细胞死活鉴定

【实验目的】

1、回顾细胞培养的有关知识；

2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术

3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；

4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程；

5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；

6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；

7、学习实验过程的详细描述及实验记录。

【实验原理】

细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。

1.细胞原代培养

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第

一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点培养条件易改变和控制便于单因子分析便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察在生物学的各个领域如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等已被广泛应用。细胞培养的局限性在脱离机体复杂环境下细胞培养条件与躯体环境有一定距离观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况细胞培养得到的产物少。

2.染色法鉴别细胞死活

细胞死活的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。

染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞，细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。

常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。活细胞必须通过控制物质进出细胞膜来保持内部环境的稳定性，细胞死后，细胞膜的通透性发生改变，原先不能够进入细胞的物质也能够进入细胞。台盼蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞受损或者死亡，才能进入细胞。因此，活细胞一般不能被台盼蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。

3.悬浮细胞计数（血细胞计数板法）

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的细胞计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽，构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格(图1)，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3（万分之一毫升）。

计数时，通常数五个中方格的细胞总数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的细胞总数，然后再换算成1ml细胞悬中的细胞总数。

图 1 血球计数板构造示意图

25个中方格的计数板，设5个中方格中的细胞总数为A，细胞悬液稀释倍数为B，则：1mL细胞悬液中的细胞总数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）。

【实验材料】

1.试剂：75%酒精、PBS液、细胞培养液、台盼蓝。

2.器具：超净工作台、解剖盘、镊子、剪刀、吸管、移液枪、玻璃培养皿、塑料培养皿、

“L”型针头注射器、火柴、酒精棉球、酒精灯、Eppendorf管、离心机、二氧化碳培养箱、记号笔、倒置显微镜、血细胞计数板、盖玻片、普通光学显微镜、玻璃离心管，等。

3.材料：小白鼠

【实验步骤】

小鼠脾细胞原代培养

1. 取材：

取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3min。取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1~2次。转入无菌玻璃培养皿中，待用。

2. 分离脾细胞：

用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1～2分钟。

吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000r/min，离心1~2分钟。

3. 培养脾细胞：

超净洁净台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。

取上述离心后的Eppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养。

染色法鉴定细胞死活及活细胞计数

1. 试剂配制：

用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。

2. 细胞生长状态观察：

从培养箱中取出培养物，观察培养液的颜色。然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况。

3. 细胞悬液制备：

取0.5mL细胞悬浊液于试管（本实验中，用玻璃离心管代替）中，加1-2滴台盘蓝染液（约0.1ml），混合均匀，染色2min。

4. 细胞计数：

滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，细胞悬液依毛细作用扩散到计数区，使悬液自然充满计数板小室（注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加）。

在普通光镜10x物镜下找到中心处的大方格，改用40X物镜，取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格内死活细胞的数量（注意：当遇到位于大格线上的细胞，一般数上不数下，数左不数右）。先计数总细胞，再计数死细胞（蓝色）。

5. 根据染色结果计算活细胞率：

依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：

【实验结果】

1. 细胞原代培养形态观察

图2 倒置显微镜下细胞原代培养图示（10×40）

原代培养后的培养液呈粉红色，上清液澄清，未出现异味，也未被污染。在倒置显微镜下，原代培养的细胞清晰可见，细胞多呈圆形，形状规则，细胞质均匀。

2. 细胞计数（自己原代培养1周的细胞）

用血球计数板计数，分别计算了红细胞计数区域的五个小方格，计数结果如下:

编号（中格）右上右下左上左下中

总数/个15 7 11 12 11

死细胞数/个12 6 10 12 8

活细胞数/个 3 1 1 0 3

细胞存活率= 活细胞数/ 细胞总数×100%

=（3+1+1+0+3）/（15+7+11+12+11）×100%

=14.29%

每毫升液体中细胞的数=[(15+7+11+12+11)/5]×25×104

=2.8×106个/m

【实验结果分析】

本次实验中所测活细胞率为14.29%，比例略微偏低，分析可能有以下原因可能影响实验结果：

a) 在离心分离呈单细胞的过程中离心机转速过快或时间过长很可能会导致细胞破裂，导

致小鼠脾细胞大量死亡；

b) 在无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，会影响观察，导致实验失败；

c) 取液时没有摇匀细胞液，导致所吸取的细胞悬液中细胞密度较低；

d)染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活力骤降，这

是导致活细胞比例比较低的重要原因；

e)实验中的一些不正确或不规范的操作、计算带来的误差等也会直接导致实验误差。【注意事项】

小鼠脾细胞原代培养

1.小鼠解剖前，一定要在酒精中充分浸泡3min防止杂菌污染无菌操作台；

2.分离脾脏时，不要破坏脾脏，注意保持其完整性；

3.注入缓冲液要慢而准，且适量，不要撑破脾脏，从头部逐渐向尾部后退，保证细胞分散

游离出来，也不能使游离的细胞中含有块儿状物质；

4.时刻注意操作的规范性，避免被杂菌污染，为近一步保证无菌操作台的无菌环境可在玻璃挡板口点燃一个酒精灯，一般操作都在酒精灯火焰旁操作；；

5.培养前，注意在皿盖上做好标记，切记不要写在皿底，以免影响在倒置显微镜下，细胞形态的观察；

原代培养的细胞形态观察

6.培养液PH为

7.0～7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培养液的颜色改变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞的生长状况；

7. 倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察；

8.生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空

泡证明细胞衰老。除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆形、折光

率高、而衰退期细胞皱缩、透明度下降、立体感很差、较易区分；

细胞计数及活细胞率的计算

9.当遇到位于大格线上的细胞，一般取上不取下，取左不取右。

【思考题】

1.为什么要学习细胞生死状态鉴别的方法？试说明其实际应用意义。

答：在细胞培养的实验室操作以及制造生物制剂时，有时需要确定某舟细胞的生存状态，以便进行下一步操作，因此选择恰当的细胞生死状态鉴别的方法是十分重要的。

2.各种细胞生死状态方法的原理和判定特征是什么？

答：原理主要是基于细胞膜的选择透过性和代谢上的差异。鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

化学染色法：活细胞的细胞膜是一层选择透过性膜，只允许物质选择性地通过，而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。因此一些化学染料能使死亡细胞着色，而活细胞不着色。荧光染色法：活细胞中新陈代谢作用强，一些酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸入，活细胞的酶有较强的活性，将其分解成能发荧光的荧光素该物质不能自由透过细胞膜，积累在细胞内，显微镜下显示有明显的荧光；而死细胞内的新陈代谢停止，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下不发光。

除此之外，鉴别植物细胞的死活还可以采用其质壁分离性质，将植物细胞放入高渗溶液中，观察其是否发生质壁分离。若发生，则为活细胞；若不发生，则为死细胞。

3.活细胞、坏死细胞和凋亡细胞的形态特征是什么？它们的主要区别有哪些？

答：活细胞的外形较规则，细胞膜的边缘明显，细胞中能够清晰地看到细胞核。坏死细胞的特点是：细胞质膜和核被膜破裂，细胞骨架和核纤层解体。细胞质溢出，影响到周围细胞，发生炎症反应。细胞凋亡的特点：细胞质凝缩，细胞萎缩，细胞骨架解体，核纤层分解，核被膜破裂，核DNA分解成片段，出现梯形电泳图。细胞坏死指的是细胞收到物理、化学因素的损伤，如机械损伤、毒物、微生物、辐射等，引起的细胞死亡。而凋亡是“细胞的程序性死亡”，是个体发育、存活必需的正常秩序的一部分。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

4.在动物细胞培养操作过程中，应如何加强无菌操作的观念以避免细胞污染？

答：动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或除菌处理，才能进超净工作台中使用整个实验过程都要有无菌操作概念，避免细胞被污染。

5.组织块贴壁培养时，为什么要将贴有组织块的培养瓶先翻转过来培养？翻转培养瓶的

时间不宜过长，为什么？

答：为了使组织块略干燥能牢固粘于瓶壁上。时间过长，则组织粘得太紧，不方便培养。

6.皮肤组织块培养时，要静置培养并尽量减少晃动培养瓶，为什么？

答：晃动培养瓶可能会影响细胞的生长，使刚生成的细胞膜破裂。

7.加入培养液后，即可终止胰蛋白酶的消化作用，为什么？

答：加入培养液后，细胞获得了足够的养分，也就解除了接触抑制的状态，因此胰蛋白酶的消化作用终止。

8.在细胞传代时，将原培养液倒去后用D-Hank’s工作液洗涤细胞2遍，再加胰蛋白酶，

为什么？

答：D-Hank’s是常见的平衡盐溶液之一，它是组织基本用液之一、在细胞传代时，要确保传代细胞的细胞的渗透压与培养液保持一致，因此需要用D-Hank’s工作液洗涤，起到过度作用。

【作业】

1.抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法

（1）细胞水平筛选抗肿瘤药物

细胞生物学、分子药理学、分子生物学、生物化学等学科的发展为药物筛选提供了新的方向。细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确和大规模筛选等优点。目前,在细胞水平上对抗肿瘤天然药物的筛选主要是采用选取几种肿瘤细胞系,以培养细胞为实验模型,用结晶紫染色测定法、四甲基噻唑蓝(MTT)法、SRB 法等检测天然药物及其提取物或单体的体外抗肿瘤作用。

温斌等在研究腹腔注射灰树花提取成分对小鼠免疫功能的影响时,采用乳酸脱氢酶法、结晶紫染色法、MTT生物活性测定法等对小鼠脾自然杀伤(NK)细胞和腹腔巨噬细胞进行检测,结果表明灰树花乙醇沉淀物(ET2Pre)和RNA提取物显着增高了小鼠脾NK细胞杀伤活性、巨噬细胞吞噬功能及肿瘤坏死因子(TNF) 2α、白细胞介素( IL) 21的产生水平。赵春玲等采用结晶紫染色法和MTT 比色法测定了白眉蝮蛇去整合素( rAdinbitor)对人肝癌细胞系SMMC27721细胞向纤连蛋白( FN)黏附的影响,以及对已黏附于FN上的SMMC27721细胞的影响。

实验证明，rAdinbitor能够剂量依赖性地抑制SMMC27721细胞在FN上的黏附，促使已黏附的SMMC27721细胞脱落；并且能够剂量依赖性地抑制SMMC27721细胞的增殖并且诱导其调亡。

（2）端粒酶活性为作用靶点的筛选方法

端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构。由富含G的DNA重复序列和端粒蛋白组成,起着保护染色体完整性维持细胞复制能力的作用。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种特殊的逆转录酶,其功能是合成端粒DNA,使端粒出现多个重复序列从而不断延长。1994年KIM等通过实验发现,肿瘤细胞中端粒酶活性表达呈阳性,而在正常组织中则无端粒酶活性表达或活性很低。此后亦有实验证明端粒酶与恶性肿瘤密切相关,因此端粒酶已成为当前肿瘤治疗的靶点之一。

孟志强等在对健脾理气方(由鳖甲、白术、山楂、党参、白花舌蛇草、枳壳、八月扎、茯苓等组成)进行研究时发现,该方药物血清对体外培养的人肝癌细胞株SMMC27721端粒酶活性有抑制作用。L IAN等的研究结果表明中草药合剂(含茯苓、当归、黄芩、甘草等)能减少c2myc、bcl22的表达及降低端粒酶催化亚基hTERT的活性,可抑制AN3CA和MCF7 /ADR细胞的端粒酶活性从而导致细胞生存能力的降低。

（3）以DNA拓扑异构酶为靶点筛选天然抗肿瘤药物

DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerases)通过DNA 链的切割、转移和再连接来改变DNA 的拓扑结构。DNA拓扑异构酶在细胞代谢过程中起着极其重要的作用,如DNA复制、基因转录、DNA 重组和有丝分裂等。抗癌药物喜树碱( camp tothecin)及其衍生物的作用靶点是真核生物DNA拓扑异构酶Ⅰ,吖啶类化合物、鬼臼毒素类化合物、异黄酮类化合物、多柔比星( doxorubicin)等则作用于真核生物DNA拓扑异构酶Ⅱ。这些药物可通过DNA拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ引起DNA双螺旋的一条或两条链的断裂从而导致肿瘤细胞的死亡。

李运曼等通过DNA解螺旋实验评价紫草素对拓扑异构酶Ⅰ催化活性的抑制作用。结果显示,紫草素可显着抑制拓扑异构酶Ⅰ的解螺旋活性,并且能够抑制人白血病K562细胞的增殖。汤涛等通过实验首次揭示了鸦胆子油乳能够特异性地抑制拓扑异构酶Ⅱ的活力,而对拓扑异构酶Ⅰ没有影响,对DNA也没有直接作用。这些现象揭示拓扑异构酶Ⅱ是鸦胆子油乳细胞内作用靶点之一。

（4）作用微管蛋白的天然抗肿瘤药物的筛选方法

微管(microtubule)是由αβ微管蛋白异二聚体聚合而成的管状聚合物,是真核细胞骨架的重要组成部分。微管参与许多细胞功能,包括维持细胞形态、细胞内运输、鞭毛和纤毛的运动、染色体运动和细胞分裂等。无论是促进微管蛋白聚合、稳定已形成的微管类药物,还是以抑制微管蛋白聚合类药物都通过影响肿瘤细胞的有丝分裂过程,使其生长受到抑制。因此,微管已成为肿瘤的临床治疗的有效靶点。KLEIN等用紫杉醇和discodermolide (1990 年从海绵动物Discodermia dissoluta中分离得到的多羟基内酯化合物)分别作用A549肺癌细胞,结果显示它们均能迅速导致有丝分裂的异常。

进一步的研究发现discodermolide和紫杉醇联合作用具有明显的协同作用。1999 年MOOBERRY等从海绵Cacospongiamycofijiensis，Fasciospongiarimosa和Hyattellasp. 中均发现了新型促进微管稳定化合物laulimalide和isolaulimalide。Laulimalide可以有效促进微管蛋白的聚合,并且与紫杉醇诱导形成的微管蛋白聚合体相似,但促聚合作用低于紫杉醇。用laulimatide处理A210细胞可导致剂量依赖性细胞微管网的重组和异常纺锤体的形成,并能诱导染色体的卷绕和多核仁的形成。

（5）应用调节细胞信号传导通路筛选方法

近年来,部分抗肿瘤药物的研发已从传统的细胞毒药物转移到针对肿瘤细胞内信号传导通路的新型抗肿瘤药物。正常细胞和肿瘤细胞在多种信号传导通路的关键组分间存在巨大差异，因此靶向这些组分的抗肿瘤药物具有高选择性、高效、低毒的特征。目前,药物干预肿瘤细胞信号通路主要是通过环腺嘌呤核苷酸2蛋白激酶A通路、酶联受体信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、钙和钙调蛋白通路等几个通路实现。SAMEL等报道,芥麦( buckwheat)提取物中一种类似于金丝桃蒽酮的物质能够抑制各种蛋白激酶的活性,抑制内皮生长因子和Ins的受体酪氨酸激酶和苏氨酸激酶的活性。李宝元等在观察中药白龙片对人胃癌MGC8023细胞不同周期时相癌基因c2H2ras、c2myc和抑癌基因Rb、P53、P21表达的影响时，发现PKC2α基因表达抑制与c2H2ras、c2myc的表达抑制相似，表明两者之间存在因果关系。

（6）应用肿瘤新生血管生成抑制的筛选方法

肿瘤的新生血管是实体瘤生长、浸润和转移的一个重要因素,它为肿瘤的生长提供必需的营养和氧气。在其生成过程中血管内皮生长因子(VEGF)以及酪氨酸激酶受体(VEGFR)具有极其重要的作用。目前已发现有许多天然药物及其有效成分可以通过多种途径来抑制肿瘤新生血管的生成。

潘子民等发现人参皂苷Rg3经处理后,荷瘤SCD小鼠无腹腔积液形成,腹腔中肿块散播较少。实验组肿瘤组织中VEGFmRNA的表达量、VEGF蛋白表达量和MVD显着低于对照组,从而认为Rg3通过下调肿瘤组织中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达量来阻滞肿瘤血管的生成,抑制肿瘤的转移。姜晓玲等通过比较实验发现, 10μg·mL薏苡仁注射液处理后,极少有新生血管生成,血管生长也很快进入衰退期。因此认为薏苡仁注射液对肿瘤血管生成有显着抑制作用。

（7）天然药物诱导肿瘤细胞调亡的筛选

细胞调亡( apop tosis)是基因调控下的细胞主动死亡,这一过程又称程序化细胞死亡( p rogrammed cell death) 。细胞调亡伴随着细胞质浓缩,细胞核崩裂,微粒消失,细胞膜皱缩,染色质浓缩继而解体,DNA裂成180 bp的倍增片段,最后形成调亡小体。细胞增殖、分化和调亡调节系统的失常将导致细胞恶性生长分裂。研究发现,许多抗肿瘤药物均通过抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞调亡来发挥抗肿瘤作用。

贾彩云等研究表明,蟾酥灵处理过的K562细胞其生长受到明显抑制,形态学呈现出典型的调亡特征性改变,即核染色质凝集、碎裂、延核周边分布,胞膜内陷将变性的细胞内容物包裹成调亡小体,形成DNA电泳的梯状带。因此蟾酥灵能有效诱导白血病K562细胞调亡。

陈洁等通过实验证明竹红菌甲素( hypocrellin A, HA)能够诱导人黑色素瘤(A23752S2)细胞产生调亡,并诱导细胞周期停滞在S期。还能使细胞周期蛋白Cyclin B1的mRNA表达增加。（8）天然药物诱导细胞分化的筛选

恶性肿瘤细胞在形态、功能等方面都类似于未分化的胚胎细胞。诱导分化治疗是指通过药物诱导,使肿瘤细胞向正常细胞转化,同时对正常细胞无杀伤作用，并且很少有骨髓抑制等不良反应。诱导肿瘤细胞分化及逆转是当前肿瘤分子生物学中一个重要的研究领域。

钱军等在研究榄香烯乳对体外培养人肺癌细胞株超微结构的影响时发现，实验组癌细胞给药后出现表面微绒毛减少，细胞核和细胞质比例下降,核周边光滑，切迹浅，核仁常为单个，常染色质减少，异染色质增多等现象；而阳性对照组癌细胞除破碎坏死外，仍显示较高的恶性行为。上述表现提示榄香烯乳在30μg·mL的浓度下对体外肺癌细胞具有一定的诱导作用。CHEN等报道茯苓中的多糖片段可使66. 6%人淋巴瘤U937细胞和49. 4%人早幼粒白血病HL260细胞诱导分化成为成熟的单核细胞和巨噬细胞,使其表现出正常的生理功能并且表达标志性表面抗原CD11b、CD68和CD14 ,同时又检测到IFN2γ和TNF2α水平升高。

（9）结束语

随着分子生物学和分子肿瘤学的发展,人们对肿瘤细胞恶化过程中许多新靶点有了进一步的了解,并且针对这些靶点研究和开发了许多新的天然抗肿瘤药物。近年来,许多天然抗肿瘤药物已经开始采用较原来更加理想的药物筛选系统,而且针对作用机制的药物筛选和药物设计在一定程度上得到了发展。由于肿瘤本身是一种多基因的疾病,目前肿瘤的治疗仍是一个难题，因此尚需要科研工作者不断地努力来发现和设计出更加有效低毒、高选择性的抗肿瘤药物。

2.诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物的筛选方法

答：目前在基础研究中，凋亡的定量分析主要依靠流式细胞术。流式细胞术可以检测细胞凋亡在生化代谢及分子水平的表现，同时阐明凋亡细胞与细胞周期的关系，具有快速、特异性强、灵敏度搞的特点。研究结果表明，有14种化合物具有不同程度的诱导MCF-7细胞凋亡的活性，其中S1、E-10和E-13化合物诱导MCF-7细胞凋亡效果较强。用终浓度20μmol/L 的S1化合物作用MCF-7细胞12h的细胞凋亡比率可达29.7%；终浓度为20μmol/L的E-10作用72h的细胞凋亡比率为29.3%；终浓度为20μmol/L的E-13作用72h的细胞凋亡比率为35.1%。

由于细胞凋亡一场在许多人类恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，科学家们希望通过探讨细胞凋亡机制，了解细胞凋亡与肿瘤细胞死亡的关系，在恶性肿瘤治疗中取得新的突破。以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的理论和技术已成为治疗恶性肿瘤的主要策略之一。这一方面研究的重点内容为设计合成凋亡诱导剂，特异地激活肿瘤细胞凋亡途径，改变肿瘤细胞凋亡的阈值，增加肿瘤敏感性、提高疗效。本研究筛选出14种具有诱导细胞凋亡活性的化合物，但其左右机制还不清楚。进一步研究这些化合物与肿瘤细胞的作用机制，确定化合物直接作用因子、作用因子介导的凋亡信号转导通路、化合物与作用因子的相互作用方式等，将是下一步研究工作的重点内容。

3.细胞冻存与运输

答：细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％．15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1~-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤细胞的运输主要分为三种途径：贴身运输、冰瓶运输、液氮罐运输。

酵母菌的死活细胞鉴定

酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数 一、实验目的 1.掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色方法。 2.了解血球计数板的构造，掌握利用它进行酵母菌计数的方法。 二、实验步骤 1.酵母菌血球计数板镜检计数 1)取一块盖玻片，加盖在血球计数板中央计数室上方。 2)用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，通过毛细作用渗入计数室，注意不能有 气泡产生，然后放置于载物台，静止5min，使细胞全部沉降到其表面。 3)高倍镜镜检，数对角线上5个中方格中细胞的总数，再计算出菌悬液浓度。为 了减少误差，应注意对样品适当稀释，以每个小方格中平均4~6个细胞为佳； 另外，也可对同一样品重复计数，取其平均值。 附:计数板的结构及测定原理 利用血球技术板镜检技术是一种常用的计数方法。血球计数板是一块比普通载玻片厚的特质玻片，其上有四条凹槽，构成三个平台，中间比较宽，其中央又被一短横槽隔成两半，每半边各有一个计数区，其上有9个大方格，只有中央的一个大方格为计数室供计数用。这一大方格的长宽各为1mm。加盖盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm3。 目前血球计数板常用的是25格×16格型，其计数室被分成25个中格，其中每个中格又分为16个小格，故计数室共有400 小格。 计数时，首先把适当浓度的菌悬液注入计数室，然后在显微镜下计数，一般数对角线上5个中方格（共80个小方格）中细胞总数再根据下式求得菌悬液的浓度 细胞个数=5000A×B 式中A---5个中方格中细胞总数 B---菌悬液的稀释倍数 三、实验结果

个数:30 37 11 25 21 24 17 27 28 25

细胞的组成及其结构

考前回归教材—考前读一读 第一部分细胞的组成及其结构 [基本图例] 细 胞 结 构 和 功 能 1．糖类、脂质、蛋白质和核酸共有的元素是C、H、O，除此之外，蛋白质中还含有N等元素，核酸中还含有N、P。 2．组成蛋白质的氨基酸约有20种，不同氨基酸理化性质差异的原因在于R基不同。 3．DNA和RNA在分子组成上的差异表现为DNA中含有脱氧核糖和胸腺嘧啶，而RNA中含有核糖和尿嘧啶。 4．DNA多样性的原因主要是碱基(脱氧核苷酸)的排列顺序不

同；而蛋白质多样性的原因是组成蛋白质的氨基酸的种类、数目、排列顺序以及肽链的空间结构不同。 5．熟记实验中的颜色反应： 蛋白质＋双缩脲试剂→紫色； DNA＋甲基绿染液→绿色； RNA＋吡罗红(派洛宁)染液→红色； 加热砖红色； 还原糖＋斐林试剂――→ 脂肪＋苏丹Ⅲ(Ⅳ)染液→橘黄色(红色)； 线粒体＋健那绿染液→蓝绿色。 6．乳糖和糖原只分布于动物细胞；蔗糖、麦芽糖、淀粉和纤维素只分布于植物细胞。 7．脂质主要包括脂肪、磷脂和固醇，其中固醇又包括胆固醇、性激素和维生素D等。 8.脂肪的含氢量高于糖类，因此氧化分解时，耗O2多，释放能量也多。 9.自由水/结合水的比值越大，生物新陈代谢越旺盛，但其抗逆性相对较小。 10.原核细胞没有核膜、核仁、染色体及除核糖体以外的细胞器。 11.各种生物膜都主要由脂质、蛋白质组成，细胞膜还含有少量糖类。功能越复杂的膜中，蛋白质的种类和数量越多。 12.生物膜的结构特点是具有一定的流动性，功能特性是具有选择透过性。 13.生物膜系统包括细胞膜、核膜及具膜细胞器。核糖体、中心体不是生物膜系统的组成成分。 14.内质网膜与核膜、细胞膜能直接转化，高尔基体膜与内质网

植物细胞的活体染色与死活鉴定

姓名班级齐鲁医学班学号 科目普通生物学实验题目植物细胞的活体染色与死活鉴定 植物细胞的活体染色与死活鉴定 实验目的： 1.了解活体染色的概念和原理 2.学会鉴别细胞的死活 实验原理： ●活体染色是利用某种对植物无害的染料溶液对活细胞进行染色的技术。 ●中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性pH指示剂，变色范围在pH6.4~8.0之间（由红 变黄）。在酸性条件下中性红解离度很强，带色的阳离子呈樱桃红色，在pH7以上，它不解离而以分子态溶于水呈橙黄色的溶液。 ●染色：即使是显微镜有足够的分辨率和合适的放大倍数，未经染色的组织切片或涂片常常不能直 接在光镜下观察，其原因主要是标本各部分结构对光的折射率没有显著的差别。染色则是通过改变标本各部分之间对光的折射率，使其可以在光镜下观察。 ●在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况 下呈酸性反应。因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内。因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。

姓名班级齐鲁医学班学号 科目普通生物学实验题目植物细胞的活体染色与死活鉴定 仪器与用具： 显微镜；载玻片；盖玻片；单面刀片；尖头镊子；酒精灯；火柴；吸水纸适量。 试剂： 0.03%中性红溶液；1mol/L硝酸钾溶液 实验步骤： 1.切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5cm2左右的小块，用尖头镊子将 内表皮小块轻轻撕下，将制好的洋葱鳞茎内表皮放置于滴加蒸馏水的载玻片上，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，多余液体用吸水纸吸干，在显微镜下观察（注意调节光线强度） 2.另取一小块表皮，滴加0.03%的中性红溶液，染色5~10min；在蒸馏水中稍加冲洗，在载玻片 上滴一滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，多余液体用吸水纸吸干，在显微镜下观察。 3.将步骤2中的活体染色制片取出几片放入pH略高于7.0的自来水中浸泡10~15min，再置于载 玻片上镜检（为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入1mol/L的硝酸钾溶液中浸泡10min左右，然后取出观察。） 4.将步骤3中的活体制片放在酒精灯火焰上微微加热，以杀死细胞，再在显微镜下观察 实验结果： 第一步的观察结果：细胞呈无色透明状态，液泡充盈整个细胞，细胞彼此排列紧密，可见细胞壁。

土的分类与鉴定

土的分类与鉴定 土属于第四系的松散堆积物，其结构松散，成因复杂。根据地质成因，可划分为残积土、坡积土、洪积土、淤积土、冰积土和风积土等。据土的颗粒级配、塑性指标、液限或孔隙比可将土分为碎土石、砂土、粉土、粘性土和淤泥质土。根据形成时代晚更新世Q3及其以前沉积的土，定为老沉积土；第四纪全新世中近期沉积的土，为新近沉积土。 1．土的描述与定名 在岩土工程中，土的分类主要依据其粒度成分，并结合其成因和时代进行命名。因此在现场勘察时应注意划分成因和时代，并详细描述土的成分和结构特征。 碎石土应描述： 砂土应描述： 粉土应描述： 粘性土应描述： 2．碎土石的分类 粒径大于2mm的颗粒质量超过总质量50%的土，应定名

为碎石土，并按下表进一步分类。定名时，应根据颗粒级配由大到小以最先符合者确定。 表1-11 碎石土分类 土的名称 颗粒形状 颗粒级配 漂石 圆形及亚圆形为主 粒径大于200mm的颗粒质量超过总质量

50% 块石 棱角形为主 卵石 圆形及亚圆形为主 粒径大于20mm的颗粒质量超过总质量50% 碎石

棱角形为主 圆砾 圆形及亚圆形为主 粒径大于2mm的颗粒质量超过总质量50% 角砾 棱角形为主

碎石土的密实度可根据圆锥动力触探锤击数确定，对于平均粒径等于或小于50mm，且最大粒径小于100mm的碎石土，可用重型动力触探锤击数N63.5按表1-12分类。并按表1-13的修正系数对锤击数N63.5进行修正。 表1-12 碎石土密实度按N63.5分类 重型动力触探锤击数N63.5 N63.5＞20 5＜N63.5≤20 5＜N63.5≤10 N63.5≤5

1.酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别-4学时

1.酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别-4学时

实验一酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别 预习内容： 1. 光学显微镜的使用（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，23-27页） 2. 酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，91-95页）预习思考题： 1. 随着物镜放大倍数的增加，视野的亮度是增强还是减弱？应如何调节？视野范围是如何变化的？ 2. 制作水浸片时如何避免产生气泡？ 3. 影响活菌数目的因素有哪些？染液浓度、染色时间及染色时的pH等因素对死活细胞数目比例有什么影响？ 4. 如何测定酵母菌死亡率？简述其原理。 5. 标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它? 一、实验目的与要求 1. 了解普通光学显微镜的构造及原理，正确掌握使用显微镜的方法； 2. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式； 3. 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 4. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、实验原理 1. 酵母菌 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大，采用涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。 大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式，并对酵母细胞进行死活染色鉴别。

2. 美蓝染液 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母 活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使 美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还 原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观 察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。 图1：酵母菌美蓝浸片观察3min（10×40）图2：酵母菌浸片观察30min（10×40） 三、实验设备及材料 1. 菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2 天左右的豆芽汁液体培养物(需稀释)。 2. 溶液或试剂：0.1%和0.05%吕氏碱性美蓝溶液(或0.01%美蓝水溶液)，革 兰氏染色用碘液等。 3．器材：显微镜，擦镜纸，吸水纸，盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、胶 头滴管、小烧杯、洗瓶等等。 四、实验步骤与内容 1．美蓝浸片的观察 （1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种 环挑取少量酵母菌放在染液中，并用接种环将其混合均匀，酒精灯上灼烧清洗 接种环。

PBMC细胞分类与不同细胞比例

P B M C细胞分类与不同 细胞比例 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020

20m l血液大约提取9.6-13.6X106P B M C PBMC（外周血单个核细胞）包括淋巴细胞（T、B、NK）、单核细胞和树突状细胞。在人体中这些细胞的比例因人而异。在多数研究中，淋巴细胞约占PBMC的70～90％，单核细胞约为10～30％，树突状细胞非常少，约为1～2％。 对其中占多数的淋巴细胞进一步细分，可发现其中70～85％为CD3＋T细胞（折算成PBMC的比例约45～70％），5～20％为B细胞（折算成PBMC的比例约15％），5～20％为NK细胞（折算成PBMC的比例约15％）。 CD3＋T细胞由CD4＋T细胞（约占PBMC25～60％）和CD8＋T细胞（约占PBMC5～30％），比例约2：1。CD4＋和CD8＋T细胞均可进一步分为初始T （naiveT）、接触过抗原的中心记忆性、效应记忆性和效应性T细胞。对于这些亚群，由于不同研究使用的标记不同，故比例亦相差较大。 CD4＋T细胞又称为辅助性T细胞，可按照细胞因子表达的不同而继续分为不同的功能亚群，包括调节性T细胞、Th1、Th2、Th17、Th9、滤泡辅助性T、TR1等亚群。这些亚群的区分只会越来越复杂。CD8＋细胞毒性T细胞现在可大致分为200个功能表型。 循环B细胞包括过渡型、未致敏、记忆型以及浆母细胞，各个亚群比例不一。循环树突状细胞包括浆细胞样树突状细胞和髓系来源树突状细胞。循环单核细胞可分为经典型单核细胞和非经典型CD16＋促炎症反应单核细胞（约占单核的10％）。 人类免疫系统功能研究极其依赖PBMC的表型和功能评估，因此对外周血各类亚群表型和功能、PBMC与组织免疫细胞的不同进行充分了解是非常必要的。

1酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别4学时

实验一酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别 预习内容: 1、光学显微镜的使用（参见周德庆,微生物学实验教程第3 版,23-27 页） 2、酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆,微生物学实验教程第3 版,91-95 页） 预习思考题: 1、随着物镜放大倍数的增加,视野的亮度就是增强还就是减弱？应如何调节？视野范围就是如何变化的？ 2、制作水浸片时如何避免产生气泡？ 3、影响活菌数目的因素有哪些？染液浓度、染色时间及染色时的pH 等因素对死活细胞数目比例有什么影响？ 4、如何测定酵母菌死亡率？简述其原理。 5、标本片上的某一物象,第一次瞧到后如何再次找到它? 一、实验目的与要求 1、了解普通光学显微镜的构造及原理,正确掌握使用显微镜的方法; 2、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式; 3、学习区分酵母菌死活细胞的实验方法; 4、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、实验原理 1、酵母菌 酵母菌就是不运动的单细胞真核微生物,其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍,不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大,采用涂片的方法制片有可能损伤细胞,一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。 大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖,有的分裂繁殖;有性繁殖就是通过接合 产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片与水一碘液水浸片来观察酵母的形态与出芽生殖方式,并对酵母细胞进行死活染色鉴别。

美蓝就是一种无毒性的染料 ， 它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形 态,也可用来鉴别酵母菌的死细胞与活细胞。 图1：酵母菌美蓝浸片观察3min(10 X40)图2:酵母菌美蓝浸片观察30min(10 X40) 三、实验设备及材料 1、菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia? 或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensi培养2天左右的豆芽汁液体培养物(需稀释)。 2、溶液或试剂：0、1%与0、05%吕氏碱性美蓝溶液(或0、01%美蓝水溶液), 革兰氏染色用碘液等。 3?器材:显微镜，擦镜纸，吸水纸,盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、胶头滴管、小烧杯、洗瓶等等。 四、实验步骤与内容 1. 美蓝浸片的观察 (1) 在载玻片中央加一滴0、1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，并用接种环将其混合均匀，酒精灯上灼烧清洗接种环。 注:染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。用接种环将菌体与染液混合时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。 (2) 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，用吸水纸吸取多余的液体。 2、美蓝染液

司法鉴定执业分类规定(试行)(2000年11月29日)

司法鉴定执业分类规定(试行) 司法部 司法鉴定执业分类规定(试行) (2000年11月29日) 第一章总则 第一条为加强对面向社会服务的司法鉴定工作的管理，规范司法鉴定执业活动，根据面向社会服务的司法鉴定工作的实际需要，制定本执业分类规定。 第二条本执业分类规定根据当前我国司法鉴定的专业设置情况、学科发展方向、技术手段、检验和鉴定内容，并参考国际惯例而制订。 第三条本执业分类规定是确定面向社会服务的司法鉴定人职业(执业)资格和司法鉴定机构鉴定业务范围的依据。 第二章分则 第四条法医病理鉴定：运用法医病理学的理论和技术，通过尸体外表检查、尸体解剖检验，组织切片观察、毒物分析和书证审查等，对涉及与法律有关的医学问题进行鉴定或推断。其主要内容包括：死亡原因鉴定、死亡方式鉴定、死亡时间推断、致伤(死)物认定、生前伤与死后伤鉴别、死后个体识别等。 第五条法医临床鉴定：运用法医临床学的理论和技术，对涉及与法律有关的医学问题进行鉴定和评定。其主要内容包括：人身损伤程度鉴定、损伤与疾病关系评定、道路交通事故受伤人员伤残程度评定、职工工伤与职业病致残程度评定、劳动能力评定、活体年龄鉴定、性功能鉴定、医疗纠纷鉴定、诈病(伤)及造作病(伤)鉴定、致伤物和致伤方式推断等。 第六条法医精神病鉴定：运用司法精神病学的理论和方法，对涉及与法律有关的精神状态、法定能力(如刑事责任能力、受审能力、服刑能力、民事行为能力、监护能力、被害人自我防卫能力、作证能力等)、精神损伤程度、智能障碍等问题进行鉴定。 第七条法医物证鉴定：运用免疫学、生物学、生物化学、分子生物学等的理论和方法，利用遗传学标记系统的多态性对生物学检材的种类、种属及个体来源进行鉴定。其主要内容包括：个体识别、亲子鉴定、性别鉴定、种族和种属认定等。第八条法医毒物鉴定：运用法医毒物学的理论和方法，结合现代仪器分析技术，，对体内外未知毒(药)物、毒品及代谢物进行定性、定量分析，并通过对毒物毒性、中毒机理、代谢功能的分析，结合中毒表现、尸检所见，综合作出毒(药)物中毒的鉴定。 第九条司法会计鉴定：运用司法会计学的原理和方法，通过检查、计算，验证和鉴证对会计凭证、会计账簿、会计报表和其他会计资料等财务状况进行鉴定。第十条文书司法鉴定：运用文件检验学的原理和技术，对文书的笔迹、印章、印文、文书的制作及工具、文书形成时间等问题进行鉴定。

台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理

台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理 通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。 染色原理: 正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。 台盼蓝拒染法 台盼蓝拒染法是利用台盼蓝只能将死细胞染成蓝色而活细胞不能被染上的方法检测细胞存活率的一种快速简便的方法。 染色原理: 正常细胞具有完整的细胞膜结构，而死亡的细胞其细胞膜结构被破坏。台盼蓝无法通过正常的细胞膜因而正常的细胞不被台盼蓝染上，而死细胞则可被台盼蓝染成蓝色。 流程: （1）将对数生长期的细胞浓度调整为1~10×10细胞/ml，按10~10个细胞接种于96孔板，每孔100 μl； （2）培养细胞24小时后，对其进行不同处理，每个处理设三个平行对照； （3）收集细胞，经台盼蓝染色，在倒置显微镜下计数蓝染及不染色细胞，计算细胞存活率； （4）结果统计： 镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。 根据下式求细胞活力： 活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100 注意事项:

台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。 科研试剂，广泛应用于分子生物学，药理学等科研方面，严禁用于人体。本品为生物染色剂，在细胞毒性试验中用于检测死亡细胞和垂死细胞，也可用于细胞活性的常规评估。如病毒检验，注入循环系统可使肾小管着色，哺乳动物、低等脊椎动物和昆虫的各种组织活体染色。 台盼蓝染色的主要（原理）步骤： 1. 用Hanks液配制0.1%台盼蓝溶液； 2. 用0.5%胰蛋白酶：0.2%EDTA=1：1混合液来消化培养的贴壁细胞； 3. 再加入适量Hanks液制成细胞悬液； 4. 将待染色细胞稀释至所需浓度（方法及浓度范围与细胞计数相同）； 5. 每0.1ml细胞悬液约加新鲜配制的染液一小滴，室温下染3—5min； 6. 染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放高倍镜下观察； 7. 死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽。活细胞不着色并保持正常形态，有光泽； 8. 计数1000个细胞中的活细胞和死细胞数目； 9. 统计未染色细胞。可按公式计算出细胞活率。 细胞活率（%）=未染色的细胞数/观察的细胞总数×100。 死细胞的细胞膜无屏障作用，台盼蓝马上进入细胞而显蓝色。活细胞细胞膜有选择透性，对台盼蓝的透性小，进入细胞慢。若染色时间过长，台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入细胞。 通常认为细胞膜丧失完整性,细胞即可被认为已经死亡.台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂.健康的正常细胞能够排斥台盼蓝,而死亡的细胞,膜的完整性丧失,通透性增加,细胞可被台盼蓝染成蓝色.依据此原理,细胞经台盼蓝染色后,可通过显微镜,直接镜下计数或拍照后计数,实现对细胞存活率比较精确的定量分析。 作为细胞染色剂之一的台盼蓝(Trypan Blue)已被证明受到活体细胞的排斥，而死亡细胞摄入染料显示蓝色。通过常用的光学显微镜可以观察到细胞染色情况，同时可以定量计数，但是该染色无法区别自杀细胞还是坏死细胞。

死活细胞的鉴定方法

活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以，在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。 不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 常用的方法包括染色法和仪器分析法。 1 染色法 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身

细胞工程复习题及答案

细胞工程复习题 一、名词解释 1.细胞工程：以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状,生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。 2.外植体：指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料 3.植物组织培养：将植物的器官、组织或细胞，在无菌条件下接种于人工配置的培养基上，使其细胞分裂、增值、分化、发育，甚至形成完整植株的方法。 4.愈伤组织：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。 5．离体无性繁殖:简称离体繁殖，是指利用组织培养方法进行植物离体培养，在短期内获得大量遗传性一致个体的方法。 6．继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。 7.体细胞杂交：（原生质体融合）指在人工控制条件下不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。 8 细胞分化：即由于细胞的分工而导致的细胞结构和功能的改变，或发育方式改变的过程。 9 细胞脱分化：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。 10 细胞再分化：即脱分化后的分生细胞在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体，这一过程成为细胞再分化。 11 人工种子：指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。 12 植物细胞全能性：指植物体的每一个活细胞都具有该植物的全套遗传信息，具备发育完整植株的潜在能力。 13 胚状体：在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。

土的分类和鉴定

粒组划分 00粒 组统 称 细粒粗粒巨粒 粒组 名称 黏粒粉粒砂粒细粒粗粒卵石粒漂石粒 粒组粒径d的范围/mm ≤ 0.05 0.05＜d≤ 0.075 0.075＜d≤ 2 砾粒60＜d≤200 d＞200 2＜d ≤20 20＜d≤ 60

巨粒土和含巨粒的土的分类 砾类土的分类 土类粒组含量土代号土名称 砾细粒含量＜ 5% 级配Cu≥5， Cc=1～3 GW 级配良好砾 级配不同时满 足上述要求 Gp 级配不良砾 含细粒土砾细粒含量5%～15%GF 含细粒土砾 细粒土质砾15%＜细粒含 量 ≤50%细粒为黏土GC 粘土质砾细粒为黏土GM 粉土质砾 土类土代号土名称 巨粒土巨粒含量≥75%漂石粒> 50% B 漂石 漂石粒≤ 50% Cb 卵石 混合巨粒土50%<巨粒含量 <75% 漂石粒> 50% BSI 混合土漂石 漂石粒≤ 50% CbSI 混合土卵石 巨粒混合土15%≤巨粒含量 ≤50% 漂石> 卵石SIB漂石混合土 漂石≤卵石SICb卵石混合土

砂类土的分类 土类粒组含量土代号 砂细粒含量＜5% 级配Cu≥5 Cc=1～3 SW 级配良好砂 级配不同时满 足上述要求 SP 级配不良砂 含细粒土 砂 细粒含量5%～15%SF 含细粒土砂 细粒土质砂15% ＜细粒含 量≤50% 细粒为黏土SC 黏土质砂 细粒为黏土SM 粉土质砂 细粒土的分类 土的塑性指标在塑性图中的位置 土代号土名称 塑性指数I P 液限w L I P ≥0.63(w L -20) 和I P ≥10 ≥40% CH 高液限粘土

<40% CL 低液限粘土 I P <0.63(w L -20)和I P <10 ≥40% MH 高液限粉土 <40% ML 低液限粉土 黄土,膨胀土和红黏土的分类 土的塑性指标在塑性图中的位置土代号土名称 塑性指数液限w L I P ≥0.73(w L -20) <40% CLY 低液限粘土（黄 土）

细胞死活鉴定

姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者 科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号 【实验目的】 1、回顾细胞培养的有关知识； 2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术 3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程； 5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 7、学习实验过程的详细描述及实验记录。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧

微生物分类鉴定

第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平； 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。 （一）、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )

BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 （二）、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。 图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图

司法鉴定业务分类概况

司法鉴定业务分类概况 根据全国人民代表大会常务委员会《关于司法鉴定管理问题的决定》第二条规定：国家对从事下列司法鉴定业务的鉴定人和鉴定机构实行登记管理制度：（一）法医类鉴定； （二）物证类鉴定； （三）声像资料鉴定； （四）根据诉讼需要由国务院司法行政部门商最高人民法院、最高人民检察院确定的其他应当对鉴定人和鉴定机构实行登记管理的鉴定事项。 法律对前款规定事项的鉴定人和鉴定机构的管理另有规定的，从其规定。其中： （一）法医类鉴定，包括法医病理鉴定、法医临床鉴定；法医精神病鉴定、法医物证鉴定和法医毒物鉴定。 （二）物证类鉴定，包括文书鉴定、痕迹鉴定和微量鉴定。 （三）声像资料鉴定，包括对录音带、录像带、磁盘、光盘、图片等载体上记录的声音、图像信息的真实性、完整性及其所反映的情况过程进行的鉴定和对记录的声音、图像中的语言、人体、物体作出种类或者同一认定。 此外根据诉讼活动的需要，诉讼中涉及到的其它鉴定业务还有：计算机司法鉴定、环境监测司法鉴定、工程造价司法鉴定、产品质量司法鉴定、司法会计鉴定、知识产权司法鉴定、税务司法鉴定、农业司法鉴定、资产评估司法鉴定、建筑工程司法鉴定、枪弹痕迹司法鉴定等。上述鉴定机构和鉴定人的统一登记管理事项在国务院司法行政部门商最高人民法院、最高人民检察院确定后，将统一纳入司法行政部门登记管理范围。 法医病理鉴定 “法医病理鉴定”，俗称尸体鉴定。参考目前国内的有关规定，法医病理鉴定，是指运用法医病理学的理论和技术，通过尸体外表检查、尸体解剖检验、组织切片观察、毒物分析和书证审查等，对涉及与法律有关的医学问题进行鉴定或推断。其主要内容包括：死亡原因鉴定、死亡方式鉴定、死亡时间推断、致伤（死）物认定、生前伤与死后伤鉴别、死后个体识别等。刑事诉讼法第条规定：“对于死因不明的尸体，公安机关有权决定解剖，并通知死者家属到场。”公安部关于《刑事案件现场勘查规则》规定：“勘验有尸体的现场，必须有法医参加，尸体检验要求做到：详细检查死者的衣着情况，尸体的外表现象以及伤痕的形状、大小和位置；根据需要，捺印十指指纹和掌纹，提取血、尿、胃内容等；对无名尸体的相貌特征，生理、病理特征，以及衣着、携带物品和尸体包装物的特征，进行细致检查，详细记载，并一律捺印十指指纹和掌纹。”法医病理鉴定主要涉及以下内容：一是确定死亡原因，主要在于确定自然死亡（病死或老死）还是非自然死亡（暴力死亡），在同时存在损伤与疾病时，要分析损伤、疾病与死亡的关系，对于存在几种致命性损伤，应确定主要死因，以便澄清谁应负主要致死责任。二是判定致死方式，即判定是他杀、自杀还是意外死亡，判定致死方式要比确定

死活细胞的鉴别word版

（一）、死活细胞的鉴别 生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微 镜来观察。 染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方 法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。由于未 经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。 所用染料的分类： 一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染 料才能进入细胞膜。 第一类：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。它们不容易 穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。如①台盼兰（Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加 0.1ml 染液，2 分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。②苯胺兰(Aniline’ black)： 0.05%的苯胺黑以 1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。 ③伊红 Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。等。 第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯 胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一 特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构 专一性的结合。 ①1%结晶紫染色生理 1%结晶紫盐水与细胞悬液 1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成 蓝紫色，而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒，无物理、化学变 化，基本上不影响细胞的生命活动。 ②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。 丫啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发 下，DNA 可激发出 530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出 640nm 的荧光发射峰， 它与双链 DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸 引堆积在磷酸根上。在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质 RNA Page 9发桔红色荧光。因此，原来的活细胞经固定、染色后细胞核呈亮绿色，核仁和散 布在细胞质中的 RNA 呈桔红色，胞质其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因物 质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。但丫啶橙的阳离子也可以结合 在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但由于经过细胞固定抑制了这种结合，从而主 要显示出的是 DNA 和 RNA 两种核酸。 本次实验即选用活细胞染料健那绿来显示线粒体。 （二）细胞核和染色体的染色 Giemsa 染色：姬姆萨是常用的染料，可观察核、染色体。 醋酸地依红染色：可显示有丝分裂染色体的微细结构，如次缢痕、染色质 丝的螺旋化等。该染料同时具有固定和染色的作用，因此也可用来坐快速检查有 丝分裂指数。（细胞涂片，0.075 mol 的 KCI 低渗 5-10 分钟，使细胞膨胀，染色 体分裂；甲醇固定 10 分钟，空气干燥，滴加 2%醋酸地衣红，染 10-20 分钟后即 可观察。 （三）细胞器的特殊染色

07 动物细胞培养及死活细胞鉴别

山东大学实验报告2018年5月21日 ________________________________________ _________________________ 姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午 科目：细胞生物学实验题目：动物细胞培养及死活细胞鉴别学号：201600140055 一、目的要求 1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2.了解并掌握进行动物细胞原代培养的实验方法。 3.了解动物细胞培养的原理及注意事项。 4.学习细胞生死状态鉴别的方法。 5.了解细胞生死状态鉴别的原理。 6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7.掌握细胞计数方法，计算细胞存活率 二、实验原理 1、细胞培养 细胞培养技术指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术，也叫细胞克隆技术。 细胞培养技术可以由一个细胞经过一段时间的培养得到大批的简单的单细胞或极少分化的多细胞，通过细胞培养可以得到大量的细胞或细胞代谢产物。细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。 细胞培养具有其他生物技术无可比拟的优点：培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构，细胞生长及发育等过程的观察。在生物学的各个领域已被广泛应用。 但细胞培养也存在一定的局限性：细胞的培养是在脱离了机体的外界环境之中，与体内环境存在一定的差别，因此细胞培养过程中观察到的现象有时难以正确反映机体内的状况。 2、细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存在以下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允 许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台 盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶（PI）或溴化乙啶（EB）等 为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。 此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择 透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁 分离。

细菌分类鉴定方法的研究进展

细菌分类鉴定方法的研究进展 目录 细菌分类鉴定方法的研究进展 (2) 摘要 (2) ABSTRATC (3) 1、引言 (4) 1.1细菌分类鉴定 (4) 1.1.1 细菌常规鉴定方法 (4) 1.1.2细菌的数值分类和自动化鉴定 (4) 1.1.3化学分类鉴定法 (4) 1.1.4分子遗传学分类鉴定法 (4) 1.2细菌分类鉴定方法的前景 (5) 细菌的鉴定方法的介绍与总结 (5) 1、细菌常规鉴定方法 (5) 1. 1 免疫诊断技术 (5) 1. 1. 1 凝集试验 (5) 1. 1. 2 免疫酶技术 (5) 1.1. 3 免疫荧光技术 (5) 1. 1. 4 放射免疫测定技术 (6) 1. 1. 5 免疫胶体金标记技术 (6) 1. 2 蛋白质图谱分析 (6) 2、细菌的数值分类和自动化鉴定 (6) 3、化学分类鉴定法 (7) 3.1 磷脂脂肪酸分析技术（PLFA）[6] (7) 3．2 高效液相色谱（HPLC）[7] (7) 3.3 气相色谱（GC）[7] (7) 4、分子遗传学分类鉴定法 (7) 4. 1 细菌染色体DNA G+ C mol %含量测定 (7) 4. 2 核酸杂交技术 (7) 4. 3 限制性核酸内切酶分析法 (7) 4. 4 质粒图谱分析法 (7) 4. 5 脉冲场凝胶电泳分析法 (8) 4. 6 PCR技术 (8)

4. 7 16SrRNA 序列和16S～23SrRNA 间区序列分析法 (8) 4. 8 微生物全基因组测序 (8) 6、参考文献 (9) 细菌分类鉴定方法的研究进展 摘要 细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平:细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。表型鉴定法是对前3个水平的鉴定,包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。分子遗传学鉴定法[1]是核酸水平的鉴定,对细菌染色体或质粒DNA 进行分析,核酸杂交、PCR 技术、16SrRNA 和16 ～23SrRNA 序列分析、全基因组测序等,此类方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定。本文主要来介绍各种分类方法以及每种方法的优缺点。 关键词：细菌分类鉴定表型鉴定分子遗传学鉴定