的位置。利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库(每一种ES细胞克隆中含有不同的突变基因,因此能在短期内构建大量含不同基因突变的ES细胞克隆库)，节省大量筛选染色体组库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo
基因，neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达，ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得24。
用基因捕获技术在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES细胞克隆。这些克隆可以在96孔培养板中生长、复制并用于基因型分析，大规模保存和分析中靶ES细胞在小型的实验室中也是可行的。此方法的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。单种的细胞类型中表达的基因数目约为104，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES细胞表达的基因，因此，在ES细胞中进行基因捕获还是大有可为的。用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。
6. 结语
众多新技术在肿瘤动物模型中的应用为肿瘤研究带来了革命性的变化，大量肿瘤动物模型的建立使我们可以深入研究肿瘤的生物学行为。一个好的肿瘤动物模型与其模拟的人类肿瘤在分子、组织学以及生物学特性方面应有许多共性。有鉴于肿瘤的发生常常是靶细胞基因的改变与微环境的改变进行性积累并相互作用的结果，因此综合采用上文中的多种方法构建肿瘤动物模型将是今后努力的方向。
参考文献
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建立小鼠肿瘤模型的研究进展
建立小鼠肿瘤模型的研究进展 摘要：建立一种理想的肿瘤动物模型对研究肿瘤的发病、治疗和预防有重大的意义。其中小鼠肿瘤模型具有生长周期快、易获得、易操作等优点被基础实验研究所广泛采用，如何选择和建立一个合适的小鼠肿瘤模型对肿瘤的整个研究有着举足轻重的作用。 关键字：肿瘤，动物模型，小鼠 肿瘤，是一种严重威胁人类健康的多发病和常见病。对肿瘤的研究一般都是在人类疾病动物模型的基础上展开的。建立一个完全反映人类疾病的动物模型比较困难，但可依据不同的实验目的选择相应的动物实验模型。 1.实验动物的选择 可用作肿瘤模型的动物有很多，小鼠肿瘤模型作为其中一种常用模型主要因为有以下几个优点。（1）易获得，常用的肿瘤模型小鼠通常采用SPF级小鼠，SPF级小鼠一般医学院校及研究所都能买到。（2）生长周期短，一般小鼠肿瘤模型两周左右就能长大，能大大缩短实验周期。（3）易操作，小鼠的动物实验操作一般简便，因此可适当增加组内样本数量，使实验数据更具说服力。 2.理想的建立肿瘤模型应具备的条件 （1）肿瘤生长的过程应与人类肿瘤生长过程相似，做到尽可能复制出与人类肿瘤相同的模型。 （2）制作模型的方法简单易行。 （3）动物模型的重复性要好，要能满足实验的多次重复试验结果稳定性好。 （4）采用的建模方法对实验人员和环境无危害或危害较小。 3.肿瘤来源的选择 现在世界上保有近500种的动物移植瘤，但常用于筛药的不到40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤，包括小鼠L1210淋巴白血病，P1534淋巴白血病，艾氏腹水瘤，Friehd病毒白血病，肉瘤180，白血病P388，Lewis肺癌，腺癌755，白血病615，Walker-256，吉田肉瘤，肉瘤45，Liol淋巴瘤，Dunning 白血病，Ｗagner癌肉瘤，白血病L5170Y，P1798淋巴肉瘤，LPC-1浆细胞瘤，淋巴瘤8，B16或Cloadman黑色素瘤，Ridaway骨肉瘤，Gardner 淋巴肉瘤，肉瘤37，P315白血病，Mur hy-sturm淋巴肉瘤，Jensen肉瘤，Geurin氏癌，仓鼠十二指肠腺癌和人体肉瘤HSL第1代杂交鼠移植。它们对抗癌药作用的敏感性大致可分
动物实验方法总结：组织研磨管的使用方法 临床样本或动物取材注意事项 动物模型
组织研磨管的使用方法 1.作用：只适用于蛋白提取、RNA提取、基因组DNA提取时的组 织裂解，不做他用； 2.组织研磨管：容量为1.5ml, 里面已经提前放置了研磨珠（有时也 不放置），研磨液（Trizol或RIPA裂解液，有时也不放置）一般在取回后才加入，如果已经加入了研磨液，请离心后才拧开管盖，以免研磨液溢出，对皮肤造成伤害，所以操作时，要小心注意！ 3.组织：把收取的组织分切，用生理盐水或PBS缓冲液把分切的组 织上的血液漂洗干净，然后用医用纱布或滤纸把组织表面的水分吸干，然后放入研磨管（组织体积大小为1颗绿豆至2颗黄豆，根据实际情况决定）中，然后把放入的组织尽量剪碎； 4.存放：上述过程应尽量在最短的时间内操作完毕，立即用液氮冻 结，然后置于液氮或-80℃保存； 5.操作事项：操作时间尽可能短，做好一个，立马放置一个；
实验方法总结（3）：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (2) 2、研究肿瘤细胞转移 (3) 2.1. 体外(浸润模型) (3) 2.2. 体内(转移模型) (3) 3、研究肿瘤细胞耐药 (5) 3.1. 耐药细胞株的建立 (5) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (6) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
Dicer1转基因小鼠模型的建立
2008年8月 第16卷 第4期中国实验动物学报ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA August ,2008V ol.16 N o.4 研究报告 Dicer 1转基因小鼠模型的建立 郑志红1,高峰2,杨葳1,汪瑛1,于洋1,周生来1,李兆阳1 , 吕相川1,张梅英1,王禄增 1(1.中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;2.中国医科大学附属第一医院,沈阳 110001) 【摘要】 目的 建立Dicer 1转基因小鼠模型。方法 构建pcDNA3112Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR 受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR 和S outhern 方法检测鼠尾DNA 鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer 1基因表达。结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR 检测获得6只阳性鼠,S outhern 检测6只均为阳性。对S outhern 检测阳性转基因小鼠子代进行RT 2PCR 检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。结论 成功建立Dicer 1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER 1基因功能及miRNA 的表达及功能等奠定基础。 【关键词】 Dicer 1;显微注射法;转基因小鼠 【中图分类号】R -33 【文献标识码】A 【文章编号】100524847(2008)0420258203 Establishment of a Dicer 1Transgenic Mouse Model ZHE NG Zhi 2hong 1,G AO Feng 2,Y ANG Wei 1,W ANG Y ing 1,Y U Y ang 1,ZH OU Sheng 2lai 1,LI Zhao 2yang 1 , LU X iang 2chuan 1,ZH ANG Mei 2ying 1,W ANGLu 2zeng 1(https://www.wendangku.net/doc/aa16170865.html,boratory Animal Center ,China Medical University ,Shenyang 110001,China ; 21The First A ffiliated H ospital of China Medical University ,Shenyang 110001,China ) 【Abstract 】 Objective T o establish a Dicer 1transgenic m ouse m odel.Methods pcDNA3112Dicer1construct was constructed ,linearized ,purified and then injected into superovulated pronuclear zyg otes to produce transgenic mice.The injected zyg otes were transplanted into the oviduct of pseudopregnant mice.The genotype of transgenic founders were identified by PCR and S outhern blot.The expressions of human Dicer 1protein in the tissues of the transgenic mice were detected by immunohistochemistry.R esults 172zyg otes were injected and 119zyg ote cells were transplanted into oviducts of 3recipients.15viable offsprings were born from 2of the 3recipients.G enomic DNA from baby tails was extracted.PCR and S outhern blot were used to identify transgenic founders of Dicer 1,and showed 6of the 15offsprings were positive transgenic mice of Dicer 11Dicer 1was expressed in the liver ,kidney and lung.Conclusion Dicer 1transgenic mice have been established success fully.The m odels will contribute to the research of Dicer gene function and the expression of miRNA. 【K ey w ords 】 Dicer1;M icroinjection ;T ransgenic mice [基金项目]国家自然科学基金:30571836;辽宁省重点实验室专项资金:辽科发[2005]36号。 [作者简介]郑志红(1969-),女,研究方向:实验动物转基因与 基因敲除。E -mail :zhihongzheng @1631com [通讯作者]王禄增。E 2mail :wanglz @1631com DICER 1基因与表观遗传调控密切相关,是 2000年被克隆的,定位于人染色体14q32113,编码 蛋白属于RNA 酶Ⅲ家族[1],在许多组织中广泛表 达。其功能是将具有颈环结构的RNA 或双链RNA 剪切成长约21个碱基的成熟miRNA (或siRNA )[1]。 DICER 1蛋白是成熟miRNA 产生所必需的酶, DICER 1基因异常可导致不同组织、不同发育阶段miRNA 表达异常,DICER 1基因敲除的小鼠在胚胎发育过程中就发生死亡[2],无法通过敲除来详细研究该基因的功能。由于DICER 1基因是发育过程中重要的调控基因,建立DICER 1转基因小鼠模型对研究该基因的功能具有重要的意义。1 材料方法 111 Dicer 1基因克隆及转基因构件制备按Dicer 1mRNA 序列设计正、反向引物,以
实验方法总结：动物模型部分
实验方法总结：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (1) 2、研究肿瘤细胞转移 (2) 2.1. 体外(浸润模型) (2) 2.2. 体内(转移模型) (2) 3、研究肿瘤细胞耐药 (4) 3.1. 耐药细胞株的建立 (4) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (5) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
移植性肿瘤动物模型
移植性肿瘤动物模型 目前临床所使用的抗肿瘤药物，大多数是通过动物移植性肿瘤实验法筛选而被发现的，移植性肿瘤动物模型是现代肿瘤研究中应用的最广最有价值的模型。其优点包括：（1）可使一群动物被同时接种同样量的瘤细胞，生长速率比较一致，个体差异较小，接种成活率近100%；（2）对宿主的影响相类似，易于客观判断疗效；（3）可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留供试验用；（4）试验周期一般较短，试验条件易于控制等。但是这类肿瘤生长速度快、增殖比高、体积倍增时间短、肿瘤生命性质简单，与人类肿瘤具有明显不同；特别是与人类的致死性实体恶性肿瘤生命性质、与生长发生机制差异更大。存在着能够为现代肿瘤基础生命科学研究模拟人类恶性肿瘤综合生命性质的局限性、片面性。现在世界上保有近500种的动物移植瘤，但常用于筛药的不到40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤，包括小鼠L1210淋巴白血病，艾氏腹水瘤，Friehd病毒白血病，肉瘤180，Lewis肺癌，腺癌755，白血病615，白血病P388，Walker-256，吉田肉瘤，肉瘤45，Liol淋巴瘤，Dunning 白 AHA12GAGGAGAGGAFFFFAFAF
血病，白血病L5170Y，P1534淋巴白血病，P1798淋巴肉瘤，LPC-1浆细胞瘤，淋巴瘤8，Gardner淋巴肉瘤，B16或Cloadman黑色素瘤，Ridaway骨肉瘤，肉瘤37，P315白血病，Ｗagner癌肉瘤，Mur hy-sturm淋巴肉瘤，Jensen肉瘤，Geurin氏癌，仓鼠十二指肠腺癌和人体肉瘤HSL第1代杂交鼠移植。它们对抗癌药作用的敏感性大致可分为敏感，中度敏感，低敏感和不敏感瘤株四类，同样敏感株对抗癌药的疗效水平也不相同。 （1）实验动物的选择：移植性肿瘤常用的动物为清洁级小鼠、大鼠和地鼠等，每批动物都应有一定的微生物及遗 传背景，来源明确，根据瘤株的要求选用近交系、远交 系或杂交第一代（F1）动物，一般雌雄皆可（乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌必须用雌性动物），但每批实验只用一 个性别。 （2）实验一般要求：需在无菌环境下进行。可在接种罩、层流工作台或无菌室内操作。动物处死后，新洁尔灭或碘 酊、酒精消毒，对每个实体瘤应分别用灭菌的外科器械 AHA12GAGGAGAGGAFFFFAFAF
转基因小鼠的制备
转基因小鼠的制备 【实验目的】 1.了解转基因小鼠制备的原理和方法。 2.学习转基因小鼠制备的流程。 3.掌握对转基因小鼠进行筛选的方法。 【实验原理】 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们现在一般意义上所说的转基因小鼠。 【实验步骤】 一、显微注射法 1.受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 2.目的基因的导入 用显微操作仪将目的基因溶液导入受精卵的细胞核内。 3.受体母鼠的准备 将雄鼠输精管结扎，然后与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 4.胚胎移植 将已转入目的基因的受精卵从背部植入假孕母鼠的输卵管或子宫内（视胚胎发育的状况而定），使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定 幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交鉴定外源基因是否整合到幼鼠的染色体上。 二、胚胎干细胞囊胚显微注射法 1.囊胚期受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，交配后第四天上午从子宫中冲取受精卵备用。 2.目的基因的导入
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展_百替生物
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与
肺癌动物模型
原发性支气管肺癌动物模型 【摘要】制作动物模型的根本目的是要对人类疾病进行预防和治疗, 因此应选择那些结构、功能、代谢和人类相似的动物进行研究。目前, 研究肺癌的病因多采用吸入方法, 研究肺转移癌多采用外科种植, 而研究原发性支气管肺癌以支气管灌注法为佳。 【关键词】肺癌，支气管肺癌，动物模型 肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一, 一般认为80%～90%的癌症与环境因素有关, 与肺癌发病相关的因素有吸烟、大气污染、职业接触、室内空气污染等。为减少肺癌对人类的威胁, 最经济的预防措施就是对肺癌高危险人群进行筛查或监测, 发现某些个体出现早期肺癌指征, 及时对其进行预防或治疗。因此, 研究支气管肺癌的发生发展过程及其机制, 寻找机体形成实体性肿瘤过程中的早期变化指标就成为预防肺癌的重要课题。本课题采用化学诱癌的方法建立了大鼠的肺癌模型[1]。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 离心机, 722 型分光光度计, 3-甲基胆蒽, 二乙基亚硝胺, 碘化油注射液, 氨苄青霉素钠, 链霉素, 硫喷妥钠, N-乙酰神经氨酸, 间苯二酚。显色剂: 2%的间苯二酚溶液10 ml+78 ml12 mol /L 的浓HCl +1.5 ml 0.1 mol /L 的FeCl3 溶液,加蒸馏水至100 ml, 放置4 h 后使用, 4 ℃冰箱可贮存1 周。Schiff 试剂, 盐酸, 偏重亚硫酸钠。 1.2 实验动物 清洁级Wistar 大鼠, 71 只, 雌雄各半, 体重180～220 g, 由中国医学科学院实验医学中心提供。随机分成3 组( 诱癌组, 溶剂对照组, 正常对照组, 每组动物数分别为31、20、20 只) 。 1.3 动物肺癌模型的建立 1.3.1 诱癌剂配制在70～80 ℃水浴中将MCA 溶于碘化油注射液中, 配成浓度为100 mg/ml 的混悬液, 在此混悬液中再加入 10 %(V/V)DEN[2]。 1.3.2 动物染毒诱癌组: 大鼠肌注硫喷妥钠( 1 2.5mg/kg 体重) 作为基础麻醉, 同时肌注氨苄青霉素2 万单位及链霉素2 万单位以预防感染, 再用乙醚麻醉后,一次向左肺叶支气管注入0.1ml 诱癌剂( 含MCA10mg,DEN 0.01 ml) 。溶剂对照组: 处理同上, 只注入碘化油注射液。正常对照组: 不做任何处理。 1.3.3 染毒效果检查对大鼠进行染毒后2 d 对大鼠拍摄正位X 线胸片。在X 线片上显示肺叶内有清晰、致密的团状药物阴影者, 证明
小鼠肿瘤模型
小鼠肿瘤模型 肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型，另外还有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型，其他的模型很少用，就不提他们了。 小鼠模型分三大类：第一类是以S180、EAC、H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵后第二天开始给药，给药7到10天，接种10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。 1. 关于构建瘤种 可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至1~3×106/0.1ml/mouse，i.p接种即可，最好用6号左右的针头，就是常用的2ml一次性注射的针头。 2. 关于腹水传代 观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8~9天左右），可以传代，传代时取1ml 注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个0.5ml就可以了，不用离心，直接用PBS3~6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整，第二代以后，尽量6~7天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用于试验。 3. 关于接种进行试验 这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后，接种到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有的人接种的时候喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往里走，然后注射的时候感觉阻力较大，打出来的皮丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连，不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉严重粘连。应该在两者之间，进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不会很圆很漂亮，但是相对好剥取一些。 4. 关于观测指标 主要是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后的第6天左右了，第10天就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很难剥，这是没有办法的，只能耐心，没有太好的办法，剥多了以后，手上会掌握一些巧力，有一些帮助，但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验结束。肿瘤组织周围经常会有一些血窦的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出，正常的，但是剥瘤子的时候不要把它弄破，会严重影响瘤重。按照SFDA的规定，平均瘤重小于1g，或
癌痛动物模型及病理机制研究进展_童晔玲
中国肿瘤２００７年第１６卷第５期 癌痛动物模型及病理机制研究进展 童晔玲，何国浓，严继贵，俞丽霞，王泽时 （浙江中医药大学，浙江杭州３１００５３） 摘要：近年来不断出现的癌痛动物模型为癌症机制的研究提供了有效的工具。癌痛有其 独特的病理机制，与外周敏化、 中枢敏化、骨溶解和肿瘤对外周神经的直接作用等有关。全文综述癌痛动物模型及癌痛机制的研究进展。关键词：癌痛；动物模型；机制中图分类号：Ｒ７３０．５文献标识码：Ａ文章编号：１００４－０２４２（２００７）０５－０３３８－０２ ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｎＡｎｉｍａｌＭｏｄｅｌａｎｄＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＣａｎｃｅｒＰａｉｎ ＴＯＮＧＹｅ－ｌｉｎｇ，ＨＥＧｕｏ－ｎｏｎｇ，ＹＡＮＪｉ－ｇｕｉ，ｅｔａｌ． 癌痛属慢性疼痛的范畴，与炎症痛、神经病理性痛相比，有其独特而复杂的机制，癌痛动物模型的出现，为癌痛机制的研究提供了合适的动物模型，这将对癌痛机制的深入探讨、寻找缓解癌痛新方法、筛选有效的镇痛药物提供极为有效的途径。本文就近几年出现的癌痛动物模型及癌痛病理机制的研究概况作一综述。 １ 癌痛的动物模型研究 由于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等常发生骨转移，肿瘤骨侵袭和扩散造成骨癌痛，是癌症诱发疼痛的主要原因，所以目前关于癌痛模型的研究集中于肿瘤骨转移模型。 １９９９年美国的Ｓｃｈｉｗｅｉ等［１］首次报道了小鼠股骨癌痛模型。将溶骨性的ＮＣＴＣ２４７２纤维肉瘤细胞种植于同源Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ小鼠股骨远端的骨髓腔内，种植后第５ｄ出现骨质破坏，破骨细胞数目增多，种植后１４ｄ，行为学上出现自发痛和触诱发痛，疼痛程度与骨质破坏程度成正比，神经递质也有改变，且可以被骨保护素（ＯＰＧ）所逆转。 ２００１年Ｗａｃｎｉｋ等［２］建立了小鼠跟骨癌痛模型，将ＮＣＴＣ２４７２细胞植入小鼠跟骨，种植后第３ｄ肿瘤细胞与骨粘连，第６ｄ出现骨质溶解，同时出现机械性痛觉增敏和冷刺激痛觉增敏，一直持续１６ｄ，注射吗啡（ＥＤ５０９．０ｍｇ／ｋｇ）可以缓解机械性痛觉增敏现象。他们还建立了小鼠肱骨癌痛模型，方法及各项指标与跟骨癌痛模型类似［３］。 ２００２年英国学者Ｍｅｄｈｕｒｓｔ等建立了大鼠胫骨癌痛模型。该模型是在同源ＳＤ大鼠的胫骨骨髓腔 内注射３×１０３ＭＲＭＴ－１大鼠乳腺癌细胞，种植后１０ｄ～ １４ｄ，Ｘ线片上显示胫骨骨质显著破坏，第２０ｄ骨矿物含量和密度下降，组织学切片抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察发现破骨细胞数量显著增多。动物在术后第１２ｄ～１４ｄ出现触诱发痛和痛觉过敏，１ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇ吗啡有效［４，５］。 目前，国内也已成功复制出大鼠胫骨癌痛模型。谭煌英等［６］按照Ｍｅｄｈｕｒｓｔ的方法对骨癌痛模型进行了复制，并从疼痛行为学、放射学、组织学多方面进行研究，结果与文献报道基本一致，是国内研究癌痛模型的起点。董航等［７］在此基础上有所创新，运用ＭＡＤＢ－１０６大鼠乳腺癌细胞注入ＳＤ大鼠胫骨骨髓腔，机械痛和辐射热痛刺激的缩爪阈值在术后各时间点相比差异显著；术后８ｄＸ射线显示注射部位松质骨出现放射性缺损病灶，第１４天松质骨放射病灶增多，骨皮质缺失，第２２ｄ出现严重的骨破坏；术后８ｄ大鼠后肢苏木精—伊红染色见骨髓腔有异型细胞，骨小梁未见广泛破坏；术后１４ｄ可见肿瘤细胞充填骨髓腔，引起骨小梁广泛破坏；术后２２ｄ可见肿瘤细胞穿破骨皮质，侵及周围肌肉及软组织。 上述的这些骨癌痛模型中，应用乳腺癌细胞建立的大鼠胫骨癌痛模型可视为临床常见的乳腺癌骨转移模型，手术操作较简便，评价方法成熟，具有研究意义。 ２ 癌痛的发生机制 ２．１ 初级感觉神经元兴奋性异常增加（外周敏化）初级感觉神经元位于脊髓背角神经节（ＤＲＧ），分布着感受不同刺激的多种受体，可将各种伤害性刺激转化为电化学信号传导至中枢神经系统。在持续的外周刺激下，ＤＲＧ神经元发生可塑性变化，外 收稿日期：２００６－０８－２９；修回日期：２００６－１０－１０通讯作者：王泽时、俞丽霞基金项目：国家“九五”攻关项目（９６－９０６－１０－０１（０２）） ３３８
转基因小鼠的方法概述
转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法
（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.
肿瘤动物模型的构建——白血病篇知识讲解
肿瘤动物模型的构建——白血病篇
肿瘤动物模型的构建——白血病篇 导读白血病（Leukemia）是一种常见的恶性血液疾病，俗称血癌。据统计，白血病是儿童恶性肿瘤的头号原因，在儿童及35岁以下成人中发病率位居第一[1]。同时也是十大恶性肿瘤之一。目前，白血病具体的发病原因至今尚未研究透彻，因此建立合适的白血病动物模型，对于白血病发病机制及药物研发具有重要意义。 本期为大家综述了白血病的基本情况及小鼠模型的分类、建立方法和应用。 第一章：白血病基本常识白血病是常见液体瘤 白血病是常见的液体瘤，与结肠癌、肝癌等实体瘤不同的是，它是造血干细胞的异常分化和过度增殖导致，因此肿瘤细胞会遍布全身，会侵犯身体的每个脏器，造成全身衰竭。 造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新和分化成各类成熟血细胞的能力。如下图为造血干细胞可分类形成各种血细胞，如红细胞、血小板和白细胞： 造血干细胞分化成各类血细胞（图片来自https://www.wendangku.net/doc/aa16170865.html,网站）白血病致病因素有哪些呢？ 现阶段认为白血病的发病因素：化学因素、电离辐射、药物、毒物、病毒、遗传因素等有关。
白血病主要分为四类 根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类，临床上，白血病共分为四大类：急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）。儿童白血病90%以上是急性的，其中急性白血病中70%～80%是ALL。 第二章：实验研究所用白血病模型首先，来了解一下常用的细胞株白血病中常用的小鼠品系 用于建立白血病小鼠模型的小鼠可分为近交系和突变系。根据不同类型和目的选择不同的小鼠品系，具体如下图所示： 最后说说常用的动物模型，主要分为三类： 一、异种移植模型 异种移植模型是最常用的淋巴瘤动物模型。根据实验目的选择相应的小鼠品系和细胞株后，通常细胞的接种方式为皮下注射、腹腔注射和尾静脉注射。 皮下注射和腹腔注射操作简单，很快在接种部位形成肿瘤或腹腔内形成多发性肿瘤，适合筛选针对白血病的药物。但该类模型与白血病临床病人实际情况差距较大。异种移植型白血病模型异种移植示意图[2]
乳腺癌小鼠模型的研究进展
乳腺癌小鼠模型的研究进展 摘要】乳腺癌动物模型是研究人类乳腺癌生物学行为以及寻求治疗方法的重要 工具。本文在总结近年来最新研究成果的基础上系统的阐述了乳腺癌研究中常见 的小鼠模型，有助于研究者全面的了解其最新的研究进展情况，为乳腺癌的发病、机制、治疗、预防研究提供帮助。 【关键词】乳腺癌；小鼠模型；基因工程型；中医乳腺癌模型 【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）24-0010-02 乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，严重危害女性健康。小鼠与其它实验 动物（如果蝇、线虫或大鼠）相比有较多的优势，尤其是其基因组中许多癌基因、肿瘤抑制基因已被发现并定位，使其成为生物医学研究中最常用的哺乳类实验动物。现将目前乳腺癌小鼠模型的研究进展进行综述。 1.自发性乳腺癌模型 自发性肿瘤动物模型是指未经任何有意的人工处理而自发产生肿瘤。目前已 报道的品系有C3H系、A系、CBA/J系、TA2系等，其中C3H小鼠自发性乳腺癌 发病率高，6～10个月龄雌鼠的肿瘤自然发生率可高达100%，是最常用的自发性乳腺癌模型[1]。该模型发病条件比较自然，有利于研究乳腺癌的发病机制。但由 于很难获得大量发病时间相同的荷瘤小鼠，不利于药效评价。 2.诱发型乳腺癌模型 目前对诱发型乳腺癌小鼠模型的研究并不多。Lanan等对BALB/C小鼠持续使 用醋酸甲基孕酮诱导一年后，成瘤率为79%[2]。张亚平[3]用二甲基苯蒽灌胃 C57BL/6小鼠诱导产生乳腺癌。该模型可模拟外界环境因素所致的人类肿瘤发病 的特点和过程，在预防医学的病因学研究及综合化疗后的效果评价中发挥一定的 作用。但由于小鼠个体差异及诱导剂等多因素导致肿瘤发生的部位与时间不同， 成瘤率不高，不利于药物筛选。 3.移植型乳腺癌模型 根据移植物来源不同分为同种移植和异种移植。同种移植所用小鼠为免疫功 能正常的小鼠，所用乳腺癌细胞或组织有严格的种系特异性，常用的细胞株有来 源于BALB/C小鼠的4T1和TM40以及C127[4]。异种移植模型是指将人类肿瘤细 胞系（如MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435、BT-474等）移植于免疫缺陷的小 鼠体内，目前常用的免疫缺陷小鼠有裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、NOG小鼠。相比于同种移植，异种移植肿瘤能模拟人乳腺癌成瘤后过程。移植模型建立 所需时间短，成本低，成瘤率高，且所带肿瘤生长速度大致相同，是目前抗癌药 物筛选和药效学研究常用的方法。然而小鼠乳腺癌与人类乳腺癌仍存在一定的差异，其不是自然发病，不能用于病因学、癌前病变和癌变的研究。 4.基因工程型乳腺癌模型 运用分子生物学技术敲除某些肿瘤抑制因子和易感基因或插入某些癌基因建 立的乳腺癌小鼠模型。目前建立的基因工程小鼠有MMTV-PyMT[5]，MMTV- Neu[6]，MMTV-Wnt-1[7]，WAP-Ras[8]，MMTV-PyMT和CD44-[9]；MMTV- huHER2[10]；P53基因敲除鼠和Cdkn2a基因敲除鼠等[11]。其中研究较多的是MMTV-Wnt-1转基因小鼠[12]。基因工程小鼠为环境因素与遗传背景相互作用的 研究提供了很好的模型，其肿瘤生长和进展快速，可方便的获得肿瘤发展的整个 过程，但不适于早期肿瘤预防的研究。而且模型建立过程较长、费用较高，影响
肿瘤动物模型构建实验技术
肿瘤动物模型的建立可以： （1）评价抗肿瘤免疫治疗的疗效； （2）作为抗肿瘤药物筛选模型； （3）为肿瘤转移研究提供更好的研究平台； （4）为研发抗肿瘤转移性药物提供良好的实验工具。 实验方法：诱发性肿瘤动物模型 实验方法原理：诱发性肿瘤动物模型是指研究者用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。 实验材料：肿瘤细胞小鼠 试剂、试剂盒、无血清培养基质、3%中性甲醇石腊 仪器、耗材、低温离心机、血球计数器、游标卡尺 实验步骤 一、肝癌 1．二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌 （1）取体重250 g左右的封闭群大白鼠，雌雄不拘； （2）按性别分笼饲养。除给普通食物外，饲以致癌物，即用0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为10 mg/kg，每周一次，其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用；（3）共约4个月可诱发成肝癌； （4）也可以单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。 2．4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌 （1）用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2不应超过1.5～2 mg/kg； （2）4～6月就有大量的肝癌诱发成功。 3．2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌 （1）给成年大鼠含0.03% 2AAF标准饲料； （2）每日每平均2～3 mg 2AAF（也可将2AAF混于油中灌喂），3～4月后有80～90%动物产生肝肿瘤。 4．二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌： （1）用剂量为每日0.3～14 mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予； （2）6～9个月后255/300大鼠发生了肝癌。 5．亚胺基偶氮甲苯（OAAT）诱发小鼠肝癌 （1）用1%OAAF苯溶液（约0.1 ml含1 mg）涂在动物的两肩胛间皮肤上，隔日一次，每次2～3滴，一般涂100次。 （2）实验后7～8周即而出现第一个肝肿瘤，7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。 （3）或用2.5 mg OAAT溶于葵瓜子油中，给C3H小鼠皮下注射4次，每日间隔10天，也可诱发成肝癌。 6．黄曲霉素诱发大鼠肝癌 （1）每日饲料中含0.001～0.015 ppm，混入饲料中喂6个月后，肝癌诱发率达80％。 二、胃癌 1．甲基胆蒽诱发小鼠胃癌 （1）取20 g左右的小鼠，无菌手术下，在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC）线结。（2）含MC的线结是用普通细线，在一端打结后，将线结置于盛有MC小玻璃试管内，在
转基因小鼠的方法概述
转基因小鼠的应用及其制 备方法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。
转基因小鼠的应用及其制备方法 （西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验方法；应用前景 Methods and Applications ofTransgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@https://www.wendangku.net/doc/aa16170865.html,；Tel： *通讯作者：E-mail： 兴的最有效的动物实验模型。小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医