293T细胞的培养

细胞生物学杂志 Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２００９，　３１（１）：　１３０ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｊｃｂ．ｏｒｇ

２９３Ｔ细胞的培养

细胞培养是目前极为普遍使用的研究手段。目前国内很多实验室在细胞培养过程中会遇到各种问题，在很大程度上影响了研究工作的进展。通过分析来电咨询中所提出的各种情况，我们认为有不少问题具有普遍性。为此在这里开辟一个技术咨询的专栏，把我们的经验和技术手段与大家一起共享，共同探讨如何更好地解决细胞培养中的种种问题。同时，欢迎广大读者把自己在工作中收获的点滴心得体会在这里与大家交流，以期共同提高。

本期向大家介绍如何养好２９３Ｔ细胞。今后将陆续介绍各种常用细胞的培养要点。　欢迎读者提出有关细胞培养的各种问题，我们将组织有关的专家撰文作相关的解答。

－－－－－－－－－－编者

２９３Ｔ细胞是由２９３细胞派生，　表达ＳＶ４０大Ｔ抗原的人肾上皮细胞系， 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白，　或是用以包装病毒。

２９３Ｔ为贴壁细胞，　这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。培养条件为：　完全培养基：　高糖ＤＭＥＭ，　１０％胎牛血清；　冻存液：　胎牛血清或完全培养基，　１０％　ＤＭＳＯ。

传代方法为：

１．吸掉２９３Ｔ细胞培养瓶内的培养液；

２．吸取适量的无Ｃａ２＋和Ｍｇ２＋的ＰＢＳ，　轻轻把贴壁的细胞洗两遍；

３．加少量的０．０５％胰蛋白酶－ＥＤＴＡ　（一般２５ｃｍ２的培养瓶加１　ｍｌ，　７５　ｃｍ２的培养瓶加２￣３　ｍｌ），　放到培养箱温育２０　ｓ；

４．细胞消化完毕，　加适量培养液终止消化，　并吹打细胞，　制成均匀的细胞悬液；

５．加足量的培养液，　分装到新的培养瓶中。值得注意的是，　２９３Ｔ细胞的贴壁性不强，　轻微的干扰就可能使它们脱落。所以，　在更换新鲜培养液或者用ＰＢＳ冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去，　以液体不冲打到贴壁的细胞为好。传代的时候，　只需要用０．０５％胰蛋白酶－ＥＤＴＡ即可轻松把细胞消化下来，　不需要消化很长时间。有些同学反映２９３Ｔ细胞容易结团不易被吹打开来。如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿１　ｍｌ移液枪反复轻轻吹打，　直至肉眼看不到大的细胞块为止，　然后加适量的培养液混匀，　这时候在显微镜下观察，　可见大多数细胞都是单个的，　只有少量的２￣３个细胞聚在一起。一般２９３Ｔ细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到９０％融合，　再以１∶４￣１∶８的比率传代。合适的传代周期为２￣３天。传代过程中，消化的时间越短越好，　显微镜下观察到８０％细胞脱

落即可加培养液中止。完成传代后放入培养箱前，应该把培养瓶或培养皿沿Ｘ、Ｙ轴方向水平移动几下，　防止细胞都聚在中间或者四周。冷冻２９３Ｔ细胞的冻存液可以用９５％小牛血清加５％二甲基亚砜，　复苏率很高。

２９３Ｔ细胞的生长状态直接关系到包装病毒和转染的效率，　应尽量选择传代次数少，　培养总时间短的细胞。从细胞形态上看，　相差显微镜下观察立体感强并且形态良好的细胞产病毒率或者转染效率都很高。

虽然２９３Ｔ细胞的应用非常广泛，　几乎每个实验室都有一株自己的２９３Ｔ细胞株，　但是经常有同学提出：　为什么在正常的培养条件下，　细胞却很难传代下去，　包装病毒效率很低，　对转染效率也不满意呢？

事实上，　引起类似问题的元凶是一种生物界最小的原核细胞生物－支原体。支原体污染后，　它们不会使细胞死亡而是与细胞长期共存，　培养基不发生浑浊，　细胞无明显变化，　外观上给人以正常感觉，　但事实上细胞正在受到到多方面影响，　如引起细胞变形，　影响ＤＮＡ合成，　抑制细胞生长等。我们曾经收集到四株分别来自四个不同实验室的２９３Ｔ细胞，　经检测均为支原体阳性，　令人惊讶的是这四株细胞都已经不是典型的２９３Ｔ细胞形态，　每两株之间比较竟然形状各不相同，　很难相信这是同一种细胞！这些支原体阳性细胞普遍传代周期长，　显微镜下观察细胞碎片多，　长期支原体感染已经使这些细胞羸弱不堪，　胞内ＤＮＡ和蛋白质合成受到严重的影响。

因此，　有效地防治支原体污染，　杜绝交叉感染对提高实验效率，　稳定实验结果至关重要。我们的经验是把防治支原体污染作为细胞培养的一项日常工作，　除了对细胞培养设备环境的清洁外，　还需在器材消毒，　操作员培训，　严格把关新引入细胞株的质量等方面做大量细致的工作。（徐兰　刘敏英）

专题介绍

FuGENE 转染流程

FuGENE HD真核细胞转染流程 FuGENE HD Transfection Reagent Quick Protocol.pdf FuGENE HD Transfection Reagent.pdf 1.细胞和质粒的准备 ①将约5-10×105A549细胞接种于6孔细胞板中，用含10%小牛血清的F-12k 培养过夜，约60%~80%铺满时用于转染。 注：一般荧光试验细胞稀一点为宜；WB试验细胞密一点为宜 ②转染时所用质粒均用转染专用质粒抽提试剂盒无菌提取，抽提后测定其浓度 和纯度，浓度在0.1μg/μL以上且纯度在1.8±0.5 (OD260/OD280)的质粒用于转染，质粒提取的具体步骤按说明书提供的方法进行。（注：质粒浓度测定未必可行，需同时进行酶切和PCR鉴定方可。） ③按照转染剂量，计算质粒使用浓度 2.转染流程 注：由于不同转染试剂对质粒大小、性质、转染量、细胞的种类有很强的特异性，必须谨慎选择转染试剂。以多次转染成功使用的转染试剂为佳。 ①将培养板中的上清弃去，用细胞用无抗无血清F12K洗涤三次后，每孔加入 800ul 无抗无血清F12K。 ②取出FuGENE HD转染试剂，使其温度上升到室温。 ③计算好质粒、转染试剂、以及无抗无血清F12K的量，最终液体总量为100 ul。 准备好无菌指形管，按计算结果加入90-98ul的无抗无血清F12K，加入2ug 质粒，振荡器混匀；随后加入6ul FuGENE HD转染试剂，立即震荡混匀（转染试剂加入时不能沾到管壁上！） ④室温静置7-12分钟后，将质粒：转染试剂混合液均匀滴加在细胞平板孔中， 吹打混匀或者震荡混匀。放入37℃培养箱孵育。

常见的说明方法及作用

常见地说明方法有举事例、分类别、列数据、作比较、画图表、下定义、作诠释、打比方、摹状貌、引资料（即引用）等种.写说明文要根据说明对象地特点及写作目地，选用最佳方法. 一、举例子 举出实际事例来说明事物，使所要说明地事物具体化，以便读者理解，这种说明方法叫举例法. 这种说明方法地作用是使说明地对象具体形象，便于读者理解. 二、分类别 将被说明地对象，按照一定地标准划分成不同地类别，一类一类地加以说明，这种说明方法，叫分类别. 分类别地作用是使说明条理清楚. 三、打比方 利用两种不同事物之间地相似之处作比较，以突出事物地性状特点，增强说明地形象性和生动性地说明方法叫做打比方.资料个人收集整理，勿做商业用途 它地主要作用是使说明对象生动形象，增强文章地趣味性. 四、列数字 (引用地数字，一定要准确无误) 其作用是使说明具体化，准确无误，令读者信服. 五、下定义 用简明地语言对某一概念地本质特征作规定性地说明叫下定义. 定义能准确揭示事物地本质，是科技说明文常用地方法. 六、作比较 （说明某些抽象地或者是人们比较陌生地事物，可以用经熟悉地事物和它比较.同类相比，也可以是异类相比） 使读者通过比较得到具体而鲜明地印象. 七、作诠解

作诠释，用于解释被说明内容地成因及内在联系. 八、画图表 画图表可使说明内容直观形象. 九、摹状貌 摹状貌能使说明生动形象，使文章更具可读性.资料个人收集整理，勿做商业用途 十、引资料 为了使说明地内容更充实具体，可以引用一些文献资料、诗词、俗语、名人名言，可使说明更具说服力.引用资料地范围很广，可以是经典著作，名家名言，公式定律，典故传说，谚语俗语，诗词句等.充当说明地内容或依据来说明、介绍事物. 资料个人收集整理，勿做商业用途 总结以上说明方法地表达作用（找规律、找方法） 作比较——突出被说明对象特征 列数字、举例子——使说明内容具体化 打比方、摹状貌——使说明生动、形象 下定义——准确揭示事物本质特征 作诠释——用通俗地语言进行解释说明 引资料——使说明内容更充实，增加说明地趣味性 分类别——使文章严密细致，条理清晰 说明方法地作用 、举例子：具体、真切、形象，便于读者理解. 答题思路：举什么例子具体、真切、形象地说明了说明对象地什么. 、分类别：条理清楚. 答题思路：对什么进行分类说明，条理清楚地说明了说明对象地什么. 、打比方：生动、形象，增强文章地趣味性. 答题思路：把什么比喻成什么，生动、形象地说明了说明对象地什么. 、列数字：科学、准确、具体.

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

lipo2000转染操作步骤

Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。

常用的说明方法有9种

常用的说明方法有9种 1、举例子：说明事物的情况或事理，如果不容易被人理解，就需要列举一些既通俗易懂又有代表性的例子来加以说明。如《中国石拱桥》中把赵州桥和卢沟桥作为具有代表性的例子，对我国建设石拱桥的悠久历史、杰出成就作了说明。 2、分类别：要说明事物的特征或事理，从一个方面往往不容易说清楚，可以根据形状、性质、功能、成因等方面的异同，把事物或事理按一定的标准分成若干类，然后依照类别，逐一加以说明。如《向沙漠进军》一文中将沙漠向人类进攻的方式分为“游击战”和“阵地战”两类。这种说明方法的作用可归结为：将……(对象)分成哪几类，具体解说了……(对象的特征)，从而达到条理清楚，准确说明的作用。 3、列数字：数字是从数量上说明事物的特征或事理的最精确、最科学、最有说服力的依据。如《死海不死》中用大量的数字说明死海之所以浮力大的原因，非常准确。这种说明方法的作用可归结为：用精确的数字说明了……(对象)，突出了……(对象的特征)，使读者一目了然，起到了准确说明的作用。当然也有一些说明文用了大量的概数、约数，也能体现说明文语言的准确性。 4、作比较：为了把事物或事理说得通俗易懂，有时可以从人们已有的感性知识出发，利用人们生活中熟悉的事物或事理作比较，从而唤起读者的想象，获得深刻的印象。如《人类的语言》一文将鹦鹉、猩猩的“语言”与“人类的语言”作比较，得出“只有人类才有真正的语言”的结论。这种说明方法的作用可归结为：通过比较，形象地说

明了……(对象的特征)，易于读者的理解。 5、下定义：为了突出事物或事理的主要内容或主要问题，常常用简明扼要的语言给事物或事理下定义。这是说明事物的特征或事理、揭示事物的特征或事理的本质的一种方法。如《统筹方法》一文中“统筹方法是一种安排工作进程的数学方法”。这个定义既指明了“统筹方法”的本质——数学方法，又指明了“统筹方法”的应用特点——安排工作进程。这样，就把统筹方法同其他的数学方法区别开来了。这种说明方法的作用可归结为：用科学的语言给……(对象)下定义，揭示了……(对象)的本质特征，从而使读者对… 6、打比方：打比方就是修辞方法中的比喻。在说明文中运用打比方的方法，可以使人们不了解的事物或抽象的事理变得具体、生动、形象。如《中国石拱桥》中“石拱桥的桥洞成弧形，就像虹”，就可以使人们更形象，更清晰地了解了石拱桥的特点。这种说明方法的作用可归结为：把……比作……，生动、形象地突出了……(对象的特征)。 7、列图表：有些事物的关系抽象而复杂，仅用文字说明还不能使读者明白，这就需要附上示意图，或按比例精确图例，如产品结构图等。有时，被说明的事物项目较多，也可利用统计表，将有关数字分别填入表中，使人看了一目了然。如《统筹方法》一文，运用了三幅箭头图，配合文字说明，使统筹方法更加具体可信。 8、作诠释：这是对事物进行解释的一种说明方法。下定义与作诠释的主要区别是：定义要求完整，即定义的对象与所下定义的外延要相等，并且要从一个方面完整地揭示概念的全部内涵；而诠释并不要求

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。 下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量 保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。 注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: （1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1） （2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。 （3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。 表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。 注意：转染前无需更换新鲜培养基，直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要，也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理，如加药等，可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。 注意：加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基，但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大，可根据细胞的状态，在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。

常见的说明方法及其作用总结

常见说明方法及其作用 一、举例子。 举出实际事例来说明事物，使所要说明的事物具体化，以便读者理解。 答题思路：举------例子，具体真实地说明了------的------的特点。 二、分类别。 将被说明的对象，按照一定标准划分成不同的类别，一类一类地加以说明。 答题思路：对------进行分类说明，条理清楚地说明了------的-----的特点-。 三、列数字。 答题思路：列举------具体数字，准确严密地说明了------的------的特点。 四、作比较。 用具体的或熟悉的事物和它比较，使事物特征在比较中得到具体而鲜明的印象。 答题思路：把----和----进行比较，更加突出------的------的特点。 五、画图表。 对复杂的事物可以用图表来弥补文字表达的缺欠，对事物解说更直接、更具体。 答题思路：把------用图表分解，直观形象地说明------的------的特点。 六、打比方。 利用两种不同事物间的相似之处，突出事物性状特点，增强说明的形象和生动性。 答题思路：把------比喻成------，生动形象地说明了-------的------的特点。 七、摹状貌。 为了使被说明对象更形象、具体，可以进行状貌摹写。 答题思路：对------进行状貌摹写，生动形象地说明------的------的特点。 八、引用。 为了使说明的内容更充实具体，可以引用资料说明。 答题思路：引用------，确凿充分地说明了------的------的特点。 九、下定义。 用简明的语言对某一概念的本质特征作规定性的说明。 答题思路：给------下定义，科学准确地揭示了说明------的------内涵和本质。 十、作诠释。 从一个侧面，就事物的某一个特点做些解释，这种方法叫诠释法。 下定义与作诠释的区别是：定义要求完整，即定义的对象与所下定义的外延要相等，并且要从一个方面完整地揭示概念的全部内涵；而诠释并不要求完整，只要揭示概念的一部分内涵就可以了，解释的对象与做出的解释外延可不相等。一般来说，“是”字两边的话能够互换，就是定义；如不能互换，就是诠释。如：“词是能独立运用的最小语言单位”这个定义，主语与宾语的内涵与外延完全一致，可颠倒。而"铀，是银白色的金属"，则是诠释，其内涵与外延都不相等，即不能说"银白色的金属是铀"。 答题思路：对---做诠释，通俗准确地说明----------的--------特点。 通套： 运用①说明方法，把对引给举②，③地说明了④的⑤特点，⑥体现说明文语言的准确性。

细胞转染技术原理及应用

细胞转染技术原理及应用 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿 孔法，脂质体法各有利弊 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂 的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性 低，但转染效率却较高。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

常见说明方法及其作用

常见说明方法及其作用 常见的说明方法有：举例子、分类别、下定义、摹状貌、作诠释、打比方、列数字、列图表、引用说明。 常见说明方法的作用： ①、举例子：通过举具体的实例对事物的特征，事理加以说明，从而使说明更具体，更有说服力。 ②、分类别：对事物的特征，事理分门别类加以说明，使说明更有条理性。 ③、作比较：把XX和XX加以比较，突出强调了事物的特征或事理。 ④、作诠释：对事物的特征，事理加以具体的解释说明，使说明更通俗易懂。 ⑤、打比方：就是运用比喻把事物的特征说清楚。 ⑥、摹状貌：对事物的特征加以形象化的描摹，使说明更具体形象。 ⑦、下定义：用简明科学的语言对说明的对象或科学事理加以揭示，从而更科学、更本质、更概括地揭示事物的特征/事理。 ⑧、列数字：用具体的数据对事物的特征/事理加以说明，使说明更准确更有说服力。 ⑨、列图表：用列图表的方式对事物的特征/事理加以说明，使说明更简明更直观。 ⑩、引用说明：引用说明有以下几种形式——A、引用具体的事例；（作用同举例子）B、引用具体的数据；（作用同列数字）C、引用名言、格言、谚语；作用是使说明更有说服力。D、引用神话传说、新闻报道、谜语、轶事趣闻等。作用是增强说明的趣味性。（引用说明在文章开头，还起到引出说明对象的作用。） 答题模式： 引用：引用突出说明了事物的特征，增强了说服力（趣味性）。（引用说明若在文章开头，还起到引出说明对象的作用。） 摹状貌：生动具体地描绘了，突出了事物的特点。 考查角度：加点词的作用，加点词能否删去？ 题型一：句（段）中加点词的作用能否删掉？为什么？ 答题模板：不能。加点词“XX”的意思是……，说明了……。删掉之后，句子（或语段）的意思就变成了……，显得绝对化（或与事实不符）。加点词“XX”体现了说明文语言的准确性。 题型二：句（段）中加点词语有何作用？（好在哪里？） 答题模板：用“XX”词，准确（形象）地说明了……事物的……的特征，能够激发读者的兴趣。 题型三、找出体现说明文语言准确特点的词句，并体会其作用。 答题模板：句子+作用 （1）句子：①有精确数字的句子②有概数的句子③使用限制性词语的句子

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

常见说明方法及作用

常见说明方法及作用 常见的说明方法有：举例子、分类别、下定义、作比较、打比方、列数字、引用说明。 常见说明方法的作用： 1、举例子：通过举具体的实例对事物的特征/事理加以说明，从而使说明更具体，更有说服力。 2、分类别：对事物的特征/事理分门别类加以说明，使说明更有条理性。 3、作比较：把__________和__________加以比较，突出强调了事物的特征/事理。 4、打比方：将__________比作__________，从而形象生动地说明了事物的特征/事理。 5、下定义：用简明科学的语言对说明的对象/科学事理加以揭示，从而更科学、更本质、更概括地揭示事物的特征/事理。 6、列数字：用具体的数据对事物的特征/事理加以说明，使说明更准确更有说服力。 7、引用说明：引用说明有以下几种形式—— A、引用具体的事例；（作用同举例子） B、引用具体的数据；（作用同列数字） C、引用名言、格言、谚语；作用是使说明更有说服力。 D、引用神话传说、新闻报道、谜语、轶事趣闻等。作用是增强说明的趣味性。 （引用说明在文章开头，还起到引出说明对象的作用。） 语文说明文阅读题答题技巧 说明方法 [类型1]：直接让考生回答文章或段落的说明方法 对策：了解常见的说明方法(举例子、分类别、下定义、作诠释、打比方、列数字、列图表、摹状貌、引用说明)的主要特点，然后根据文段内容分析判断。 [类型2]：文章某段或某句运用何种说明方法，简要说明它的作用? 对策：找出运用的说明方法，再根据下列说明方法的作用具体回答。 1.．．举例子：具体真切地说明了事物的××特点。 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

细胞转染的详细过程

细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状

真核细胞转染操作方法

一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。 一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。 利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途： (1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。 (2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。 (3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。

(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的 情况。 (5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。 (6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列 得到表达。 (7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。 DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。 进行真核转染的一般程序： 克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定 下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。 一、试剂准备 1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 (一)克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。 (二) 真核重组表达载体的构建：

常见的几种说明方法及作用

常见的几种说明方法及作用 列数字：用具体的数据对……加以说明，使说明更准确，更有说服力。 打比方：生动形象说明了……增强了文章的趣味性。 举例子：用具体例子说明……的特点，事实清楚，可使读者对说明对象的特征获得具体认识，印象，更加深刻。 下定义：使的读者对……的概念有确切的了解。 作诠释：对事物……的特征（事理）加以具体的解释说明，使说明更通俗易懂。 作比较：把……和……相互比较，突出强调了……（被说明事物）的特征。 引资料：引用……，突出了……既增强了说服力，也增强了趣味性；使说明的内容更具体、更充实。（有时在说明结构上起作用） 分类别：把……分别加以说明，显得条理清楚，避免了重复交叉的现象。 画图表：使读者对……一目了然，非常直观地理解被说明的事物。 摹状貌：对事物……的特征（事理）加以形象化的描摹，使说明更具体、生动、形象。 说明方法作用的分析必须联系原文 说明文的结构：总分式（由总到分、由分到总、总分总）、并列式、递进式 常见的几种说明方法及作用 列数字：用具体的数据对……加以说明，使说明更准确，更有说服力。 打比方：生动形象说明了……增强了文章的趣味性。 举例子：用具体例子说明……的特点，事实清楚，可使读者对说明对象的特征获得具体认识，印象更加深刻。 下定义：使的读者对……的概念有确切的了解。 作诠释：对事物……的特征（事理）加以具体的解释说明，使说明更通俗易懂。 作比较：把……和……相互比较，突出强调了……（被说明事物）的特征。 引资料：引用……，突出了……既增强了说服力，也增强了趣味性；使说明的内容更具体、更充实。（有时在说明结构上起作用） 分类别：把……分别加以说明，显得条理清楚，避免了重复交叉的现象。 画图表：使读者对……一目了然，非常直观地理解被说明的事物。 摹状貌：对事物……的特征（事理）加以形象化的描摹，使说明更具体、生动、形象。 说明方法作用的分析必须联系原文 说明文的结构：总分式（由总到分、由分到总、总分总）、并列式、递进式

常见说明方法及其作用

常见说明方法及其作用 说明方法，是写说明文时用简明扼要的语言把事物的实际情况恰如其分地表述出来的方法。常见的说明方法有举例子、列数字、作比较、打比方、分类别、下定义、作诠释、引资料、摹状貌、列图表、作假设等11种。 运用恰当的说明方法，能提高说明语言的形象性、准确性，使说明对象更具体、更生动，让读者更明白，增强说服力。 （1）举例子：举出实际事例来说明事物，使所要说明的事物具体化，以便读者理解，这种说明方法叫举例法。（运用举事例的说明方法说明事物或事理，一要注意例子的代表性，二要注意例子的适量性。）（2）列数据：为了使所要说明的事物具体化，还可以采用列数据的方法，以便读者理解。需要注意的是，引用的数字，一定要准确无误，不准确的数字绝对不能用，即使是估计的数字，也要有可靠的根据，并力求近似。 （3）作比较：说明某些抽象的或者是人们比较陌生的事物，可以用具体的或者大家已经熟悉的事物和它比较，使读者通过比较得到具体而鲜明的印象。事物的特征也往往在比较中显现出来。（在作比较的时候，可以是同类相比，也可以是异类相比，可以对事物进行“横比”，也可以对事物进行“纵比”。）（4）打比方：利用两种不同事物之间的相似之处作比较，以突出事物的性状特点，增强说明的形象性和生动性的说明方法叫做打比方。 说明文中的打比方的说明方法，同修辞格上的比喻是一致的。不同的是，比喻修辞有明喻、暗喻、和借喻，而说明多用明喻和暗喻，借喻则不宜使用。 （5）分类别：将被说明的对象，按照一定的标准划分成不同的类别，一类一类地加以说明，这种说明方法，叫分类别。（分类别是将复杂的事物说清楚的重要方法。注意，运用分类别方法，所列举的种类不能有遗漏。） （6）下定义：用简明的语言对某一概念的本质特征作规定性的说明叫下定义。下定义能准确揭示事物的本质，是科技说明文常用的方法。 （7）作诠释：从一个侧面，就事物的某一个特点做些解释，这种方法叫诠释法。 （定义法和诠释法常采用“某某是什么”的语言形式。形式相同，如何区分呢？一般来说，“是”字两边的话能够互换，就是定义；如果不能互换，就是诠释。） （8）引资料：为了使说明的内容更充实具体，可以引资料说明。引资料的范围很广，可以是经典着作，名家名言，公式定律，典故谚语等。 （9）摹状貌：为了使被说明对象更形象、具体，可以进行状貌摹写，这种说明方法叫摹状貌。 （10）列图表：为了把复杂的事物说清楚，还可以采用图表法，来弥补单用文字表达的缺欠，对有些事物解说更直接、更具体。 （11）作假设：用假定的环境来预设将出现的状况说明事物的方法。 常见说明方法的作用 举例子：使文章表达的意思更明确，更生动形象，读者更明白，增强说服力。 列数字：数字是从数量上说明事物特征或事理的最精确、最科学、最有说服力的依据。（用列数字的方法进行说明，既能准确客观的反映事实情况，又有较强的说服力。） 作比较：说明某些抽象的或者是人们比较陌生的事物，可以用具体的或者大家已经熟悉的事物和它比较，使读者通过比较得到具体而鲜明的印象。 打比方：抽象的事理变得具体、生动、形象。（或把事物的特征解说得确切具体、浅显易懂。）引资料：使文章更具说服力。体现说明文语言的准确性。引用古诗：使说明文更具诗情画意。 分类别：条理清晰，一目了然。 下定义：使人们在阅读时对抽象的字词能够更加明白、理解。

lipo转染操作步骤

L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection