大黄鱼连续两代雌核发育群体的微卫星标记分析
第34卷 第1期
水生生物学报
Vol. 34, No.1 2010年1月
ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA
Jan. , 2 0 1 0
收稿日期: 2008-04-16, 修订日期: 2009-02-19
基金项目: 国家863计划项目(2006AA10A405); 国家自然科学基金项目(30771663); 福建省青年创新基金项目(2006F3095); 集
美大学创新团队科研基金(2006A001)资助
作者简介: 叶小军(1980—), 男, 汉族, 福建宁德人; 硕士; 研究方向为水产动物遗传育种及生物技术。E-mail: yxj8658@https://www.wendangku.net/doc/a218245426.html, 通讯作者: 王志勇, Tel: 0592-*******; E-mail: zywang@https://www.wendangku.net/doc/a218245426.html,
DOI: 10.3724/SP.J.1035.2010.00144
大黄鱼连续两代雌核发育群体的微卫星标记分析
叶小军1,2 王志勇1 刘贤德1 蔡明夷1 姚翠鸾1
(1. 集美大学水产学院水产生物技术研究所, 福建省高校水产科学与食品安全重点实验室, 厦门 361021;
2. 福建省淡水水产研究所, 福州 350002)
摘要: 通过对大黄鱼(Pseudosciaena crocea )异质雌核发育一代群体(meio-G 1)与二代群体(meio-G 2)微卫星位点的纯合度进行分析, 研究异质雌核发育对大黄鱼基因纯化的效率。结果显示: meio-G 1和meio-G 2 15个微卫星座位的平均纯合度分别为0.661和0.803, 纯合位点比例最高个体分别为0.867(13/15)和0.933(14/15), 两个群体内个体间的平均相似系数分别为0.5903和0.8672, 最高分别达0.9286和1.0(遗传距离为0.0741和0), 远高于两性交配繁殖群体(平均纯合度0.376, 平均相似系数0.4687, 个体间最小遗传距离0.2288); 其中meio-G 2群体有7个位点(46.7%)已经完全纯合固定, 并与普通养殖群体产生较明显的遗传分化; 表明人工诱导异质雌核发育可大大加速大黄鱼大多数基因位点的纯合, 是快速建立高纯品系的有效手段。但不同位点的纯合度差异很大, 部分位点在异质雌核发育后代中迅速纯合, 在meio-G 1中就达到很高的纯合度, 而有些位点则在meio-G 1 和meio-G 2中仍保持很高的杂合度; meio-G 1 和meio-G 2群体中不同个体纯合位点比例差异也很大。研究培育的雌核发育群体为大黄鱼进一步选育提供了良好的遗传材料。 关键词: 大黄鱼; 微卫星; 雌核发育; 纯合度
中图分类号: Q348 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2010)01-0144-08
大黄鱼(Pseudosciaena crocea )隶属鲈形目(Perciformes)、石首鱼科 (Sciaenidae)、黄鱼属 (Pseudosciaena ), 是我国近海特有的重要海水经济鱼类[1,2], 也是目前我国养殖量最大的海水鱼类。自20世纪80年代中期福建省开展大黄鱼人工繁殖和养殖研究取得成功, 人工养殖业随之逐步发展起来之后, 由于在生产中缺乏选育, 近年来大黄鱼养殖群体普遍出现生长减慢、抗病力下降等经济性状退化现象[3]。通过选择育种消除或减少群体中的不利基因, 增加有利基因频率, 是对养殖群体进行遗传改良的重要途径。人工诱导雌核发育被认为是加速动物有利基因纯合固定的有效方法, 已经被应用到数十种不同的鱼类[4?8]; 大黄鱼雌核发育的诱导, 国内也已有多个实验室开展了研究, 但其他实验室的
工作基本局限于研究雌核发育诱导技术[9,10]。作者所在的实验室从2000年开始进行大黄鱼人工诱导雌核发育研究, 先后培育出了异质(即减数分裂型)雌核发育一代群体和二代群体用于良种选育和性别控制, 并用AFLP 标记和微卫星标记对雌核发育体进行了鉴定, 利用2个雌核发育家系测算了18个多态性微卫星标记与着丝粒间的遗传距离[11—14]; 但对于采用多个亲体的卵子混合诱导培育的连续两代雌核发育群体还没有研究报道。本文采用16个多态性微卫星标记对上述两个雌核发育群体进行分析, 并与普通的两性生殖群体进行比较, 研究群体的遗传结构和各个个体基因的纯合度、群体及个体间的相似度和遗传距离, 探讨大黄鱼人工异质雌核发育中基因纯合的规律, 以期为大黄鱼进一步的遗传改良和
1期叶小军等: 大黄鱼连续两代雌核发育群体的微卫星标记分析 145
对雌核发育群体的更好利用提供依据。
1材料与方法
1.1雌核发育群体的培育与样品采集
本研究所用雌核发育一代群体(meio-G1)为2001年4月由4尾优选的雌性大黄鱼所产卵子诱导培育的异质雌核发育后代, 雌核发育二代群体(meio-G2) 是2003年4月挑选4尾成熟的上述雌核发育一代个体, 对其所产卵子再次诱导异质雌核发育培育获得, 雌核发育的诱导方法已见王晓清等[12]的报道, 此处从略。2005年4月和2007年3月分别从meio-G1和meio-G2群体随机取50个体(体重0.8—1.5 kg), 剪取活鱼部分背鳍固定于95%乙醇中, 于4℃下保存; 2007年3月同时采集普通养殖群体(Control)样品作为对照组, 所有群体均培育于福建省宁德市官井洋海区网箱。实验前取所有雌核发育个体的DNA与诱导雌核发育时使用的雄性亲鱼的DNA进行部分微卫星标记的扩增比较, 确认所有个体均不含有雄性亲本的特有等位基因, 为真正的雌核发育体, 然后各选取48个个体进行分析。
1.2基因组DNA的提取
采用传统的酚仿抽提法提取基因组DNA[15], 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
1.3 PCR反应及电泳
微卫星标记引物系本实验室开发[16], 其序列和扩增片段的特征(表1)。PCR反应体系为20 μL, 包括10×buffer 4.0 μL、Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 μL、dNTPs (10 mmol/L) 1.0 μL、上下游引物 (10 μmol/L) 各0.1 μL、模板DNA 50 ng、Taq DNA聚合酶(Promega) 1U, 加适量DDW。反应条件为: 94℃预变
表1引物序列、退火温度及扩增片段大小
Tab. 1 Microsatellite loci, primer sequences, annealing temperature, size of alleles and access number in GenBank of 16
microsatellite loci of large yellow croaker used in this study
座位Loci
引物序列(5′–3′)
Primer sequences (5′–3′)
退火温度
Annealing temperature
(℃)
片段大小
Size of alleles
(bp)
Access number in
GenBank
LYC0002F: 5'-ACCTCCAGTGGGATGTGA-3'
R: 5'-GGCTGTTTGTTATAATTTGTG-3'
50 60—110 EF372237
LYC0004F: 5'-CTCTTAGCCGTCATTCATCC-3'
R: 5'-CATTTAGCCAAGTTCACTTCC-3'
55 90—100 EF372239
LYC0008F: 5'-GAAACAATAGCTCGCTCCTG-3'
R: 5'-GACTCTGCCAGCACATTAGTG-3'
57—55 151—185 EF372243
LYC0009F: 5'-GTCAATCACGTCTGTCTCTGC-3'
R: 5'-TCAGCCATTGTCTGTGAGGT-3'
60 75—105 EF372244
LYC0010F: 5'-GTCTCAGCTGACTCCTGCTTC-3'
R: 5'-ATGGCTCTAAACATGGTAGG-3'
55 205—235 EF372245
LYC0011F: 5'-CTTTTATTGGCTCCGTATGA-3'
R: 5'-CACTCACACTAGCACGCAC-3'
55 82—133 EF372246
LYC0012F: 5'-CAGAACAAACAATGAATGGG-3'
R: 5'-GAGGAGCTCAACAGCAACA-3'
55 90—145 EF372247
LYC0013F: 5'-GCTGCGAGCTACTTTACTCAT-3'
R: 5'-AACTCACAAACATGCAC-3'
50 130—220 EF372248
LYC0015F: 5'-ACAGTCTAAAGCTGCCAGCA-3'
R: 5'-TGAGACCAACCACATTTCTGT-3'
55 103—117 EF372250
LYC0022F: 5'-AGAGATAACGTAGACATGATTG-3'
R: 5'-CAGCAAAAGTTCAAAATGGAG-3'
55—50 143—50 EF372257
LYC0024F:5'-GGCTCGTGCCAGCAGGG-3'
R:5'-GTATGAAGAACATGTGCAGTG-3'
55—50 180—190 EF372259
LYC0027F:5'-CACCCAATAATATCGCCATA-3'
R:5'-GCACACACAATCATCATCATT-3'
50 74—95 EF372262
LYC0031F: 5'-GTCCTTCCCTAAAGCGAGG-3'
R: 5'-CTCCCGTCCTGAGCTCAAC-3'
55—50 200—210 EF372266
LYC0032F: 5'-GGGAGAAGCAGCAGGACA-3'
R: 5'-GAAACAAGAGCACTGAGAGCC-3'
50 200—210 EF372267
LYC0033F: 5'-GGATGGAGGAGTGATGATGG-3'
R: 5'-GCACTGAGACCTGAATGCTCC-3'
50 150—160 EF372268
LYC0036F: 5'-GCATTCATGGATTAGACTGC-3'
R: 5'-GGGTGAGTGTCGGAAGTTC-3'
50 203—225 EF372271
146 水生生物学报34卷
性5min; 94℃ 30s, 50—55℃ 30s, 72℃ 30s, 25—30
个循环; 最后72℃延伸10min。反应程序于
Eppendorf Mastercycler PCR仪(德国Eppendorf公司)
上进行。扩增产物用BioRad PAC3000电泳仪(美国
Bio-Rad公司)6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分
离, 银染显色。
1.4数据分析
用Cervus 3.0软件计算3个群体每个微卫星位
点的等位基因数(K)、基因型数(G)、多态座位的
观测杂合度(Ho)、预期杂合度(He) 和多态信息
含量 (Polymorphism information content, PIC), 用
Arlequin进行AMOVA分析, 用POPGENE软件计
算群体遗传分化指数(Fst), 用TFPGA软件计算群体
内个体间以及群体间的相似系数和Nei氏遗传距离,
并根据群体间遗传距离按照UPGMA法构建3个群
体的聚类关系图。有关计算公式如下:
多态信息含量
1
222 12
m m m
i i i i j i i
PIC Pi Pi Pj
?
===+
=??
∑∑∑
式中: Pi、Pj分别为第i、j个等位基因频率, m为等位基因数;
Ho =杂合子观察数/ 观察个体总数;
He = 1?ΣPi2 , Pi为该位点上第i个等位基因的频率。基因(实际)纯合度按下式计算:
纯合度=1?Ho
近交系数Ft=(Ho?Ht)/Ho
式中: Ft表示第t世代的近交系数, Ho表示基础群体(以普通养殖群体代替)的实测平均杂合度, Ht表示t 世代的实测平均杂合度。
2结果
2.1基因纯合度和个体间的相似度
本研究共对16个多态性微卫星位点进行检测, 其中LYC0031在3个群体所有个体的基因型全部为杂合, 没有发现纯合子, 该位点可能与隐性致死基因紧密连锁, 因此没有加入到统计结果中进行比较。其余15个微卫星位点在3个群体中检出的等位基因数、平均基因型数、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)以及多态信息含量和纯合度情况(表2)。从表2可见, 雌核发育一代群体的各项遗传多样性指标观测值均显著低于普通养殖群体, 而雌核发育二代群体又显著低于雌核发育一代群体; 雌核发育一代平均基因纯合度达0.661, 显著高于普通养殖群体(0.376), 而雌核发育二代达0.803, 又明显高于雌核发育一代。普通养殖群体和雌核发育一代群体在本研究观测的所有位点均存在着多态现象和杂合子, 未出现群体中所有个体全部纯合的位点; 而雌核发育二代群体则有7个座位(LYC0002、LYC0004、LYC0008、LYC0011、LYC0015、LYC0022、LYC0033) 所有个体均为纯合子, 其中LYC0008、LYC0011、LYC0015、LYC00334个座位表现为单态, 各只有1个等位基因。
从个体纯合位点比例看,普通养殖群体为0.067—0.60, 15个观测位点中有2—9个位点纯合, 平均5.6个; 雌核发育一代群体为0.40—0.87, 纯合位点数6—13个、平均9.9个; 雌核发育二代群体为0.60—0.93, 纯合位点数9—14个、平均达12.0个。图1显示了3个群体全部个体纯合位点比例, 从中也可看出各群体中具有不同纯合度个体的数量分布
表2大黄鱼普通养殖群体、雌核发育一代和雌核发育
二代群体的基因多样性与纯合度
Tab. 2 Genetic diversity and homozygosity of Control,
meio-G1 and meio-G2
遗传参数
Genetic parameters
对照组
Control
雌核一代
Meio-G1
雌核二代
Meio-G2平均等位基因数(A)
Mean number of alleles
5.3 3.9 2.1
平均基因型数(G)
Mean number of genotypes
10.1 4.5 2.9
平均观测杂合度(H O)
Mean observed heterozygosity
0.624 0.339 0.197
平均期望杂合度(He)
Mean expected heterozygosity
0.672 0.542 0.219
平均PIC值
Mean PIC
0.616 0.455 0.176
纯合度
Homozygosity
0.376 0.661 0.803
图1 大黄鱼普通养殖群体(对照群体)和雌核发育1代及2代群
体各个个体微卫星位点的纯合率
Fig. 1 Homozygosity of the individuals in control, meio-G1 and meio-G2 of large yellow croaker
1期 叶小军等: 大黄鱼连续两代雌核发育群体的微卫星标记分析 147
情况。该图直观地揭示了雌核发育促进个体和群体纯合度增加的效果情况。
根据所检测15个微卫星位点的基因型, 利用TFPGA 计算群体内个体间的遗传相似度(相似系数)与Nei 氏遗传距离(表3)。由表3可见, 雌核发育群体内个体间的遗传差异也明显减小, 尤其是雌核发育二代群体, 个体间平均遗传距离远远小于普通养殖群体和雌核发育一代群体, 48个个体中有2个个体在所检测15个基因位点上基因型完全一致, 相似系数达1。显示该群体已经是一个遗传一致性较高的高纯品系。
表3 群体内个体间的相似性系数和遗传距离
Tab. 3 Genetic similarity and genetic distance within population 群体 Populations
对照组 Control 雌核一代 Meio-G 1 雌核二代Meio-G 2
平均Mean
0.4687 0.5903 0.8672 最大Max 0.7955 0.9286
1
相似系数
Genetic
identity 最小Min 0.2054 0.2357 0.6191 平均Mean 0.7808 0.5449 0.1462 最大Max 1.5828 1.4452 0.4795 遗传距离Genetic distance
最小Min
0.2288 0.0741
2.2 不同位点的纯合度
表4列出了本研究所检测15个位点在3个群体中检出的等位基因数、观测杂合度和纯合度, 以及以普通养殖群体作为基础群根据杂合度的降低计算的雌核发育一代和二代群体的近交系数(固定指数)。表中的近交系数值反映了在雌核发育群体中各位点基因纯合速率。从表4可见, 绝大多数观测位点在雌核发育群体中杂合度都下降、纯合度上升, 基因型表现为纯合化的趋势; 但不同微卫星位点其纯合的速率不一样, 有的位点在雌核发育1代中就有很高的纯合率和近交系数, 在雌核发育二代中完全纯合固定, 近交系数达1; 但也有的位点纯合较慢, 近交系数较低。LYC 0009和LYC 0013两个位点在雌核发育一代和雌核发育二代群体中的纯合度甚至反而低于普通养殖群体, 致使算出的近交系数小于0。图2是部分个体在LYC 0022位点的电泳图谱。 2.3 群体间的遗传分化
AMOVA 分析结果表明, 群体间的遗传变异占总遗传变异的19.37%, 群体内的遗传变异占总遗传变异的80.63%(表5), 表6和表7分别列出3个群体
表4 15个微卫星座位上的等位基因数、观察杂合度、纯合度和近交系数
Tab. 4 Number of alleles (K ), observed heterozygosity (H O ), homozygosity and breeding coefficient in gynogens and common
stock of large yellow croaker for the 15 detected microsatellite loci 等位基因数
K
观测杂合度
Ho
纯合度 H 近交系数
F
位点 Loci 对照组Control 雌核一代Meio-G 1 雌核二代Meio-G 2
对照组Control
雌核一代Meio-G 1雌核二代Meio-G 2
对照组Control
雌核一代Meio-G 1
雌核二代Meio-G 2 雌核一代Meio-G 1雌核二代Meio-G 2
LYC 0002 7 4 2 0.792 0.25 0 0.208 0.75 1 0.68 1.00 LYC 0004 5 4 3 0.396 0.159 0 0.604 0.841 1 0.60 1.00 LYC 0008 4 3 1 0.479 0.068 0 0.521 0.932 1
0.86 1.00
LYC 0009 7 5 2 0.667 0.682 0.78 0.333 0.318 0.22 ?0.02
?0.17
LYC 0010 3 3 2 0.313 0.136 0.073 0.687 0.864 0.927 0.57 0.77 LYC 0011 5 4 1 0.646 0.455 0 0.354 0.545 1
0.30 1.00
LYC 0012 8 6 3 0.688 0.545 0.683 0.312 0.455 0.317 0.21 0.01 LYC 0013 10 5 2 0.854 0.886 0.878 0.146 0.114 0.122 ?0.04 ?0.03
LYC 0015 4 2 1 0.567 0.182 0 0.433 0.818 1 0.68 1.00 LYC 0022 6 5 2 0.604 0.386 0 0.396 0.614 1
0.36 1.00
LYC 0024 5 4 3 0.525 0.273 0.024 0.475 0.727 0.976 0.48 0.95 LYC 0027 6 5 3 0.721 0.522 0.341 0.279 0.478 0.659 0.28 0.53 LYC 0032 2 2 2 0.354 0.045 0.024 0.646 0.955 0.976 0.87 0.93 LYC 0033 2 2 1 0.792 0.182 0 0.208 0.818 1
0.77 1.00
LYC 0036
5 4 3 0.958 0.318 0.14
6 0.042 0.682 0.854 0.6
7 0.85
Mean 5.27 3.87 2.07 0.624 0.339 0.197 0.376 0.661 0.803 0.46 0.68
148 水生生物学报 34卷
图2 Control 、meio-G 1及meio-G 2部分个体在LYC 0022位点的电泳图谱
Fig. 2 Electrophoresis pattern of partial individuals in Control, meio-G 1 and meio-G 2 for LYC 0022
MW. AFLP ladder; 1—24. Control; 25—48. meio-G 1; 49—72. meio-G 2
相互间的遗传分化指数、相似系数和遗传距离, 图3是根据遗传距离绘制的3个群体的亲缘关系图。雌核发育二代群体与普通养殖群体已产生较明显的遗传分化, 与雌核发育一代群体间的分化指数和平均
表5 三个大黄鱼群体的AMOVA 分析结果
Tab. 5 AMOVA analysis results for three populations of large
yellow croaker 变异来源 Source of variation 自由度
d.f.
平方和 Sum of squares 变异组分 Variance components 变异贡献率
Percentage of
variation 群体间
Among
populations 2 180.135 0.89921 19.37 群体内
Within
populations 285 1066.781 3.74309 80.63 合计
Total 287 1246.917 4.64231
表6 普通养殖群体与雌核发育群体间的遗传分化指数(Fst ) Tab. 6 Genetic diversity coefficient Fst between populations Populations Control Meio-G 1 Meio-G 2 Control Meio-G 1 0.0555
Meio-G 2 0.1566 0.1365
表7 普通养殖群体与雌核发育群体间的相似性系数
(对角线上)和遗传距离(对角线下)
Tab. 7 Genetic similarity (above diagonal) and genetic distance
(below diagonal) between populations Populations Control Meio-G 1 Meio-G 2 Control 0.8467 0.7558
Meio-G 1 0.1664
0.829 Meio-G 2 0.2799 0.1875
图3 Control 、meio-G 1及meio-G 2 三群体的亲缘关系图
Fig. 3 Dendrogram for three populations
遗传距离, 也大于雌核发育一代群体与普通养殖群体间的平均遗传距离, 因此在聚类图上meio-G 1与Control 聚为一支, 而meio-G 2则自成距离较远的1个独立分支。
3 讨 论
3.1 基因纯合速度显著加快
大黄鱼是我国最重要的海水养殖经济鱼类之一, 借助雌核发育技术快速培育出优良性状能稳定遗传的品系具有重要的意义。研究者已经对其雌核发育诱导技术进行了研究, 利用培育的雌核发育家系鱼苗进行分子标记鉴定、分析了部分微卫星位点与着丝粒间的遗传距离, 并培育出有丝分裂雌核发育仔鱼, 证明纯合率可达到100%[9?14]。
但是, 由于大黄鱼鱼苗在数量少、密度过低时培育难度很大, 来自单一亲本的卵子诱导能获得的正常雌核发育鱼苗通常不多, 因此迄今还没有能够培育出雌核发育家系成鱼。本课题组采用将4尾雌鱼的卵子混合诱导雌核发育, 成功培育出异质雌核发育1代和2代群体成鱼, 并应用于良种选育和性别控制等育种实践。从本研究的结果来看, 从该两个群体各采集50尾已成熟产卵个体, 经微卫星标记鉴定均未发现诱导雌核发育时所用雄鱼特有的等位基因(结果未示出), 均为真正雌核发育个体, 表明其雌核发育的诱导是成
功的; meio-G 1
群体在所检测15个微卫星标记位点
上的平均纯合度达0.661(该数值比李益云等用2个异质雌核发育家系鱼苗检测所获得的结果0.414略高, 这可能与所检测位点不完全相同有关), 显著高于普通养殖群体(0.376), 群体内个体间的遗传差异减小, 遗传相似度提高(表3), 形态学性状包括背鳍条数、脊椎骨数等的变异(标准差)也缩小[17]; meio-G 2群体平均纯合度达0.803, 15个微卫星位点中有7个位点在检测的48个个体中完全纯合固定, 其中有4个位点(LYC 0008、LYC 0011、LYC 0015、LYC 0033)表现为单态、只有一种基因和基因型, 群体内个体间的遗
1期叶小军等: 大黄鱼连续两代雌核发育群体的微卫星标记分析 149
传差异进一步缩小, 遗传相似度显著提高(表3), 相似度最高的2个个体在所检测15个微卫星位点上基因型完全一样。这些结果说明, 减数分裂型雌核发育能显著加快大黄鱼基因的纯合速度, 使控制优良性状的基因快速纯合化; 所培育的雌核发育群体, 尤其meio-G2群体已经是一个遗传一致性较高的高纯品系。meio-G2群体与养殖群体的遗传分化指数达0.1566 (表6), 遗传距离达0.2799 (表7), 显著大于其群体内个体间的平均遗传距离(0.1462, 表3)以及meio-G1与养殖群体的遗传距离(0.1664, 表7), 显示meio-G2群体与养殖群体已经发生了较明显的遗传分化。这也说明连续的雌核发育是快速建立具有特定遗传特征品系的有效途径, 与刘静霞等在鲤鱼[18]、Zheng, et al.在草鱼[19]以及周裕华等[20]在鲢观察到的结果是一致的。
3.2不同位点纯合速率不同
在对异质雌核发育后代共显性分子标记检测中一般都会发现存在一些杂合位点, 一般认为这是由于卵母细胞减数分裂时同源染色体之间发生交换引起[21-24]。本研究所检测的15个微卫星座位中绝大多数座位在雌核发育后代纯合度显著上升, 但不同位点纯合的速率不同, 有的位点纯合较快, 如位点LYC0008和LYC0032在雌核发育1代群体中的纯合度就分别高达0.932和0.955, 位点LYC0008在雌核发育二代中就完全纯合固定。而有的位点纯合较慢, 如位点LYC0009、LYC0012、LYC0013的纯合度在雌核发育1代群体中分别只有0.318、0.455和0.114, 这与李益云等[14]在大黄鱼微卫星标记着丝粒作图研究中得到的结果相符。我们还发现这3个座位分别位于宁岳等[25]构建的大黄鱼遗传连锁图3个不同连锁群的末端, 距离着丝粒较远, 而且大黄鱼的染色体较小, 48条染色体中有46条端部着丝粒染色体[26]。因此这些基因座位与着丝点之间比较容易发生重组, 仅经过一两代异质雌核发育难以使这些远离着丝点的基因座纯合, 要进一步使这些座位纯合, 必须通过多代减数分裂雌核发育或诱导有丝分裂雌核发育来实现。显然, 通过对异质雌核发育后代进行选择, 挑选纯合度高的个体繁育后代(继续诱导雌核发育或通过与同样具有高纯合度的人工转性个体交配繁育), 将可以大大加速构建纯系进程。表4中出现LYC0013和LYC0009两个位点在meio-G2中的纯合度与meio-G1相近甚至比后者还低, 这可能是由于meio-G2有更多亲体在该两个位点处于杂合状态, meio-G1与meio-G2在该两个位点的纯合度值都低于普通养殖群体, 导致近交系数出现负值, 这应该是由于巧合, 本研究检测的普通养殖群体中有较多个体恰巧从双亲获得了具有相同迁移率的等位基因。实际上, 在雌核发育体中观察到的纯合是真正的纯合, 两个等位基因来源于母体同一个基因的复制, 而两性杂交后代观察到的微卫星标记纯合体来自双亲的两个等位基因尽管其长度(迁移率)相同, DNA序列则可能并不一致, 因此对其计算的纯合度值只是一种表观纯合度值, 以此为基础计算的近交系数, 也只有部分参考价值。
3.3个体间基因纯合度差别大
值得指出的是, 如图1所示, 本研究观察到在大黄鱼meio-G1和meio-G2群体中不同个体其基因纯合度差别很大, meio-G1群体中纯合度最高的个体有13个位点纯合, 占全部位点数86.7%, 超过meio-G2群体的平均纯合度(0.80), 最少的只有6个纯合位点(占40%); meio-G2个体纯合度变化于0.60—0.93, 纯合位点数9—14个, 变化幅度也很大。由此可见, 通过对异质雌核发育后代进行筛选, 尤其是通过分子标记辅助从异质雌核发育及其人工转性群体中挑选基因型相同、纯合度高的个体进行交配, 即采用吴清江等[27]和Streisinger, et al.[28]设计的技术方案加上分子标记辅助选择, 就可以在较少的世代数中建立高纯品系。刘静霞等[18]通过对锦鲤异质雌核发育二代进行挑选获得了红白锦鲤纯系, 可以作为一个例证。
综上所述, 本研究用本实验室分离的微卫星标记对大黄鱼人工异质雌核发育一代和二代群体的遗传结构和纯合度进行分析, 发现两个群体、尤其是meio-G2群体已具有很高的纯合度, 并与养殖群体发生了较明显的遗传分化; 在雌核发育群体中, 不同的个体和不同的基因位点纯合度差异甚大。本研究建立的大黄鱼雌核发育群体为大黄鱼良种选育和遗传研究提供了很有价值的材料, 所鉴定的微卫星标记为大黄鱼分子育种提供了有用的工具。
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SUCCESSIVE GENERATION MEIO-GYNOGENETIC POPULATION IN
PSEUDOSCIAENA CROCEA USING MICROSATELLITE MARKERS
YE Xiao-Jun1,2, WANG Zhi-Yong1, LIU Xian-De1, CAI Ming-Yi1 and YAO Cui Luan1
(1. The Key Laboratory of Science and Technology for Aquaculture and Food Safety of Fujian Province, Fisheries College,
Jimei University, Xiamen 361021 China; 2. Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian Province, Fuzhou 350002 China)
Abstract: Artificial induction of gynogenesis is one kind of chromosome manipulation with several applications, in-cluding rapid establishment of inbred lines or strains with high degree of homozygosity, sex-control, and accelerated elimination of recessive deleterious genes from aquaculture population. In our laboratory, meiotic gynogenetic popula-tions meio-G1 (the first generation) and meio-G2 (the second generation) were successfully produced in large yellow croaker (Pseudosciaena crocea Richardson 1846). To assess the efficiency to pure gene for artificial meiotic gynogene-sis in large yellow croaker, the homozygosity of the meio-gynogenetic populations for meio-G1 and meio-G2 was studied with microsatellite markers. The results showed that the average homozygosity among the fifteen analyzed loci were 0.661 and 0.803 in meio-G1 and meio-G2, respectively, which were much higher than that in the natural mating popula-tion (0.376 for the average homozygosity). The average similarity coefficient between individuals within meio-G1 and meio-G2 were 0.5903 and 0.8672, respectively, which were also higher than that in the natural mating population (0.4687 for the average similarity index between individuals). Value of diversity coefficient (Fst), genetic similarity and genetic distance showed significant genetic differentiation between the populations of meio-G2 and the natural mating population. Besides, seven out of analyzed loci (46.7%) were fixed in meio-G2, showing that the homozygosity of most genes can be accelerated by inducing meiotic gynogenesis in large yellow croaker. However, purity is hard to achieve in some loci for their telomerical location. For these loci, homozygosity can be gained by inducing mito-gynogenesis or control cross between individuals having same genotype. The information obtained in the study suggested that artifi-cially induced meiotic gynogenesis is an efficient inbreeding method to pure the genome and increase the speed to es-tablish pure-lines of large yellow croaker. The meio-gynogenetic populations cultivated in the study are useful for fur-ther selective breeding program.
Key words: Large yellow croaker (Pseudosciaena crocea); Microsatellite; Gynogenesis; Homozygosity