猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定
猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定
曾显成 陈家祥 吴异健 姚金水 吴宝成3 福建农林大学动物科学学院 福州 350002
摘 要 从福州郊区某猪场发生疑似伪狂犬病的仔猪中分离到一株病毒。该病毒株感染Vero细胞、MD CK细胞均可产生典型的细胞病变,并可见合胞体。感染仔猪症状较轻,但在攻毒后25d,可检测到伪狂犬病抗体,并在仔猪的肺气管冲洗液中回收到同样理化特性的病毒。接种成兔和小白鼠均可出现典型的伪狂犬病症状。电镜观察可见110～180nm大小不等、不规则圆形、有囊膜的伪狂犬病毒粒子。用MDCK细胞测定其TCID50为10-61604/011m L,能被PR V标准阳性血清所中和,效价为1∶77。对乙醚、热、胰蛋白酶敏感,在pH510～910之间保持稳定。尿囊膜接种9～12日龄鸡胚,86h可见尿囊膜水肿、出血,有大小不一白色痘斑样病灶,胚体萎缩,头盖部突起、全身弥漫性出血。制作细胞飞片,8h用PRV荧光抗体染色,可观察到细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光。PCR反应可扩增出特异性1579bp DN A片段。证实分离的病毒株为伪狂犬病病毒,并命名为PRV FZ株。关键词 猪伪狂犬病毒(PR V) 分离鉴定 FZ株
中图分类号:S852165+911 文献标识码:A 文章编号:1003-4331(2007)07-0024-04
Iso la tion a nd Identi f ica tio n of por ci ne pseudor a bies vir us FZ str a i n
Z eng X iancheng Chen Jiaxiang W u Y ijian Y ao Jingshui Wu Baocheng3
(C ollege o f animal science,Fujian Agricu lture and Fores try Univers ity,Fuzhou 350002)
Abstract A virus strain was is olated from a pig farm suspected of Pseud orabies disease in Fuzhou.T he v irus induced typical Cy topath ogenic ef2 fect(CPE)after inn ocu lation in Vero and M DCK cells,w ith the appearan ce of cell syncy tium.Pigs w ere g enerally insensitive to the v irus in fec2 tion and d id not d evelop dis ease sym pt oms.H ow ever,antibody against this virus was detected after25days of inn oculation,and virus particles w ere isolated from the lungs o f y oung pigs.Im portantly,inn oculation o f adult rabbits and mice w ith the v irus resulted in ty pical clin ical sy mptoms o f Pseud orabies.Th e virus particles exhib ited spherical shape of various s izes(110～180nm)and contained a lipid envelope,as ev idenced by transmiss ion electron micros co py.T issue culture infectious d os e(T CI D50)o f th e virus in MD CK cells was10-6.604/0.1mL,and the v irus in fec2 tion could be n eutralized by PRV positive serum,with a ratio o f1∶77(antiserum/v irus titer).T he virus was sensitiv e to ether,heat,or trypsin inactivation,but was s tab le between pH5.0～9.0.T he v irus in fected9～12d ays chicken embry os,after86hours,devel oped clinical sym pt oms characteristic of Pseud orabies v irus(PRV)in fection,including p ock mark formation,wh ole body hemorrhage,and skull break ou t,etc.Further2 m ore,we have detected viral protein s ynthes is in in fected cells w ith immuno flu orescen ce m icroscopy us ing PRV-speci fic antib odies,and we have success fully ampli fied a1579-nucleotide frag ment v ia polymerase chain reaction(PCR)by usin g PR V-speci fic olig onucleotide primers,thus dem onstrating that the v irus w e is olated is a strain o f Pseud orabies v irus.W e n ame th e n ew virus as PRV FZ.
K ey w or ds pseudorabies v irus(PRV) isolation and identi fication FZ s train
猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)又名猪疱疹病毒I型(P orcine her pesvirus Ty pe I),属于疱疹病毒科(H erpesviridae)的甲亚科(Alphaherpesririnae)水痘病毒属(V aricello virus),引起猪、牛、羊等多种家畜、家禽及野生动物的一种以发热、奇痒(猪除外)、呼吸和神经系统疾病为特征的急性传染病,又称Aujeszky病。猪是该病毒的天然宿主、贮存者和传染源。猪感染该病后其症状因日龄不同而异,仔猪感染后死亡率很高,可达100%;妊娠母猪感染后引起流产,产木乃伊胎和死胎;成年猪一般为隐性感染,不表现临床症状,但病毒可在动物体保存很长时间。到目前为止,世界上已有40多个国家报道该病的发生。在我国,邓仕伟等[1]统计该病已涉及包括香港、台湾在内的3个省市。该病的流行在全球范围内呈持续上升趋势,目前已成为养猪业危害最大的疾病之一。从发病仔猪中分离到一株病毒,经试验证实为伪狂犬病毒。
1 材料与方法
111 材 料
11111 细胞和血清 Ver o细胞和MDCK细胞为本实验室保存;猪伪狂犬病病毒中和试验标准阳性、阴性血清购自华中农业大学。
11112 试验动物 仔猪和成兔购自福州市郊区某养殖户;小白鼠购自福建医科大学动物实验中心;肉仔鸡购自福建农林大学家禽试验场。
11113 主要试剂 1640培养基(美国G I BC O)购自上海英骏生物技术公司;PRV荧光抗体购自中国兽医药品监察所;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;伪狂犬病乳胶凝集试剂盒购自华中农业大学;T q DN聚合酶、蛋白酶K等均购自宝生物工程(大连)有限公司。
1 方 法
81a A
12
11211 病料处理 从福州郊区某发病猪场疑似伪狂犬病病死仔猪中采集鼻腔粘液,脑、脾、扁桃体、肾等组织,分别研磨,用灭菌的H ank ’s 液按1∶5稀释,
-20℃反复冻融3次。经3000r/min 离心20min ,取上清液经0122μm 微孔滤器过滤,无菌检验后,-70℃保存,作为分离病毒的材料。
11212 病毒分离 将上述处理的材料分别接种刚长满单层新鲜的V er o 细胞,每瓶接种1m L ,每个样品接种2瓶(100m L 玻璃细胞瓶),设1瓶正常细胞作对照。37℃吸附1h ,弃上清,用H ank ’s 液轻轻润洗1次,然后加入10m L 含2%胎牛血清的1640维持液。培养观察3d ,盲传3代,出现细胞病变(CPE)者则继续传代。Vero 传15代以后,用具有典型CPE 的细胞培养物接种M DCK 细胞,当病毒适应该细胞后进行病毒克隆纯化及病毒蚀斑计算。
11213 病毒增殖 在长成单层新鲜的MDCK 细胞上按1/100剂量分别接种克隆病毒株,待CPE 达80%时收获病毒液,-70℃冻存,作为病毒鉴定的种毒。11214 病毒鉴定1121411 电镜观察 待病毒感染MD CK 细胞CPE 达约30%时,无菌刮下病变细胞,3500r/min 离心10min ,弃上清,立即加入3倍量电镜固定液,48h 后制作细胞组织超薄切片,在电镜下观察病毒粒子形态。1121412 病毒TCI D 50的测定[2] 采用微量法测定病毒在MDCK 细胞上的感染力。按照Reed -Muench 氏法计算病毒的TCI D 50。
1121413 病毒中和试验[2] 采用固定病毒稀释血清法,按照Reed -Muench 氏法计算病毒的半数保护量(PD 50),即该血清的中和效价。
1121414 病毒理化性质 病毒对乙醚、胰蛋白酶敏感性试验及病毒对酸碱和热的耐受性试验,均按参考文献[2]进行。
1121415 动物试验 将分离种毒分别接种19日龄PRV 抗体阴性健康仔猪2头,肌注,115m L/头;成兔5只,后肢前侧肌肉接种,110m L/只;小白鼠12只,皮下接种,011m L/只;大鼠2只,腹侧肌肉接种,110m L/只;10日龄肉仔鸡23羽,点眼滴鼻,012m L/羽,同时腿部肌注,015m L/羽。分别设立正常对照组,相同条件隔离饲养,观察发病情况。1121416 鸡胚接种试验 取9～12日龄的SPF 鸡胚10个,采用鸡胚绒毛尿囊膜接种方法,每个接种011L 分离种毒。111 荧光抗体试验 制作细胞飞片,当开始出现时,丙酮固定,滴加猪伪狂犬荧光抗体
覆盖于飞片表面,置37℃湿盒中感作45～60min ,然
后用P BS 液洗涤,风干,用碳酸盐缓冲甘油(pH 915,015m ol/L )封片,置荧光显微镜下观察。1121418 聚合酶链反应(PCR)鉴定病毒
112141811 引物设计 根据G eneBank 收录的PR V K aplan 株(A J271966),利用引物分析软件Pr imer P re 2mier510设计了一对引物,上游为5′-A TTTG A A TTCC 2CCAG G TTCCC A T AC -3′,下游为5′-CTTG A AG CTTG 2G C AG AG G TCG T A C -3′。扩增长度为1579bp ,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
112141812 PCR 扩增反应 将病毒接种MDCK 细胞,当CPE 达约50%时收集细胞,用常规方法提取病毒D NA 作为P CR 模板[3]。采用50μL 反应体系,上游引物(20pm ol/μl )115μL ,下游引物(20pmol/μl )115μL ,10×Buffer 5μL ,dNTP 4μL ,DMS O 5μL ,PRV DN A 模板5μL ,灭菌超纯水27μL ,将上述成分混合均匀,沸水中变性5m i n ,冰浴5min ,加入Taq DN A 聚合酶1μL ,进行PCR 扩增。扩增条件:(1)95℃预变性5m in ;(2)95℃预变性50s ,58℃退火1min ,72℃延伸115m in ,进行30个循环;(3)72℃延伸10m i n 。将得到的PCR 产物于018%的进口琼脂糖凝胶中电泳,观察扩增的片段。2 结 果
211 细胞病变观察 脑、鼻腔粘液和内脏组织接种Ver o 细胞,均可产生典型CPE 。16h 可见个别细胞开始变圆,肿胀,折光度加强;24h 细胞聚集成簇,中间致密,成灶化状,继而萎缩,脱落,并可见到合胞体。接种MDCK 细胞,CPE 与Vero 细胞基本相同。对照组细胞96h 后仍保持正常。212 病毒蚀斑计算 经过3次筛选,在最大稀释倍数为10-6的细胞单层上可见较小的单个空斑,4孔空斑个数分别为4、3、6、5,共18个。挑取单个空斑继续在MDCK 细胞上传代,出现典型细胞病变时间稳定在接种后16h 左右。根据沈强等[4]方法计算空斑形成单位(PF U)为415×10-5PF U/011m L 。213 电镜观察结果 可见成熟的病毒粒子,直径在110～180nm 之间,呈不规则圆形,有衣壳及囊膜。未成熟的病毒粒子多呈中空状,见图1、图2。214 病毒TCI D 50测定结果 按Reed -Muench 方法计算,在M DCK 细胞上的TCI D 50为10-61604/011m L 。215 中和试验结果 经计算,伪狂犬病病毒标准阳性血清对分离病毒株的中和效价D 5=188,即
该血清的中和效价为∶。
16 病毒理化试验结果 分离的病毒经热、乙醚、酸
8
m 1247CPE 10min P 010-17
1772
碱、胰蛋白酶处理后,接种MDCK 细胞,分别计算其TCI D 50,结果该病毒对热、乙醚、胰蛋白酶敏感,对酸碱有一定的抵抗力,在pH 6～9环境下毒价较稳定。
图1 在崩解的胞浆内有大量的PRV 颗粒
(20060609MDCK 7510kv R ×10K )
图2 在破碎的胞浆内,有成熟的PRV 颗粒
(20060609MDCK 7510kv R ×20K
)217 动物试验结果 仔猪攻毒后48h ,可见偶有搔痒症状;96h ,呼吸急促,打喷嚏,食欲下降,精神沉郁;120h 后,精神逐渐恢复,食欲增加。第25天检
测抗体,结果为阳性,脑膜有轻度充血,并从喉气管冲洗液回收到病毒,感染Vero 细胞和MDCK 细胞均可出现典型的CPE 。成兔接种后55h 开始发病,可见烦燥不安,不时地抓咬接种部位,奇痒。60h ,高度兴奋,频频撕咬接种部位,打滚,发出尖叫声,皮肤受损,出血,暴露出红色肌肉组织,头、颈、背部等多处擦伤。70h ,四肢麻痹,死亡,呈角弓反张状态。小白鼠接种后15h ,表现打堆,怕冷,嗜睡,食欲减退,不爱活动;22h 开始狂燥不安,尖叫,偶见搔痒,出现神经症状;48h 出现被毛逆立,频繁搔痒,高度兴奋,乱撞;死亡只,6共死亡5只,8全部死亡。大鼠及肉仔鸡攻毒后,采食正常,未见异常。正常对照组均健康存活。
218 鸡胚接种试验结果 接种后86h ,可见尿囊膜水肿、充血,出血,并有数量不等、大小不一白色痘斑样病灶,胚体萎缩,头盖部突起,全身弥漫性出血。
对照组鸡胚未见异常。
219 荧光抗体试验结果 在荧光显微镜下观察,结果可见细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光,伪狂犬病毒阳性。2110 PCR 试验结果 将PCR 扩增的产物进行琼脂糖电泳,在约1579bp 处可见明亮的特异性条带,与预期长度相符,见图3。
图3 PRV gD 基因PCR
1和3: PCR 产物 2:D4500Mark ,从上到下分子量依次为4500,3000,2000,1200,800,500,200
3 讨 论
1)从福州郊区某发病猪场的仔猪中分离到一株病毒,该毒株接种V er o 细胞和MD CK 细胞,均可出现典型的细胞病变,并可见合胞体,证实该分离株
宿主范围广,可在多种传代细胞上培养增殖,具有泛
嗜性和溶细胞性,符合疱疹病毒有关特征。与PRV 标准阳性血清中和试验,结果能被标准阳性血清所中和;PRV 荧光抗体试验,观察到细胞浆内发出翠绿色荧光;接种成兔表现奇痒、四肢麻痹、角弓反张,小白鼠表现搔痒、麻痹、尖叫等神经症状,死亡率均为100%,具有嗜神经性;经热、乙醚、酸碱、胰蛋白酶处理,结果该病毒对热、乙醚、胰蛋白酶敏感,对酸碱有一定的抵抗力,在pH6～9环境下毒价较稳定,该病毒为有囊膜病毒。电镜下观察,可见不规则圆形、直径在110～180nm 大小不等的病毒粒子。另外,经PCR 反应,扩增出预期的1579bpDN A 片段。以上试验结果证实,我们分离的病毒株为伪狂犬病病毒,并将该病毒命名为猪PRV FZ 株。
2)该毒株能被PRV 标准阳性血清所中和,中和效价为∶,表明该毒株与RV 标准株有相似的抗原性,进一步证实RV 只有一个血清型的观点,这与整个疱疹病毒的保守性是一致的。RV 荧光抗体
8
72h 29h 10h 144h 177P P P
沙门氏菌通用PCR 快速检测试剂盒的研制与应用
孔繁德1 陈 琼2 徐淑菲1 彭海滨3
(1厦门出入境检验检疫局 厦门 361012;2厦门市农产品质量安全检验测试中心 厦门 361009;
3福建农林大学动物科学学院 福州 351006)
摘 要 根据沙门氏菌fimY 基因建立了用于检测沙门氏菌的通用PCR 方法。对收集的A -F 群标准菌株和临床分离的60株沙门氏菌分离株和11种非沙门氏菌进行PCR 检测,采用210%琼脂糖电泳进行检测,结果所有沙门氏菌均扩增出526bp 的特异性条带,而非沙门氏菌均未扩增出任何条带。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中93cf u 的沙门氏菌,还可检出含3
cfu 的样品用BP 预增菌或MM 增菌后的菌液。说明该方法敏感性高、特异性强。采用直接菌体加入法、热裂解、反复冻融、CT AB 碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板,结果CT A B 法效果最好,但操作烦琐,而直接菌体加入法和热裂解法可
以达到和柱式试剂盒同样的效果,且操作简便快速、经济、效果好,值得推广应用。关键词 沙门氏菌 通用PCR 检测
中图分类号:S852161+2 文献标识码:A 文章编号:1003-4331(2007)07-0027-04
Resear ch an d a ppli cation on ra pid detectio n kit of salmonella by u n iver sal PC R
K ong Fand e 1 Chen Qi ong 2 X u Shu fei 1 Peng H aibin g 3
(1X iamen entry -exit ins pection and quaran tine bureau ,X iamen 361012;2X iamen ag ricultural product quality and safety testing center ,X iamen 361009;3C olleg e o f Animal s cience ,Fujian agricu lture and fores try un iversity ,Fu zh ou 350002)
Abstract Th is study evaluated universal PCR to detect Salm onella s pecies accord ing to fimYgene.T he s pecific primers to the fimY g ene were us ed to amplify standard bacteria o f A -F salmonella ,60salm onella separate strains and 11n on -salm onella species by PCR.Ex periment re 2sults indicated that only Salm onella s pecies generated the specific 526b p DN A frag ments on the 2.0%agarose gel and n on -salm on ella
species con trols gav e negativ e resu lts ,dem ons trating that the primers should be s pecific for Salmonella g enus.T he PCR was able to detect as lit 2tle as 93cfu Salmonella and pre -cultured (BP )or cultured (MM )bacteria liquid o f the sample ob taining 3c f u S almonella.T his indicates es tab 2lished PCR meth od is h igh sensitive and s trongly specific.T he nucleic acid is puried by fiv e meth ods ,including adding bacteria ,hot cleavage ,f reezing -thaw again and again ,CT A B and colu mn reagen t kit ,the CT A B meth od IS best ,but tes ting procedure is multifarious.Adding bacteria and h ot cleavage can procure the same resu lt as column reagent k it and h ave many merits including s im ple ,rapid ,economical and is w orthy to generalization and application.
K ey w or ds salm onella universal PCR detecti on
基金项目:厦门市科技计划项目(3502Z 20042021)资助。
试验表明,8h 就可以检测到MDCK 细胞浆发出翠绿
色荧光,由于该方法速度较快、特异性强、重复性好,利用此方法检测PRV 病毒是一种可靠的手段。
3)接种19日龄仔猪,表现轻微的搔痒症状,食欲减退,打喷嚏,消瘦。饲养25d ,从肺气管冲洗液分离到同样理化特性的病毒。试验表明,该毒株可严重影响仔猪的生长发育,同时说明仔猪隐性感染或隐性带毒的存在。
4)采用病毒感染细胞培养物方法提取病毒D NA ,试验证实这种方法简便快速,又能提取到大量的病毒D NA ,作为模板进行PCR 效果较好。但是,细胞的D N 以及少量的蛋白质可能会干扰扩增效果,导致非特异性扩增带的出现,对于伪狂犬病病毒基因组G 含量较高的病毒尤为突出。在R 反应
体系中,加入10%的D MS O 效果较好[5],成功地扩增出1579bpD N A 片段,减少非特异条带的发生。
参考文献:
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8
A C PC .-g g E J .20021:-70