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LMP_1增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建_徐瑞凤

收稿日期:2010-05-11

基金项目:广东省科技计划项目(2007B030704012);广州市科技计划项目(2008J-C131)

作者简介:徐瑞凤(1984-),女,在读硕士研究生,电话:020-********,

E-mail:xuruifeng2003@http://www.wendangku.net/doc/b03231c4afaad1f34693daef5ef7ba0d4b736d5a.html

通讯作者:廖旺军(1964-),副教授,E-mail:liaowj@http://www.wendangku.net/doc/b03231c4afaad1f34693daef5ef7ba0d4b736d5a.html ;罗荣城,教授,E-mail:luorc01@http://www.wendangku.net/doc/b03231c4afaad1f34693daef5ef7ba0d4b736d5a.html

LMP-1增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

徐瑞凤,石敏,尤长宣,吕成伟,罗荣城,廖旺军(南方医科大学南方医院肿瘤中心,广东广州510515)

摘要:目的构建EB 病毒潜伏膜蛋白-1(LMP-1)增强型绿色荧光蛋白真核表达载体。方法用PCR 的方法从EB 病毒阳性的鼻咽癌组织中调取EB 病毒潜伏膜蛋白-1的基因,然后定向克隆到真核表达质粒pEGFP-C3上,以此构建成重组质粒pEGFP-C3-LMP1。结果经酶切及测序鉴定,确定已获得重组质粒pEGFP-C3-LMP1。结论在增强型绿色荧光蛋白真核表达质粒中已成功克隆了EB 病毒LMP-1基因。关键词:EB 病毒;潜伏膜蛋白-1;增强型绿色荧光蛋白中图分类号:R34

文献标识码:A

文章编号:1673-4254(2010)08-1982-02

EB 病毒(EBV )是Epstein 和Barr 在1964年首先从非洲Burkitt 淋巴瘤培养细胞中发现的,它属于γ-疱疹病毒属[1]。大量的研究表明EBV 与Burkitt 淋

巴瘤、传染性单核细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴瘤、鼻咽癌(NPC )等疾病密切相关,其中EBV 与

NPC 的关系尤为受到重视。EBV 在NPC 细胞中主要以持续Ⅱ型潜伏感染状态出现,以编码表达EBNAs1和LMP-1、LMP-2为特点[2]。LMP-1目前被广泛认为

是EBV 的致瘤基因,它能够促进增殖、抑制分化、引起细胞发生恶性转化,在NPC 的发生、发展和转移中起重要作用。

LMP-1为完整的跨膜蛋白,蛋白的N-端和C-端均在胞浆内,其相对分子量为60KD 。编码LMP-1

的基因是位于EBV 基因组U5-TR 区的BNLF-1基因[3]。研究表明,LMP-1能够刺激机体产生LMP-1特异性的细胞毒性T 细胞(CTL )。本实验的目的是用

PCR 分子克隆技术,构建真核表达载体pEGFP-C3-LMP1,并将其转染树突状细胞,为制备LMP1特异性的CTL 打下基础。

1材料与方法1.1材料

NPC 组织取自一位56岁的男性NPC 患者,绿

色荧光蛋白质粒pEGFP-C3、Ecoli DH5α菌株由本室保存,Trizol 购自Invitrogen 公司,限制性核酸内切酶Bam H Ⅰ、Eco R Ⅰ、Hin d Ⅲ,DL2000、1kbp DNA

Ladder Marker 、DNA-Polymerse 、T 4DNA 连接酶等均为日本TaKaRa 公司产品,DNA 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自DONGSHENG BIOTECH 公司。1.2方法

1.2.1引物设计合成根据GeneBank 中LMP-1的序列设计引物如下:上游引物5'-CCGGAATTCATGGA ACACGACCTTGAGAGGGG-3';下游引物5'-CGCG GATCCTTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAACTGGG -3'。在上游引物中引入一个Eco R Ⅰ酶切位点,在下游引物中引入一个Bam H Ⅰ酶切位点。引物合成由广州

英俊生物技术有限公司完成。

1.2.2目的基因的体外扩增用Trizol 一步法提取NPC 组织总RNA (按RNA 抽提试剂盒说明书操作),以Oligo (dT )为引物逆转录合成cDNA 。并建立PCR 反应体系,置于GeneAmp PCR System 2400型PCR 扩增仪扩增。PCR 反应条件为:①94℃预变性5min ,②94℃变性30s ,55℃退火30s ,72℃延伸1min 20s 共进行32个循环,③72℃延伸5min 。取5μl 反应产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳。

1.2.3pEGFP-C3-LMP1真核表达重组质粒的构建将上述PCR 产物凝胶电泳,切胶回收阳性条带,用DNA 回收纯化试剂盒纯化回收,用Bam H Ⅰ、Eco R Ⅰ分别双酶切回收的LMP-1片段和真核表达载体pEGFP-C3,电泳线性片段并予以切胶回收、纯化。用T4DNA 连接酶连接pEGFP-C3载体片段与LMP-1基因片段,将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌,铺含卡那霉素的LB 平板,随机挑取克隆菌落并

提取质粒。将所提取的质粒进行Bam H Ⅰ、Eco R Ⅰ双酶切鉴定,另取菌液送华大基因公司测序以验证目的片段碱基序列的正确性。

2结果

2.1LMP-1基因的PCR 扩增结果

取5μl 反应产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳。结果在凝胶成像系统下可观察到一条约1.2kb 的DNA 片段,与所预期的目的片段相符合见图1。2.2pEGFP-C3-LMP-1重组质粒的鉴定

重组质粒经Bam H Ⅰ、Eco R Ⅰ双酶切后可见约1.2kb 的插入片段和4.7kb 的载体片段(图2),提示重组质粒含有LMP-1基因编码区全长。分别采用通

南方医科大学学报(J South Med Univ)2010;30(8)

1982··

图1LMP-1PCR 扩增产物电泳图

2kb 1kb

M

1

用引物正向测序、反向测序,测序结果证明插入片段阅读框和方向正确。

3讨论

NPC 是我国南方及东南亚地区常见的肿瘤,发病率从15/10万~50/10万不等[4]。大量研究表明EBV 与NPC 的发生有着密切的关系,EBV 在未分化和低分化NPC 中广泛存在。LMP-1目前被广泛认为是EBV 唯一的致瘤基因。据报道,LMP-1在NPC 组织中的表达率约为65%[5]。本实验从EBV 阳性的NPC 组织中提取总RNA ,并通过RT-PCR 扩增出LMP-1基因,将其定向克隆到绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C3上,并将其命名为pEGFP-C3-LMP1。构建

的重组质粒经限制性内切酶双酶切,酶切图与预期结果相符,获得约1.2kb 大小的目的片段和约4.7kb 大小的载体片段。目的基因测序结果表明,与GenBank 中登陆的LMP-1基因序列完全一致。因此本实验中

LMP-1基因克隆成功。绿色荧光蛋白是从发光水母分离出来的一种化学性能稳定的荧光蛋白,在488nm 紫外光激发下,不需加入任何反应底物便可发出易于检出的绿色荧光。EGFP 是GFP 的优化突变体,它所发射出的荧光强度要比野生型强35倍以上。本实验利用EGFP 作为报告基因,成功构建了LMP-1真核表达载体pEGFP-C3-LMP1,为后续研究结果的

观察和评定提供了便利。

研究表明[6]

,LMP-1可以激活B 细胞和上皮细胞

生长,通过TRAF-TRADD 信号传递,活化转录因子

NF-κB 、AP-1和JNK ,从而调节细胞增殖和凋亡程序,使细胞发生恶性转化。Jen 等[7]的研究表明,中国大陆鼻咽癌来源的LMP-1与B95-8细胞株来源的

LMP-1以及涎腺淋巴上皮癌来源的LMP-1基因序列有一定的差别。中国大陆鼻咽癌来源的LMP-1普遍存在C 端30个碱基的缺失,从而使其具有更高的活化转录因子NF-κB 的能力。本研究从鼻咽癌高发区-中国广东鼻咽癌患者的肿瘤组织中扩增出LMP-1基因,接下来的研究中,拟将其转染人树突状细胞(DC ),并刺激机体产生LMP-1特异性的CTL 。为研究鼻咽癌的免疫治疗奠定基础。Gottschalk 等[8]用无活性的、无毒性的LMP-1突变体(第43位N-末端突变体,△LMP-1)的腺病毒转染DC ,转染后的DC 高表达△LMP-1,并且表达△LMP-1的DC 可以使NPC 患者外周血中LMP-1特异性的CTL 增高500~3800倍。Duraiswamy 等[9]用LMP1重组痘病毒载体修饰DC ,基因转染后激活的CTL 在体外裸鼠肿瘤模型中显示出肿瘤特异性的T 细胞杀伤效应。而没有注射CTL 的裸鼠因肿瘤的进展而死亡。

综上所述,本实验成功构建了LMP-1真核表达载体pEGFP-C3-LMP1,并准备将其转染DC ,为制备LMP1特异性的CTL 奠定基础。也为建立LMP-1稳定表达的NPC 细胞株提供了条件。

参考文献:

[1]

Steinman RM,Cohn ZA.Identification of a novel cell type in

peripheral lymphoid organs of mice.I.Morphology,quantitation,tissue distribution [J ].J Exp Med,1973,137(5):1162-4.

[2]John Craddock,Helen E,Heslop.Adoptive cellular therapy with T

cells specific for EBV-derived tumor antigens [J ].Update Cancer Ther,2008,3(1):33-41.

[3]Morris MA,Dawson CW,Young LS.Role of the Epstein-Barr

virus-encoded latent membrane protein-1,LMP1,in the

pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma [J ].Future Oncol,2009,5(6):811-5.

[4]Masmoudi A,Toumi N,Khanfir A,et al.Epstein-Barr virus-targeted

immunotherapy for nasopharyngeal carcinoma [J ].Cancer Treat Rev,2007,33(6):499-505.

[5]Fahreus R,Fu HL,Ernberg I,et al.Expression of Epstein-Barr

virus-encoded proteins in nasopharyngeal carcinoma [J ].Int J

Cancer,1988,42(3):329-38.[6]

Wu CJ,Leu CY,Liu ST,et al.Transcriptional activation of NF -kappa bactivity by Epstein Barr virus (EBV)LMP1as a select strategy for EBV associated disease [J ].Gene Ther,1998,5(7):905-12.

[7]Jen KY,Chi MH,Cheng J,et al.Nucleotide sequences and functions

of the Epstein-Barr virus latent membrane protein 1genes isolated from salivary gland lymphoepithelial carcinomas [J ].Virus Gen,2005,30(2):223-35.

[8]Gottschalk S,Edwards OL,Sili U.Generating CTLs against the

subdominant Epstein-Barr virus LMP1antigen for the adoptive immunotherapy of EBV-associated malignancies [J ].Blood,2003,101(5):1905-12.[9]Duraiswamy J,

Sherritt M,Thomson S.Therapeutic LMP1

polyepitope vaccine for EBV-associated Hodgkin disease and nasopharyngeal carcinoma [J ].Blood,2003,101(8):3150-6.

5kb 4kb

M 1

5kb 4kb

M 1

图2pEGFP-C3-LMP1重组质粒双酶切电泳图

图3pEGFP-C3单酶切电泳图

3

2

徐瑞凤,等.LMP-1增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

第8期1983··