生物技术毕业论文
女贞果实内生菌的分离及抑菌活性测定
（贵州师范大学生命科学学院贵州 550001）
摘要：利用平板分离法从女贞果实中分离出内生菌共18株。采用滤纸片法，筛选出对金黄色葡萄球具有抑菌作用的菌株有2株、对大肠杆菌具有抑菌作用的菌株有1株、对枯草芽孢杆菌具有抑菌作用的菌株有6株和对沙门氏菌据有抑菌活性的菌株3株。其中，NZGS-18、NZGS-05对枯草芽孢杆菌和沙门氏菌两株菌同时具有抑菌作用。在分离出的内生菌中，无任何一株菌株对白色念球菌具有抑菌作用。
关键词：内生菌; 女贞子; 抑菌活性
Endophyte isolation of Ligustrum lucidum and antibacteria activity analysis
Wei Yun
(School of Sciences, Guizhou Normal University, Guizhou 550001)
Abstract: Through plate isolation method, 18 strains of endophytic bacteria were got from the fruit of privet, Using filter paper method, the strains which has antibacterial activity were screened, there are 2 strains for Staphylococcus aureus, 1 strain for Escheria coli, 6 strains for Bacillus subtilis, and 1 strain for Salmonella. Moreover, NZGS-18 and NZGS-05 have antibacterial activity for both Bacillus subtilis and Salmonella. None of the strain has the antibacterial activity for Candida albicans.
Key words: endophytic bacteria; Ligustrum lucidum; antibacterial activity
女贞子为木犀科植物女贞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果实[1]，主产于湖南、四川、江苏和浙江等地。女贞在中国作为药用植物具有悠久的历史,《本草纲目》记述女贞子气味苦、平、无毒，能补中、安五脏、养精神、除百病。李时珍谓“果实强阴健腰膝，变白发，明目”等功效。女贞子中含有有机酸、木犀草素-7-O-B-D-葡萄糖苷、槲皮苷、胡萝卜苷、羟基苯乙醇-B-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、己六醇等成分[2]。近代研究表明,女贞子具有抗菌、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、保肝、抗衰老、抗癌及提高免疫功能等药理作用[3-4]，
植物内生菌(endophyte)是指存活于健康植物组织内部，而又不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群，主要包括真菌、细菌和放线菌[5-6]。自1993
年,Strobe l等从短叶红豆杉的韧皮部分离到一株产抗癌药物紫杉醇内生菌以来,不断有从植物内生菌中发现抗菌、抗肿瘤等活性物质的报道[7]。植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注,尤其是某些内生菌还可以产生和宿主植物相同或相似的生理活性成分[8]。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。研究显示，目前从植物内生菌中分离出的生物活性物质，约51%属于未报道过的新化合物。内生菌不仅能够参与植物次生成分的合成或对植物次生代谢产物进行转化，而且还能够独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物的重要来源[9-10]。当前,由于生态环境的破坏、植物资源的过度采伐,能被用来寻找生理活性物质的植物资源越来越少,而从普通生境中寻找产抗生素类活性物质的菌株也越来越困难,由于植物内生真菌代谢产物丰富,作为一种寻找开发药物的重要资源已受到人们的日益关注[11]。本实验对女真果实内生菌进行分离,并对具有抑菌活性的菌株进行了初步筛选,从而为植物内生菌资源的利用提供一定的依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1样品
采自贵州师范大学校园内做绿化观赏的女真植株新鲜的果实，于4 °C保存待用。
1.1.2 病原指示菌：
革兰氏阳性细菌(G+)：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。革兰氏阳性细菌(G-)：大肠杆菌(E. coli)、沙门氏菌（Salmonella）。真菌：白色念球菌（Candida albicans），本室保藏。
1.1.3 抗生素
注射青霉素钠、硫酸链霉素钠。
1.1.4 培养基
真菌培养采用PDA琼脂培养基；细菌培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌培养基采用高氏一号培养基。
1.2 样品的消毒处理：
取新鲜女贞果实用水冲洗干净，无菌水冲洗2遍，先用体积分数75％酒精浸泡2 min，无菌水冲洗2-3遍，再用0.1%升汞浸泡不同时间（40 sec、1.5 min 或3 min），无菌水冲洗3-4次，晾干；取最后一次清洗水涂布于3种平板上，28 °C 培养3-5 d，检测表面消毒是否彻底。
1.3 植物内生菌的分离纯化及保存
在无菌条件下，用灭过菌的手术剪刀将消毒后的女贞子剪碎，置于研钵内，加入少量的无菌水和石英砂进行研磨，制备样品悬液。分别划线于3种平板上，于37 °C培养2-3 d（细菌）或28 °C培养5-6 d（真菌和放线菌）。待平板上菌落出现后，挑取不同形态的菌落于相应平板上，划线分离纯化。所得菌株接种到斜面培养基上4 °C冷藏保存备用。
1.4菌种的活化
1.4.1 内生菌的活化
细菌：用接种环挑每个菌种1环于装有5 ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，37 °C、160 r/min 摇床培养16 h。
霉菌/酵母：用接种环挑每个菌种1环于装有5ml PDA液体培养基的试管中，28℃、160r/min 摇床培养2 d。
放线菌：用接种环挑每个菌种1环于装有5 ml 高氏1号液体培养基的试管中，28 °C、160 r/min 摇床培养2 d。
1.4.2 病原指示菌的活化
细菌按1:10的体积取活化的细菌培养液于装有100 ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，37 °C、160 r/min 摇床培养16 h。
真菌按1:10的体积取活化的真菌培养液于装有100 mlPDA液体培养基的三角瓶中，28 °C、160 r/min摇床培养6-7 d。
1.5内生菌的培养及代谢物样品的制备
实验细菌按1:10的体积取活化的细菌培养液于装有10 ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，37 °C、160 r/min 摇床培养2 d。培养液经3500 r/min离心5 min后，上清液用于抑菌活性测定。
实验真菌按1:10的体积取活化的真菌培养液于装有10 mlPDA液体培养基的试管中，28 °C、160 r/min 摇床培养6-7 d。培养液经3500 r/min离心5 min后，上清液用于抑菌活性测定。
实验放线菌1:10的体积取活化的放线菌培养液于装有10 ml高氏1号液体培养基的试管中，28 °C、160 r/min 摇床培养6-7 d。培养液经3500 r/min离心5 min 后，上清液用于抑菌活性测定。
1.6 含菌平板的制备：
固体培养基经灭菌，冷却至50 °C左右，按1:20体积比，加入活化后的指示菌，充分摇匀，倒平板（15 ml）。每个平板标记4个区域
1.7 菌活性的测定：
0.9 cm无菌滤纸片在样品液中浸泡2 h，接到含菌平板上，静置10 min后，将含细菌平板置37 °C培养1 d，含真菌指菌平板置28 °C培养2 d。观察各平板
上病原指示菌的生长情况及抑菌圈大小；每个受试样品分别接种3个平板，以3平板所测得的抑菌圈直径平均值为该受试菌抑菌圈的值
分别用青霉素和链霉素以及无菌水代替样品液，浸泡滤纸片2 h接到含菌平板上，每个对照组分别接种3个平板；作为阳性对照和阴性对照，以3平板所测得的抑菌圈直径平均值为该对照组抑菌圈的值。
2 结果与分析：
2.1 升汞不同处理时间对植物表面消毒效果的影响：
女贞果实经升汞处理，用无菌水冲洗3-4次，取最后一次清洗水涂布于3种平板上，28 °C培养3-5 d，检测消毒结果（见表1）：
表1 升汞消毒检测结果
材料表面消毒时间菌落
女贞果实40 sec 有1.5 min 无3 min 无
表面灭菌是关键步骤，过轻过重都会影响植物内生细菌调查的准确性。既要
保证分离组织表面灭菌彻底，又要根据不同材料对消毒剂的敏感性不同，尽可能
减少消毒剂的影响，不伤害材料内部的细菌，最大限度地分离组织内的细菌
。从表1中可以看出，用升汞表面消毒40 sec时有菌落长出，用1.5 min和
3 min表面消毒时无菌落长出，考虑到消毒时间过长，有可能造成女贞果实内生
菌丢失的情况下，实验选择了在用升汞消毒时，消毒时间为1.5 min。
2.1 女贞子内生菌的分离
女贞子果实经表面灭菌、研磨后，划线分离、纯化，共得到18株内生菌。
各菌株的菌落形态见表2。
表2 女真果实内生菌的菌落观察
菌株菌落大小
（mm）
菌落颜色菌落形态菌丝
NZGS-01 5 乳白色圆形、湿润、边缘整齐无菌丝NZGS-02 12 正面白色反面白色圆形致密长、白色NZGS-03 0.5 乳白色圆形、湿润、边缘整齐无菌丝NZGS-04 5 正面白色反面灰色绒毛状长、白色NZGS-05 2 白色圆形、湿润、边缘整齐无菌丝NZGS-06 14 正面灰色反面黑色圆形菌丝致密长、白色NZGS-07 2 浅黄色圆形、湿润、边缘整齐无菌丝NZGS-08 1 粉红色圆形、湿润、边缘整齐无菌丝
NZGS-09 2 白色圆形、湿润、边缘整齐无菌丝NZGS-10 2 白色圆形、湿润、边缘整齐无菌丝NZGS-11 1 乳白色圆形、湿润、边缘整齐无菌丝NZGS-12 1 白色圆形、湿润、边缘整齐无菌丝NZGS-13 1 乳白色圆形、光滑、边缘整齐无菌丝NZGS-14 2 黄色圆形、光滑、边缘不整齐无菌丝NZGS-15 1 白色圆形、光滑、透明无菌丝NZGS-16 0.5 乳白色圆形、光滑、边缘锯齿状无菌丝NZGS-17 2.5 灰色圆形、干燥短、灰色NZGS-18 2 白色圆形表面凸起且干燥短、白色从表2可以看出，从女贞果实中共分离出内生菌共18株，PDA平板中分离
的12株菌株，占总分离菌株的66.67%；；从牛肉膏蛋白胨培养基中共分离出4
株菌株，占总分离菌株的22.22 %；从高氏I号培养基中共分离出2株菌株，占
总分离菌株的11.11%。
2.2 实验样品在各病原菌指示菌平板上的抑菌圈大小
挑取分离所得的内生菌进行放大培养、离心，取上清液、用滤纸片浸泡2 h
接种于含菌平板上，所得抑菌圈的大小见表3。
表3实验样品在各病原菌指示菌平板上的抑菌圈大小菌株病原菌及抑菌圈的大小（mm）
大肠杆菌枯草芽孢杆菌沙门氏菌白色念球菌金黄色葡萄
球菌
青霉素21 27 21 22 无
链霉素21 28 20 22 无
无菌水无无无无无NZGS-01 无无15 无无NZGS-02 无无无无无NZGS-03 无无21 无无NZGS-04 无无14 无无NZGS-05 无无14 15 无NZGS-06 无无无13 无NZGS-07 无无22 无无NZGS-08 13 无无无无NZGS-09 无无无12 无NZGS-10 无无无无无
NZGS-11 无无无无无NZGS-12 无无无无无NZGS-13 无无无无无NZGS-14 无无无无无NZGS-15 无无无14 无NZGS-16 无无13 无无NZGS-17 无无无无无NZGS-18 13 12 无无无从表3可以看出，青霉素和链霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌都有抑菌作用，对白色念球菌无抑菌作用，而无菌水对五种病原菌都无抑菌作用。从分离的内生菌中，共筛选出对供试菌种中的一种或多种有拮抗效果的菌株共11株，占总分离内生菌的61.11﹪，在11株菌株中对金黄色葡萄球具有抑菌作用的菌株有2株、对大肠杆菌具有抑菌作用的菌株有1株、对枯草芽孢杆菌具有抑菌作用的菌株有6株和对沙门氏菌据有抑菌活性的菌株3株。其中，内生菌NZGS-18、NZGS-05对枯草芽孢杆菌和沙门氏菌同时具有抑菌效果。在分离出的内生菌中，无任何一株菌株对白色念球菌具有抑菌作用。
3 讨论
内生细菌的分离过程中，植物表面灭菌是关键步骤，灭菌时间过长过短都会影响到后步实验，时间过短，灭菌不彻底，容易引入杂菌，时间过长，容易将植物内生菌杀死，造成内生菌的丢失。要保证实验接近准确，就要把握好灭菌时间的范围，尽量减小灭菌时对植物内生菌的影响，最大限度地分离组织和器官中的内生菌。
植物内生真菌是一类相对来说开发较少、次生代谢产物丰富、应用前景广阔的微生物资源[14]。本研究结果表明女贞果实内生菌具有多样性和丰富性。同时，其代谢产物具有一定的抗菌活性；从女贞果实中分离出内生菌18株，有11株具有抑菌活性，能够抑制G+的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢菌的菌株相对较多，占了抑菌菌株的72.73%；对G-的大肠杆菌和沙门氏菌有抑制作用的菌株则较少，占了抑菌菌株,27.27%，其中无任何菌株对白色念球菌有抑菌作用；从女贞果实中分离出的两株NZGS-18、NZGS-05，分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌、沙门氏菌都有抑菌作用。从表3可以看出，它们对G+和G-都有一定的抑菌活性，在分离出的内生菌株中具有重要的代表意义。本研究的实验结果在一定程度上提示了药用植物内生真菌中普遍存在抑菌活性菌株，为进一步的发现生物防治材料提供了一定的基础。
植物内生菌可以产生植物本身所具有的或者更为新颖的生物活性物质[15]。
近年来，作为一种新的资源,植物内生菌特别是药用植物内生菌引起了人们的广
泛关注,并从中分离出了多种具有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫抑制和抗氧化等作
用的生物活性物质,其中不少是具有特殊生物活性的新发现的物质。女贞子含有
多种化学成分，最先发现的是女贞子含有较高含量的齐墩果酸，后又发现了乙酰齐墩果酸、熊果酸等，其中的化学成分具有广泛的药理作用，包括抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、保肝、抑制血栓形成、抗衰老及抗疲劳作用，能调节免疫，提高肿瘤患者的免疫功能等[16]。因此从女贞子中分离出内生菌的抗菌菌株，结合
女贞子的药用价值，筛选出相应的具有药用功效的菌株，对于开发利用药用植物具有非常重要的意义。
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致谢
本论文是在翁庆北老师的细心指导下完成的。从论文题目的确定到实验方案的设计整过程中翁庆北老师都给予了精心的指导，在论文的撰写过程中翁庆北老师给予了大力帮助，并提出了宝贵意见，翁老师严谨的治学态度和实事求是的科学精神使我受益终身。在此，特感谢翁庆北老师对我实验上的指导以及生活上的关心。