精子冷冻复苏效果的影响因素

精子冷冻复苏效果的影响因素

【摘要】不育症在世界范围内的发生率为l0％～15％，其中约有一半因素来源于男方。流行病学研究早已证实，近50年以来，男性精液的质量持续下降．男性精子几乎减少了一半并且每年还以2.1％的速度在减少。男性不育人数的增多甚至出现精子危机。为了应对精子质量的下滑，保存技术显得尤为重要。本文即对精子冷冻复苏保存的影响因素进行探讨与总结。【关键词】精子；冷冻复苏；精浆；精子危机；储存

环顾四周，男性不育人群日渐增加，精子库也成为越来越多不育家庭求助的借精之地。实际上，“精子危机”是否存在在学术界也有争论。2013年欧洲人类生殖与胚胎学会伦敦年会上关于男性的精子危机仍争论不一[1]。中华医学会男科分会候任主任委员姜辉说，他所在的北京大学第三医院接诊的不育患者中，无精症男性比例从2004年的6%上升到2008年的10%。同时，世界卫生组织颁布的“精子质量合格线”一直在下降，至2010年为1500万个，已是30年前的四分之一。为了应对精子质量的下降，人类精子的冷冻保存则逐渐成为人类精子库及生殖中心工作的重要组成部分。其用途主要体现在：供精者精液保存、男性生育力保存、男性不育症的治疗及最大限度降低传染性疾病的传播。因此，精子冷冻复苏的效果也越来越受到重视。

虽然我国人类精子库的数量较多，至2011年12月我国共批准建立了15家人类精子库。但需要的夫妇数量也很多，至今仍存在供不应求的情况，使得精子的储存越来越受到重视。影响精子冷冻复苏率的因素比较多，主要分为自身因素和非自身因素。本文通过查阅最近国内外文献，将影响精子冷冻复苏效果的因素分为实验室因素（冷冻保护剂、冷冻方法、复苏方法等）、精液自身因素（精浆因素、精子因素）及其他因素（季节、禁欲时间）等并作如下综述：

1. 实验室因素对精子冷冻复苏效果的影响

近年来，有大量文献研究如何提高人类精子的冷冻复苏率，影响人精子冻贮后效果的实验室因素主要有：冷冻保护剂、冷冻方法、精液与保护剂的比例、精液处理后冷冻、精液复苏方法、冻存时间等。

1.1 冷冻保护剂

研究表明，未添加冷冻保护剂的精子在冷冻贮存并复温后，仅有0.1%的精子具有一定程度的运动能力。在精子冷冻之前，为了减轻精子冷冻及复温过程中细胞的损伤，须加入一些具有保护作用的物质，这些物质统称冷冻保护剂。而精子细胞里的活性氧（ROS）具有很强的氧化活性，其浓度过高可以诱导细胞的脂类、蛋白及细胞内的DNA氧化损伤，从而引起一系列的病理变化。有些不育男性精液中缺乏与这些氧化物抗衡的物质，从而引起不育。有研究认为精浆中过多的ROS会导致精子的氧化损伤，以至于精子的功能受损以及精子核和精子DNA受损[2]。因此，ROS导致人精子的损伤，也可能降低精子对冷冻复温的抵抗能力[3]。

有许多研究认为在冷冻保护剂中添加一些抗氧化物质（如：维生素E、抗坏血酸葡糖苷、谷光甘肽、抗坏血酸和过氧化氢酶等）可以保护精子功能，明显提高精子的冷冻复苏率。在冷冻保护剂中添加维生素E可以提高冷冻后精子的活动力及精子DNA的完整性[4、5]；在冷冻保护剂中添加抗坏血酸等物质可以提高精子冷冻复苏率，LI等研究发现，在精子冷冻保护剂中添加抗坏血酸和过氧化氢酶可以抑制ROS的活性，从而可以提高精子冷冻复苏率[6]。另外，添加谷胱甘肽（GSH）对精子冷冻损伤也有一定的保护作用[7]。但也有研究认为不添加保护剂直接冻存和添加保护剂对精子DNA完整性的影响无显著差异[8]。

1.2 冷冻方法

根据降温速率不同将冷冻方法分为三种类型: 快速冷冻法（液氮蒸汽法）、慢速冷冻法（程序冷冻法）和玻璃化冷冻法。目前，国内外许多研究认为采用快速冷冻法和慢速冷冻法两种方法冷冻后，人类精子冷冻复苏率无统计学差异，两种方法冷冻方法均可适用于常规的精子冷冻[9、10、11、12]。另外，通过玻璃化冷冻方法对精子进行冷冻也取得很好的效果。Isachenko V等通过对上游法处理好的精液，用无冷冻保护剂与常规甘油保护剂的慢速冷冻方法比较，发现大体积的玻璃化冷冻方法对精子复苏后精子活力、精子膜完整性均高于普通的冷冻方法[13]。

冷冻过程中与冷冻保护剂接触的时间和温度也会对精子冷冻复苏效果产生影响。冷冻保护剂在温度较高的情况下随着温度上升，毒性也随之增加。因此，在精子冷冻前，一定要注意温度不要过高，室温应该保持在20～30℃。同时，要

注意平衡时间不宜太长。

1.3 复温方法

与精子冷冻过程一样，复苏过程同样会对精子产生损伤。但精子复苏过程到目前为止，还没有得到一个最佳的精液复苏方法。一般认为水浴比在空气中复温速率更快，并且外界温度越高，复温速率越大。现有的复温方法大致包括37℃水浴、15℃水浴、冰水及室温空气中自然复温4种。有些研究认为4种复温方法效果大致相同，也有研究并不认同。有研究认为冷冻精子在40℃条件下复苏比在20℃与37℃之间复苏有更高的精子冷冻复苏率，但两种温度复苏后精子的顶体完整率、DNA一致性，ATP酶含量差异并没有统计学意义[14]。

1.4 精浆比例

人类的精浆成份比较复杂，它的许多功能目前也没完全研究清楚。有研究认为精浆中的前列腺素E可以增加精子内的cAMP浓度[15]，以此来提高精子的运动能力；此外，Henricks等认为胰岛素样生长因子I及其在精子上的受体可以提高精子运动能力，尤其可以提高直线运动速率[16]。但也有研究认为精浆不利于精子受精。通常情况下，在进行宫腔人工授精时，精液常常洗涤以后使用以去除精浆对受精的影响[17]。对于精浆，不同配比的保护剂，保护效力也会不同。有研究显示，与精浆浓度50%相比，75%精浆可能具有更好的保护效果[18]。王学本等通过对含精浆浓度为0%,25%,50%,75%和100%的精子冷冻复苏率进行比较得出结论：一定的精浆浓度可以提高精子的冷冻复苏效果。即对某些不育患者的异常精液进行冷冻处理同时利用高冷冻复苏率的供者精浆置换不育患者精液的精浆可能获得较好的复苏效果[19]。

1.5 优选处理

正常的精子可以耐受一定范围内的冷冻和解冻速率。然而，冷冻保存确实对人精子功能有不良效应，特别是降低精子活力。一般而言，冷冻和解冻后仅约50%的活动精子存活。优化冷冻保存程序可使冷冻损伤降到最低，并且可以由此增加妊娠率[20]。并且，冷冻前精液质量越好（精子浓度、精子活力、形态正常精子百分率），冷冻复苏后精子的活力就越高。因此，为了得到更高比例的活动精子，常常会在冷冻前进行精子的优选处理。这样的精子对冷冻复苏损伤的耐受性更强，精子的冷冻复苏率更高。

1.6 反复冻融

这种影响主要表现在精子活力的影响。人类精液经过多次冷冻复苏过程，仍有一定比例的活动精子，但是，冷冻复温的循环次数越多，精子的活力和存活率就会越低。因此，必须应该尽量减少这种冷冻复苏的循环过程。有研究认为每经历一次冷冻复苏循环，精子DNA损伤率明显增加，精子活动力及存活率明显下降[21]。

1.7 储存时限

从理论上讲，保存在-196℃的精子细胞，其代谢已基本停止，目前较为一致的观点是：如果储存的方式恰当，在很长的一段时间内精子的存活率不会有很大的变化，可以无限期地保存下去[22]。众多的研究结果也表明，精液在液氮中保存数日与数月乃至数年，复温后精子存活率相同[23]。Yogev L 等对储存了0.5-14.4年的共2525份精液标本研究发现，长时间的精液保存不会影响复苏后前向运动精子的浓度[24]。但有些研究也认为长期保存对精子会有一定程度的不利影响[25]。

1.8 保存条件

用液氮蒸气代替液氮保存能够减少交叉污染的机会。因此有研究者建议将气相技术用于艾滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等携带者或患者的精子保存上。然而，在液氮气相贮存罐中，温度的梯度变化大，具体取决于容器的形状、容量和材料类型。并且应用气相贮存，需确保标本温度不低于-130℃否则易造成精子损伤。然而有研究关于精子在液氮及气态氮中保存对精子冻存效果的影响进行了比较，发现两种保存方式对冷冻精液的质量没有显著影响[26]。

2. 精液自身因素对冷冻复苏效果的影响

精子冷冻复苏率的个体差异很大，而且同一个人不同批次的精液其冷冻复苏率也不尽相同。一般情况下，冷冻前精子质量越高，解冻后精子的活力会越好，因此精液常规参数可以作为预测精子冷冻复苏效果的重要指标。精液的自身因素包括：精子因素（精液常规参数、精子基因及蛋白）、精浆成分（还原型谷胱甘肽含量、ROS浓度、胆固醇及Ca离子的浓度）等等。

2.1 精子因素

2.1.1 精液常规参数

评估精液质量的常规参数主要包括精子浓度、精子活力及形态正常精子百分率等等。使用冷冻前精液参数作为冷冻复苏后精子活力的预测指标的可靠性意见仍不一致，一些研究表明，冷冻前的精子活力与精子冷冻复苏率相关[27]；另有一些研究表明使用冷冻前参数很难预测精子复苏率。但大多数支持前者，尤其是精子正常形态与冷冻复苏率具有更高的相关性。Yogev L等研究发现射精后1h及4h精子活动力是预测精子耐冻性最好的指标[28]。此外，形态异常的精子与正常形态的精子相比，在经过冷冻后更容易引起DNA损伤[29]。

2.1.2 精子细胞凋亡

关于精子细胞的凋亡对冷冻复苏效果的影响，Said等对10例健康志愿者的精液通过磁性分离（MACS）技术进行处理，从而筛选到凋亡率低的精子，通过MACS 技术筛选后的精子进行冷冻复苏后，冷冻复苏率明显高于未经MACS技术筛选的精子,因此，他们认为筛选过的细胞凋亡率低的精子更易在冷冻复苏技术中保存更久且获得更大的受精率。[30]。

2.1.3 精子的基因

人类精液冷冻技术在有些精液标本中应用得很成功，但在有些精液标本中却存在一些问题，冷冻复苏后精子活力低。现在，有越来越多的证据表明精子对冷冻复苏过程的耐受性存在着个体差异，如：有些人或者动物的精液在冷冻前各项参数都很好，但冷冻复苏后精子的活力及存活率却很低。而且无精症及弱精症患者的精子基因调研显示有基因异常。因此寻找个体的基因差异能给精液冷冻保存提供基因基础指导。

2.1.4 精子的蛋白

热休克蛋白(HSP)又称应激蛋白，是细胞应激反应的生物标志，也是细胞的内源性保护蛋白，发挥着分子伴侣的作用。研究发现，在精子冷冻复苏过程中，精子受到有害因素的刺激，HSP将对精子的冷冻损伤有一定的保护作用。HSP90在公羊精子冷冻复苏过程中，就对精子冷冻损伤具有保护作用，HSP90含量也因此可用于预测公羊精子的耐冻能力[31]。

2.2 精浆因素

2.2.1 活性氧

精子获能及精子的顶体反应都需要活性氧（ROS）的存在，有研究表明缺乏

ROS的冷冻精液的精子活力比含有ROS的冷冻精液的精子活力低，精子形态异常率更高，即认为精子冷冻复苏后的活动力与精液中SOD含量呈正相关。

2.2.2 Ca离子及胆固醇

在精子获能的诸多影响因素中，细胞内Ca离子及胆固醇是最重要的因素之一。Mesequer 等122份男性的精浆及精子细胞内的胆固醇及Ca离子浓度进行检测，发现胆固醇浓度与精子冷冻复苏率没关系，细胞内外的Ca离子平衡对精子冷冻复苏率有一定的影响[32]。

2.2.3 精浆置换

人类精液中的精浆对精子的冷冻损伤具有一定的保护作用，精子的耐冻性可能与精浆成份有关，有研究认为，在对不育患者的精液进行冷冻处理时，利用高冷冻复苏率的供者精浆置换原不育患者精液中的精浆可能得到相对较好的冷冻复苏效果[18]。另外，还有研究发现通过添加精子耐冻性好的山羊精浆可以提高精子冷冻复苏率及冷冻复苏后IVF受精能力[33]。

3. 其他因素对精子冷冻复苏效果的影响

3.1 季节

环境因素影响精液质量已有很多报道，尤其是季节变化对精液质量的影响报道较多。据统计，夏季精子浓度最低，春节及冬季精子浓度最高。然而环境因素对精子冷冻复苏率的影响报道极少。有研究对分别将来自高原地区的精液标本与来自居住于溪谷的精液标本进行冷冻保存并复苏后测量冷冻精子的存活率和形态完整性，发现来自高原地区的冷冻精子活率和形态完整性方面都优于居住于溪谷的冷冻精液标本。另有研究认为精液冷冻复苏效果受到季节因素的影响，在春季与冬季，精子的冷冻复苏效果更好，这可能与这两个季节精子的活力与精子核的成熟度更高有关。Yogev L 等对供精者捐献的精液研究发现精液的耐冻性从3月至9月呈明显下降，复苏后前向运动精子的总数明显减少，他们认为冬季和春季更有利于供精者精液的储存[35]。

3.2 取精因素

取精因素主要是指取精方法及取精时的禁欲时间，该因素对精液质量的影响已有报道，尤其是禁欲时间的影响。有证据表明，不同的诱导射精方法会使精液标本的质量发生改变。不同的性唤醒方式，以及手淫取精所需时间的长短，都会

影响精液质量。对于同样的供精者，分别用手淫和电动按摩器刺激来获得精液，发现手淫的精液在冷冻复苏后活动力比通过电动按摩器刺激获得精液的冷冻复苏后活动力差，且用于ICSI后的受精率也相对要低。禁欲时间太短或太长均会影响精液的质量[35、36] 。有研究报道，随着禁欲时间的延长，精液量、精子总数及精子均会增加。Pellestor 等研究也认为，禁欲时间超过7d后，形态正常精子百分率显著下降。此外，有研究者认为精子的形态对其耐冻能力有很大影响，形态正常精子比形态异常精子更耐冻[37]。

综上所述，影响精子复苏率的因素很多，主要包括实验室因素、精液自身因素和其他因素等。实验室因素如冷冻保护剂、冷冻及复苏方法等可以进行质量控制以减少其不良影响。对于人类精子库来说，通过适当控制捐精的季节及禁欲天数可以提高冷冻后精液的质量，提高供精员的合格率。通过分析精子冷冻前的质量可以预测冷冻后精子的质量，可以避免进行冷冻复苏试验，从而减少实验室工作人员的工作量及精液标本的浪费。通过对精浆中ROS水平的检测，减少精浆中ROS的含量，从而提高精子的冷冻复苏率。另外，根据部分文献记载，供精志愿者的生活习惯（如吸烟、饮酒、熬夜等）、精液液化情况、渗透压等因素可能也会影响精子的冷冻复苏效果。因此，我们通过稳定和提高实验室精液冷冻技术水平，指导供精志愿者最佳的捐精时间，结合精液的质量来预测精子冷冻复苏后的效果，从而提高供精员精液的合格率，增加人类精子库的精液冻存量，更好的应对“精子危机”。

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精子冷冻保护剂

精子冷冻保护剂 简介： 正常精液是一种混合物，在射精时由睾丸和附睾的分泌物及悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成，最终射出的混合物是一种粘稠的液体。精子分析的方法有很多，其中可通过培养进行检测。 Leagene 精子冷冻保护剂主要由甘油、葡萄糖、枸橼酸钠、抗生素等组成，经无菌处理，其基本原理是在细胞冷冻过程中随着温度不断下降，细胞外液中作为各种电解质溶剂的水分首先形成细小的颗粒状冰晶，导致细胞外水份减少，电解质浓度增加，细胞外液渗透压升高，，用冷冻过程中产生的渗透压的梯度使细胞皱缩，而不损伤细胞。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)人类精液快速冷冻步骤 1、精液取出后，在37℃的水浴箱中液化。 2、精液液化后按照WHO 的标准进行常规分析，包括精液量、颜色、气味、PH 值、液化状况、精子密度、活动率、圆细胞数等，并做好相关记录。 3、提前将冷冻保护剂复温至室温。 4、将精液与冷冻保护剂按的比例混匀，并分装于冷冻管中，冷冻管做好标记。 5、将冷冻管置入4℃冰箱。 6、将冷冻管置入－80℃液氮蒸气。 7、将冷冻管投入液氮中冻存。 (二)人类精液程序冷冻步骤 1、精液取出后，在37℃的水浴箱中液化。 2、精液液化后按照WHO 的标准进行常规分析，包括精液量、颜色、气味、PH 值、液化状况、精子密度、活动率、圆细胞数等，并做好相关记录。 3、提前将冷冻保护剂复温至室温。 4、将精液与冷冻保护剂按的比例混匀，并分装于冷冻管中，冷冻管做好标记。 5、将冷冻管置于程序冷冻仪中，开始程序冷冻。冷冻程序如下：编号 名称CZ0150Storage 精子冷冻保护剂 100ml -20℃ 使用说明书1份

稀少精子冷冻技术

稀少精子冷冻技术 薛松果 临床应用价值高： 男方因素约占不孕症病因的30-40％，无精症约占男方因素的10％左右。1992年Palermo等首先将卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术应用于临床，解决了男性严重少、弱、畸形精子症患者不能生育子代的难题。而ICSI技术结合显微外科取精术如附睾精子抽吸术(microsurgical epididymal sperm aspiration，MESA)、经皮附睾穿刺取精术(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)和睾丸精子抽取术(testicular sperm extraction，TESE)则使无精症患者养育遗传学子代成为可能。 然而，MESA、PESA和TESE等都是创伤性手术，多次反复手术可能造成睾丸、附睾组织纤维化，导致不可逆的睾丸萎缩、生精功能退化，为了尽可能地减少患者反复穿刺取精的痛苦，更好地保全男性的生精功能，医学工作者试图对无精子症患者诊断性穿刺或ICSI治疗周期剩余的微量活动精子进行冷冻保存，在女方采卵当日将复苏后存活的精子用于ICSI，这将大大提高该类患者辅助生育治疗的灵活性和可靠性。 技术难度大： 但是，传统的精子冷冻采用 1.8mL的冷冻管(Cryovial)或0.25－0.5mL麦管(Straw)作为冷冻载体，冷冻/复苏过程还需要对精子作2-3次离心洗涤，每一步操作都会造成精子不同程度的损失。而睾丸或附睾穿刺获得的精子一般数量少、活力差，常规冻存复苏后，往往难以找到足够的活动精子进行ICSI，所以传统方法不适用于对穿刺获得的精子进行冷冻保存。 现状：

精子冷冻贮存

精子冷冻贮存 6.1 引言 精子冷冻保存是男科实验室工作中的一个重要组成部分，特别对不孕不育门诊的男科实验室来说。 从19世纪40年代末起，人类就开始研究精子低温生物学。发现甘油能保护精子免受冷冻损伤，可以将人类精子冷藏在–79℃的干冰上(Polge et al., 1949; Bunge &herman, 1953; Bunge et al., 1954)。随着液氮广泛应用，人类精子冷冻贮存技术取得快速发展，在许多国家建立起商业用途的精子库和国际间合作服务项目(Perloff et al., 1964; David et al., 1980; Clarke et al., 1997; Leibo et al., 2002)。 由于采用不同的冷冻保护剂和不同冷冻程序，出现许多冷冻贮存实验设计方案。冻融后细胞存活率主要取决于细胞内冰晶形成量能降低至何种程度，通过选择恰当的冷冻保护剂和采用最适冷冻速率和复融速率来减少细胞内水形成冰晶提高细胞的存活率(Sherman, 1990; Keel & Webster, 1993; Watson, 1995)。特别在复融过程中，当精子处于–130℃（玻璃化转化状态的关键温度）以上时间太长，细胞内有害的冰晶增多发生重结晶。 人类精子能够耐受一定范围内的冷冻和复融率。它们对快速冷冻（冷体克）产生损伤不敏感，主要原因可能是精子细胞膜中脂质双分子层结构的不饱和脂肪酸增加细胞膜流动性。而且因为细胞内水分含量少（约为50%），精子比其它细胞更能耐受低温导致损伤。但是低温仍对精子功能仍产生不良影响，特别是对精子活力影响比较大。一般而言，只有大约50%的活动精子能在冻存后复苏保持活力(Keel & Webster, 1993)。优化精子冷冻保存方法减低对活动精子的损害从而提高妊娠率(Woodset al., 2004)。 影响供精人工授精的妊娠率的因素包括复融后精子质量、人工授精的时机，而最为关键的是受方因素如年龄，前次供精妊娠情况以及与排卵、子宫输卵管相关疾病(Le Lannou & Lansac, 1993)。如果精子保存方法合适，精子质量不会随着冻存时间的延长而下降。冷冻保存超过28年的精子仍能使妇女受孕分娩婴儿(Clarke et al., 2006; Feldschuh et al., 2005)。 精子冷冻可适用于很多情况（见表6.1），在某些特殊情况下，冻存过程需要进行一些更改（见章节6.2.2）。

冷冻保存精子,把“根”留住

冷冻保存精子，把“根”留住 利用“精子银行”留“根” “不等了，我们离婚吧!”在男科门诊常常能够听到这种无奈的话语。结婚多年的夫妻，因为丈夫的精液质量问题(无精子、少精、弱精、畸形精子等)而最终导致劳燕分飞。“精子荒”已经成为一个严峻的社会问题。当代男人的精子和生育能力正在经受严峻的考验，许多男人不约而同地将自救措施瞄准了“精子银行”或“精子库”，希望将自己的生育种子寄存在那里，以备不时之需。所谓“精子银行”或“精子库”，就是指超低温冷冻存放精子的地方和设备。 精液冷冻是保存生育能力的一个有效办法，在接受具有生殖毒性药物和仪器治疗前先保存精子，已成为一种选择。目前认为，“精子银行”主要适合于下列几类人： 第一，对于那些还没有完成“传宗接代”任务，而又处在高危因素笼罩下的男人来说，“精子银行”可以起到储备生育能力的作用，防止因为某些损害因素，包括药物、手术、损伤等造成的生育能力的永久性丧失。例如某些即将长期接触有害睾丸健康的特殊职业(辐射和放射线等)人群，因某些疾病(恶性肿瘤)不得不使用损害

睾丸的化疗药物，不得不手术切除睾丸(睾丸肿瘤)等的 人群，可以预先冷冻精液，起到“生殖储备”的作用。 这也是使用“精子银行”的主要人群。 第二，“精子银行”可作为用于治疗男性不育症的 手段，可以多次保存少精子症者的精液，起到积少成多 的作用，最后可以“集中优势兵力”，用于人工授精， 期望一举获得成功。另外，“精子银行”也是计划生育 措施顺利实行的有力保证。 精子冷冻安全，并非人人需要 低温冷藏的精子具有较高的质量和安全性，在零下196摄氏度的低温下可以将精子良好保存达数十年之久，且这些精子仍然具有生育能力。在低温保存过程中，还 可以淘汰许多发育异常的精子。一些携带传染性病原体 的献精员，例如艾滋病病毒携带者，也可以在精子冷藏 保存过程被发现而淘汰其精液。因此，采用“精子银行”的精子是比较安全且让人放心的，获得怀孕者自然流产 机会少，出生孩子畸形者少，后代素质高。 从理论上讲，所有男人的精子都可以保存在“精子 银行”里，从而使生育能力获得万无一失的保障。以现 今的科学技术，保存精子已经是非常简单的常规手段， 费用(每年2000～3000元)也可以承受，但并不是所有的男人都需要“精子银行”的帮助。

精子冷冻复苏效果的影响因素

精子冷冻复苏效果的影响因素 【摘要】不育症在世界范围内的发生率为l0％～15％，其中约有一半因素来源于男方。流行病学研究早已证实，近50年以来，男性精液的质量持续下降．男性精子几乎减少了一半并且每年还以2.1％的速度在减少。男性不育人数的增多甚至出现精子危机。为了应对精子质量的下滑，保存技术显得尤为重要。本文即对精子冷冻复苏保存的影响因素进行探讨与总结。【关键词】精子；冷冻复苏；精浆；精子危机；储存 环顾四周，男性不育人群日渐增加，精子库也成为越来越多不育家庭求助的借精之地。实际上，“精子危机”是否存在在学术界也有争论。2013年欧洲人类生殖与胚胎学会伦敦年会上关于男性的精子危机仍争论不一[1]。中华医学会男科分会候任主任委员姜辉说，他所在的北京大学第三医院接诊的不育患者中，无精症男性比例从2004年的6%上升到2008年的10%。同时，世界卫生组织颁布的“精子质量合格线”一直在下降，至2010年为1500万个，已是30年前的四分之一。为了应对精子质量的下降，人类精子的冷冻保存则逐渐成为人类精子库及生殖中心工作的重要组成部分。其用途主要体现在：供精者精液保存、男性生育力保存、男性不育症的治疗及最大限度降低传染性疾病的传播。因此，精子冷冻复苏的效果也越来越受到重视。 虽然我国人类精子库的数量较多，至2011年12月我国共批准建立了15家人类精子库。但需要的夫妇数量也很多，至今仍存在供不应求的情况，使得精子的储存越来越受到重视。影响精子冷冻复苏率的因素比较多，主要分为自身因素和非自身因素。本文通过查阅最近国内外文献，将影响精子冷冻复苏效果的因素分为实验室因素（冷冻保护剂、冷冻方法、复苏方法等）、精液自身因素（精浆因素、精子因素）及其他因素（季节、禁欲时间）等并作如下综述： 1. 实验室因素对精子冷冻复苏效果的影响 近年来，有大量文献研究如何提高人类精子的冷冻复苏率，影响人精子冻贮后效果的实验室因素主要有：冷冻保护剂、冷冻方法、精液与保护剂的比例、精液处理后冷冻、精液复苏方法、冻存时间等。

小鼠胚胎-精子冷冻保种申请表-清华大学试验动物中心

小鼠胚胎/精子冷冻保种申请表 需要填写的资料： 说明： 1.*表示必须填写； 2.保种方式的选择：我们采用精子冻存和胚胎冻存的方法进行保种；假如为杂合子，雄性数量≥3 只并且可以和B6交配做净化，我们推荐安乐死一只雄鼠使用精子冻存的方式保种，可以有效控制保种周期，不受雌鼠排卵多少的限制。 3.保种对提供小鼠的要求： 精子冻存 冷冻精子需要提供的小鼠信息：阳性纯合子雄鼠，2-3只，12-18W（最佳），生育能力良好，在实验前7d内进行过成功交配，而在3d内未交配过；冻存2只/品系，20个麦管。 费用：200元/麦管 冷冻的流程和所需的时间： 1)提前1周邮件预约申请，写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 2)通过申请后安排实验，精子冻存后至少1周进行复苏检测实验（1麦管）。 3)等待代孕小鼠生仔（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，（一周内反 馈检测结果。） 冷冻后的保存：液氮中保存 终生免费保存。 精子复苏（除复苏检测外） a、外来精子复苏 提前1周邮件预约申请，写明小鼠冻精信息（品系，数量），送达时间。

从接收之日起，1周内安排复苏实验 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：IVF 500元，IVF用B6（含激素）40元/只，移植用受体单侧100元/只，双侧180元/只，试剂和人工费100元。 如需其他品系雌鼠，需从外单位订购。 b、动物中心精子复苏 提前1周邮件预约申请，写明复苏品系。 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：IVF 500元，IVF用B6（含激素）40元/只，移植用受体单侧100元/只，双侧180元/只，试剂和人工费100元。 注意事项： 1. 运输过程中：请使用专业运输工具（航空罐）进行运输，运输过程中请避免磕碰，注意液氮充足。 2. 由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同，请一定提供冷冻和复苏的protocol作为参考，且不保证100%复苏成功。截止2015年9月，我们复苏精子平均成功率是40%。 胚胎冻存 品系内冻存需要提供的小鼠信息：雄鼠2-3只12-18W,雌鼠至少10只，3-4W或9-12W。正常情况下可冻存200枚胚胎左右。 费用3000元/品系。 与B6冻存：雄性小鼠，2-3只12-18W，中心提供雌性B6小鼠3-4W，30只。正常情况下可冻存500-600枚胚胎左右。 费用3000元/品系+B6费用40元/只。 c．冷冻流程和所需时间 提前1周邮件预约申请，写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 通过申请后一周左右安排实验，胚胎冻存采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，玻璃化冻存。胚胎冻存后至少1周进行复苏检测实验（1个冻存管，30 -50枚胚胎/管） 复苏回收的成活2-cell，采用输卵管移植到代孕母鼠体内，19.5天生仔，1-12天剪尾通知取回检测，（一周内反馈检测结果。） 冷冻后的保存：液氮中保存 终生免费保存。 胚胎复苏（除复苏检测外） a、外来胚胎复苏 提前1周邮件预约申请，写明小鼠冻存胚胎信息（品系，数量）送达时间。 从接收之日起，1周内安排复苏实验，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） b．动物中心胚胎复苏 提前1周邮件预约申请，写明复苏品系。 通过申请后1周左右安排复苏实验，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：移植用受体单侧移植100元/只，双侧移植180元/只，试剂和人工费100元。 注意事项： 1.运输过程中：请使用专业运输工具（航空罐）进行运输，运输过程中请避免磕碰，注意液氮 充足。 2.由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同，请一定提供冷冻和复苏的protocol作 为参考，且不保证100%复苏成功。截止2015年9月，我们复苏胚胎平均成功率是60%。

小鼠冷冻精子复苏协议校内

小鼠冷冻精子复苏协议（校内） 甲方： 乙方：厦门大学实验动物中心 经甲、乙双方友好协商，对甲方品系背景（包括C57BL/6J，BALB/c等）小鼠的冷冻精子复苏达成以下协议： 一、责任和义务 甲方： 1、甲方承诺对所需复苏小鼠的合法性负全部责任，同时提供该品系小鼠的《小鼠精子冻存保种协议》作为依据。 2、甲方负责复苏后小鼠基因型鉴定。自收到样品后，五个工作日内必须回复基因型测定结果。如果逾期不能提供鉴定结果，需要陈述原因和提出延期申请。超出时限(30天)未能提供鉴定结果且延期申请未得到动物中心批准的，动物中心有权处置已复苏的小鼠。 乙方： 1、应甲方需求，向甲方提供复苏验证所需的背景品系，包括C57BL/6J，BALB/c等。 2、在甲方支付复苏费用后启动复苏项目，原则上在3个月内向课题组提供每个品系至少3只可遗传的阳性小鼠。 二、费用及支付方式： 1、在协议签订后的3周内，甲方需支付精子复苏操作费人民币壹仟捌佰元整（￥1800.00）。 2、如甲方逾期未支付费用，则该协议自动失效。 三、合同终止 由于一方未能履行本协议约定的义务，导致项目无法完成，另一方可以提出终止项目。如为甲方原因，已缴付费用由甲方承担，乙方不返还所缴付费用，亦不收取其他费用。如为乙方操作失误或其他不可预见的因素导致项目无法完成，乙方应与甲方协商解决，取得谅解，达成协议。 四、其他： 1、若双方无特殊协定，本项目风险双方共担。

2、不可抗力：本协议的任何一方如遇不可抗力（水灾、海啸、地震、雷击、台风、旋风、疫病、战争、暴乱或其他的不能预见、不能避免的不可抗力）导致部分或全部无法履行本协议，则可免除其责任。 3、本协议一式贰份，双方各执壹份。 4、本协议经双方签字后立即生效执行。 甲方名称： 负责人（签字）： 联系电话： 经办人（签字）： 联系电话： 日期：年月日乙方名称：厦门大学实验动物中心负责人（签字）： 联系电话： 经办人（签字）： 联系电话： 日期：年月日