应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白
应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白
Ξ
罗廷荣1 源宣之2 金城俊夫2(1 广西大学动物科技学院,南宁530005;2 日本岐阜大学农学部兽医公共卫生学研究室)
摘要 本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖(G )蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病
病毒疫苗株RC HL 株G 蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9细胞中,分离出2个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA )从重组杆状病毒感染的Sf 9细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf 9细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL 株感染NA 细胞的G 蛋白的分子量一致。35个抗RC HL 株G
蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9细胞反应,表明表达的G 蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G 蛋白主要分布在Sf 9细胞的膜表面,形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL 株感染的NA 细胞的荧光相同。
关键词 狂犬病病毒;糖蛋白;重组杆状病毒
中图分类号 S 852165911;S 8521655
Expression of Glycoprote i n of Rab ies V irus Usi ng Baculov irus Vector
L uo T ingrong 1 M inam o to N obuyuk i 2 K in jo To sh i o
2(1 Co llege of A n i m al Sciences and T echno logy ,Guangx i U n iv .,N ann ing 530005
2D ep artm en t of V eterinary Pub lic H ealth ,Facu lty of A gricu ltu re ,Gifu U n iversity ,Japan )Abstract In th is exp eri m en t w e have successfu lly exp ressed rab ies vivu s glycop ro tein (G p ro tein )u sing bacu loviru s vecto r .Tw o clones of recom b inan t bacu loviru s w ere iso lated from Sf 9cells ,in w h ich w as tran sfeted w ith DNA of w ild typ e bacu loviru s and bacu loviru s tran sfer vecto r in 2serted G p ro tein gene of RC HL strain u sed fo r p roducti on of an i m als rab ies vaccine in Japan .B y u s 2ing w estern b lo t and indirect i m m unofluo rescen t assay (IFA ),the G p ro tein of rab ies viru s w as detect 2ed from Sf 9cells w h ich w ere infected w ith recom b inan t bacu loviru s .T he G p ro tein in Sf 9cells ex 2p ressed by recom b inan t bacu loviru s show ed iden tical m o lecu lar w eigh t w ith that in NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies vru s .T h irty five m onoclonal an tibodies (M A b s )again st G p ro tein of RC HL strain reacted w ith G p ro tein on the Sf 9cells infected w ith recom b inan t bacu loviru s ,indi 2
cating that an tigen ic variati on of the exp ressed G p ro tein has no t been found .M ajo rity of the exp ressed G p ro tein ex ists on the su rface of Sf 9cells ,fluo rescence of the Sf 9cells fo r m ed a ring like w hen
it infected w ith recom b inan t bacu loviru s and w as dyed by IFA .T h is k ind of fluo rescence on the Sf
9cells w as the sam e as that on NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies viru s u sing IFA .
Key works rab ies viru s ;G p ro tein ;recom b inan t bacu loviru s
狂犬病毒的糖(G )蛋白有多种功能:刺激中和抗体的产生而诱导免疫保护、细胞融合性、与细胞表面受体结合、血球凝集和免疫溶解。近年来,根据不同的目的,狂犬病毒的G 蛋白基因已在不同的载体系统被表达,其中包括大肠杆菌系统、酵母系统、禽痘病毒和牛痘病毒载体系统。引人注目的是,第18卷 第4期V o l 118N o 14广西农业生物科学Journal of Guangxi A gric .and B i o l .Science 1999年12月 D ec .1999
Ξ第一作者:男,1962年生,博士,副教授。
收稿日期:19990402
262广西农业生物科学第18卷
禽痘病毒和牛痘病毒载体表达的狂犬病毒G蛋白在欧洲已应用于野生动物的口服免疫,对野生动物狂犬病的控制取得了较好的效果,为狂犬病疫苗的开发提供新途径。最近又发明了一种新的表达系统:杆状病毒载体。该系统既能大量表达目的蛋白,又能保持原有蛋白的各种生物学特性。本研究利用杆状病毒载体成功地表达了一个日本动物用疫苗株的G蛋白,并对其抗原性进行了测定,为狂犬病疫苗的开发提供新数据。
1 材料与方法
111 细胞与病毒
Sf9细胞培养在含10%胎牛血清(FCS)的TC100培养液中,野生杆状病毒和重组杆状病毒毒株分别培养在Sf9细胞上。NA细胞培养在含10%FCS的Eagle′s氏基础培养液,用于狂犬病毒RC HL株的培养。
112 单克隆抗体
根据先前的方法制备了35个针对狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体(L uo等,1998),这些单克隆抗体用于测定表达的G蛋白的抗原性。
113 狂犬病毒G蛋白基因的克隆
用Isogen(日本产)法从感染RC HL株4d的NA细胞上清中提取病毒RNA,经反转录和聚合酶链反应(R T PCR)合成G蛋白c DNA。精制的c DNA经大肠杆菌DNA聚合酶大片段K lenow修饰后,通过T4DNA连结酶接合到质粒pU C19的Sm a 限制核酸内切酶位点上。
114 重组杆状病毒转移载体(tran sfer vector)的构建
用限制核酸内切酶EcoR I和B am H I把狂犬病毒G蛋白基因从质粒pU C19上切断并分离纯化。同时用EcoR I和B am H I来消化杆状病毒转移载体pVL1392并分离纯化。然后通过T4连结酶把G基因连结到pVL1392上(pVL1392G)。重组的pVL1392G用EcoR I和B am H I消化及一对G 基因特异性引物扩增,确认G基因的存在后,转化到E.co li DH5Α菌中大量复制和提纯后保存于80℃备用。
115 Sf9细胞的准备
分别把含110×106个处于最佳生长状态的Sf9细胞2mL置315c m的塑料小平皿中均匀分布,经30m in静置后,细胞贴附在平皿上,待用。
116 重组杆状病毒的转染
将致死性线状杆状病毒DNA1Λg和含G基因的重组杆状病毒转移载体pVL1392G5Λg加在一个015mL小管中,用灭菌超纯水稀释至8ΛL。然后加入用灭菌超水稀释2倍的脂质体(li pofectin) 8ΛL,混合均匀,室温15m in静置后,接种到含115mL无血清培养液的Sf9细胞(110×106细胞 315mL小平皿),2615℃培养3d,收集上清液。用这些上清液在Sf9细胞上作空斑试验,以选择重组狂犬病毒G蛋白的杆状病毒。
117 琼脂糖的调制
预先将低融点琼脂糖用灭菌双蒸水配成3%,经微波炉融化后置37℃温箱。含血清的TC100培养液同置于37℃温箱,待二者的温度调至37℃时,按琼脂糖∶培养液=1∶2的比例混合,置37℃待用。
118 重组杆状病毒的选择
把转染后第3d的细胞上清液稀释成原液、101和102浓度,分别取100ΛL接种到贴附在平皿的Sf 9细胞上,经60m in吸附,除去病毒接种液,迅速加入2mL调制好的琼脂糖培养液,待琼脂糖培养液凝固后,再加入1mL含血清的TC100,2615℃培养3d后,加入用PB S配成0101%的中性红溶液1mL,染色过夜。挑取透明的空斑,并悬浮于小量(014mL)的培养液,充分搅拌使病毒释放出来,
低速离心,取上清液作系列稀释后进行空斑试验,纯化重组病毒克隆,然后大量培养高滴度的病毒液,作保存用
。
图1 重组杆状病毒转移载体中狂犬病毒G 基因的酶切图谱
F ig .1 I den tif ication of rabies v irus
G gene i n reco m bi nan t
baculov irus tran sfer vector by restr iction endonuclease 11M arker ,ΚDNA Sty I
21提纯G 基因Purified G gene 31重组转移载体pVL 1392G EcoR I BamH I R ecom binant transfer vecto r
pVL 1392G EcoR I BamH I
119 荧光抗体法(IFA )检测表达的狂犬病毒G
蛋白
重组杆状病毒感染的Sf 9细胞和狂犬病毒RC HL 株感染的NA 细胞用冷丙酮固定20
m in ,晾干。
在37℃分别与35个抗G 蛋白单克隆抗体孵育1h ,PB S 洗涤3次。用荧光标记的山羊
抗小鼠Ig A .G .M 染色1h ,PB S 洗涤后晾干,
加甘油缓冲液和盖玻片,观察荧光反应。
1110 S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S PAGE )
和印渍法(W estern blot )检测表达的狂犬病毒G
蛋白
分别收集重组杆状病毒感染1～6d 的Sf 9
细胞,经3,000rpm 离心10m in 后除去上清,沉
淀细胞用灭菌PB S 洗涤2次,加入样本液(60
mM T ris HC l pH 618,2%SD S ,1%二巯基乙
醇,10%甘油,01005%溴酚蓝)将细胞溶解,于
100℃处理5m in ,3,000rpm 离心5m in 除去粗大碎片后,上清作狂犬病毒G 蛋白检测用。SD S 处理后的细胞样本经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳
后,分别用考马斯亮兰染色和印渍法平行检测狂犬病毒G 蛋白。印渍法是将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维膜上,用5%的奶粉溶液封闭空白后,用1∶1000的识别G 蛋白上的一个线性抗原决定簇的单克隆抗体M A b 1513(L uo 等,1997),在4℃孵育过夜。洗涤后,结合到G 蛋白的抗体用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 和ECL 发光系统检测G 蛋白。2 结果
211 重组转移载体的构建和重组标状状病毒的选择
通过核酸内切酶EcoR I 和B am H I 把从pU C 19上切下的狂犬病毒G 基因重组到杆状病毒载体pVL 1392上。利用同样的内切酶确认G 基因的存在(图1)。同时用一对狂犬病毒G 基因特异引物扩增出大小与预想一致的核酸片段(数据略),进一步确认重组转移载体的准确性。杆状病毒线性DNA 1Λg 和重组转换载体混合,在脂质体的辅助下转染到Sf 9细胞,经3d 培养后,收取其培养上清作空斑试验,从中筛选出2个重组杆状病毒克隆。212 S D S PAGE 和印渍法检测表达的狂犬病毒G 蛋白
为了评价重组杆状病毒表达狂犬病毒G 蛋白的效率,每个Sf 9细胞用1PFU 的野生杆状病毒和重组杆状病毒感染,感染后1～6d 的Sf 9细胞经样本液处理,平行进行SD S PA GE 后的考马斯亮兰染色(图2a )和印渍法(图2b )。
362第4期罗廷荣等:应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白
图2 用S D S PAGE 和W estern blot 检测重组杆状病毒表达的狂犬病毒蛋白的电泳图
F ig .2 D etection of rabies v irus
G prote i n expressed by reco m bi nan t
baculov irus usi ng S D S PAGE and western blot
11蛋白分子量对照;21正常Sf
9细胞;31野生杆状细胞感染Sf 9细胞;4～91重组杆状病毒感染第1～6d 的Sf 9细胞;101正常Sf 9细胞上清液;111重组杆状病毒感染第3dSf 9细胞的上清液。
1.mo lecular w eigh t m arkers of p ro teins ;
2.N o r m al Sf
9cells ;3.w ild type baculovirus infected Sf 9cells ;4～9.vecom binant baculovirus infected Sf 9cells from the Ist to sixth day ;10.fluid of no r m al Sf 9cells ;11,fluid of recom binant baculovirus infected Sf 9cells in the 3rd day .通过与未感染和野生杆状病毒感染的Sf 9细胞比较,用考马斯亮兰染色的凝胶上,重组杆状病毒感染第2～6d 的Sf 9细胞于58KD a 处有一清晰的粗蛋白带,这一蛋白带正好与狂犬病毒G 蛋白的分子量相一致。而未感染或野生杆状病毒感染和重组杆状病毒感染第1d 的Sf 9细胞,
这一蛋白带则不明显,推定这一蛋白带可能与狂犬病毒G 蛋白相关。
图3 用I FA 检测Sf 9细胞上表达的狂犬病毒G 蛋白F ig .3 D etection of rabies v irus G prote i n expressed on Sf 9cells usi ng I FA
a .野生型杆状病毒感染的Sf 9细胞。
b .重组杆状病毒感染的Sf 9细胞。
a .W ild type baculovirus infected Sf 9cells .
b .R ecom binant baculavirus infected Sf
9cells .印渍法结果显示,重组杆状病毒感染第1
～6d 的Sf 9细胞,于58KD a 处重组杆状病
毒合成的蛋白与抗狂犬病毒G 蛋白单克隆抗
体M A b 1513发生反应,出现清晰的反应带,
并且在感染后第3～4d 的反应带最粗,表明在这一期间细胞合成的G 蛋白量最多。而对照Sf
9细胞和野生杆状病毒感染的Sf 9细胞则
不与M A b 1513发生反应。
213表达的狂犬病毒G 蛋白在Sf 9细胞的定
位
为了决定表达的狂犬病毒G 蛋白在Sf 9
细胞的存在部位,应用IFA 对重组杆状病毒感
染48h 的Sf 9细胞进行检测,同时用RC
HL 株感染NA 细胞和未感染细胞作对照。结果显示,在RC HL 株感染NA 细胞的细胞浆膜看到温和的荧光(数据略),在重组杆状病毒感染的Sf 9细胞亦看到相同类型的荧光(图3b ),而野生型杆状病毒感染的Sf 9细胞只看462广西农业生物科学第18卷
到荧光背景(图3a )。
214 应用IFA 检测表达G 蛋白的抗原性
为了检测重组杆状病毒表达的狂犬病毒G 蛋白的抗原性,应用IFA 法检测35个单克隆抗体与表达的G 蛋白的反应性。同时用同样的方法检测这些克隆抗体与RC HL 株感染NA 细胞的反应性以作比较。结果显示,35个单克隆抗体与重组杆状病毒感染Sf 9细胞均发生反应,和RC HL 株感染NA 细胞的反应性基本相同(表1)。表明所表达的G 蛋白的抗原性与狂犬病毒RC HL 株的比较,没有发生差异。
表1 用I FA 检测重组杆状病毒表达狂犬病毒G 蛋白的抗原性Table 1 An tigen ic ity of rabies v irus G prote i n expressed by reco m bi nan t baculov irus usi ng I FA M A b IFA 反应性重组杆状病毒感染Sf 9细胞R ecom binant baculovirus infected Sf 9cells 狂犬病毒RC HL 株感染NA 细胞R abies virus RC HL strain infected NA cells 1513++++++1510++++++117++++++1325++++++1406++++++
1512++++++138++++++1324++++++1214++++++96++1330++++++121++++
1331+++++1313++++++1326++++++1222++++++
126++++125+++111++++++1310++++++118++++++133++++++136++++++123++++++1218++++++1217++++++1212++++++119++++++113++++++1502++++++
1322++++++1319++++++1318++++++
137++++++135+++ 注:-,<100;+,100～1000;++,1100～<10000;
+++≥100003 讨论
狂犬病在世界各地仍广泛分布,其免疫问
题还远没有解决。目前已开发或考虑使用的狂
犬病疫苗主要有4种。第一种为灭活的狂犬病
毒疫苗,目前这种疫苗正用于人和家畜,主要
特点是安全,但其生产价格偏高和存在一些病毒以外的成分。第二种为狂犬病弱毒活苗,多用于野生动物的口服免疫,但这种疫苗存在一定的危险性,可能会因变异而使毒力反祖。第三种为重组狂犬病疫苗,据报导以禽痘病毒和牛痘病毒为载体的重组狂犬病疫苗在欧洲已用
于野生动物的口服免疫,收到了较好的效果。第四种为亚单位苗,这种疫苗来源于病毒的有效免疫成分,如肽苗,但造价昂高。目前世界各国正根据本地的狂犬病流行情况开发有效的具有针对性的疫苗。本研究利用杆状病毒载体成功地分离出二个表达狂犬病毒G 蛋白的重组杆状病毒克隆。应用印渍法和IFA 法从重组杆状病毒感染的Sf 9细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。尽管还没有具体测定表达的G 蛋白的含量,但根据SD S
PA GE 和印渍法显示的蛋白带可推测,重组杆状病毒能有效地表达狂犬病毒的G 蛋白。在Sf 9细胞表达的G 蛋白与RC HL 株感染NA 细胞的G 蛋白的分子量一致,说明表达的G 蛋白与狂犬病毒粒子的G 蛋白之间没有显
示结构差异。应用IFA 法对表达的狂犬病毒G 蛋白的抗原性进行了测定,用RC HL 株制备的35个抗G 蛋白单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9细胞发生反应,且反应强度基本相
同。表明表达的G 蛋白的抗原性没有发生变异。同时对表达的G 蛋白的定位表明,表达的
G 蛋白主要分布在Sf 9细胞的浆膜表面,形
562第4期罗廷荣等:应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白
662广西农业生物科学第18卷
成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL株感染的NA细胞的荧光相似。
狂犬病毒G蛋白在杆状病毒表达系统的成功表达为狂犬病疫苗的开发提供了一个新途径,特别是该表达系统既能保持原蛋白的结构和抗原特性,又能在Sf9细胞上大量表达。而且重组杆状病毒既方便培养,又操作安全。已有报导,表达疱疹病毒糖蛋白的重组杆状病毒可通过口服使小鼠获得免疫力。尽管本研究还没有对重组杆状病毒表达的狂犬病毒G蛋白的免疫源性和保护效果进行检测,利用重组杆状病毒表达系统开发新的狂犬病疫苗具有重要的实践意义。
参考文献
1 B roch ier B,K ienyM P,Co sty F,et al.L arge scale eradicati on of rabies using recom binant vaccinia rabies vaccine.
N ature,1991.354:520～522
2 E spo sito J,Knigh t C J,SH addock H J,et al.Successful o ral rabies vaccinati on of raccoons w ith raccoon poxvirus recom binants exp ressing rabies virus glycop ro tein.V iro logy,1988,165:313～316
3 K ieny M P,L athe R,D rillien R,et al.Exp ressi on of rabies virus glycop ro tein from a recom binant vaccinia virus.
N ature,1984,312:163～166
4 K lepfer S R,D ebouck C,U ffel m an J.Characterizati on of rabies glycop ro tein exp ressed in yeast.A rch V iro l,1993, 128:269～286
5 L uo T R,M inamo to N,Ito H,et al.A virus neutralizing ep itope on the glycop ro tein of rabies virus that contains T rp251is a linear ep itope.V irus R esearch,1997,51:35～41
6 L uo T R,M inamo to N,H ish ida M,et al.A ntigenic and functi onal analysis of glycop ro tein of rabies virus using mono2 clonal antibodies.M icrobi o l I mm uno l,1998,42(3),187～193
7 Yelverton E,N o rton S,O bijesk i F J,et al.R abies virus glycop ro tein analogs:B i o synth sis in E scherich ia co li.Science, 1983,219:614～619
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《广西农业生物科学》
1999年12月
转思路迪博客：慢病毒载体发展
转思路迪博客：慢病毒载体发展 和“简单型”逆转录病毒载体的设计类似，对慢病毒载体的改造也是基于将其病毒基因组分成三个载体分别表达 包膜蛋白，病毒包装蛋白和外源表达载体。当使用慢病毒载体用于临床基因治疗时，有些系统甚至使用4或者5质粒系统以降低产生复制性病毒(RCR, replicative-competent retrovirus)的可能性从而增加体内使用的安全性。与“简单型”逆转录病毒不同的是，慢病毒由于存在辅助蛋白和调控蛋白，其载体改造涉及更多的对这些反式作用因子的去除以及相应的顺式作用元件的改造。第一代慢病毒载体使用三质粒系统，将包膜蛋白单独置于一个质粒中表达，包装载体含有除包膜蛋白编码基因的全病毒基因组，使用CMV启动基因表达，并用人胰岛素基因的polyA替代3’LTR作为加尾信号，同时将外源插入片段以及所有相关顺式作用元件(包装信号y，LTRs，RRE和引发结合位点(PBS, primer binding site))置于外源表达载体中。第二代慢病毒载体去除了辅助蛋白编码基因Vif，Vpr，Vpu和Nef，以减少产生RCR的风险。第三代慢病毒载体则去除了对Tat和Rev蛋白因子的依赖作用。通过将5’LTR中的U3区替换成CMV，可以消除对Tat的依赖；通过对gag-pol编码基因的密码子进行优化，可以解除对Rev的依赖。许多顺式作用元件(DNA序列)对病毒的包
装效率影响也很大，比如cPPT和来源于Igk的MAR (matrix attachment region)，以及WPRE(土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件)，其可以有效帮助mRNA的polyA加尾效率。同时通过失活3’LTR区的U3区，可以减少病毒载体整合后对宿主整合位点附近基因的表达干扰，而且还可以有助于引入诱导表达或者组织特异性表达系统。包膜蛋白表达载体：慢病毒载体改造中一个重大突破是将慢病毒自身的包膜蛋白 替换成其它病毒的包膜蛋白，尤其是VSV-G。VSV-G包膜蛋白赋予慢病毒载体三个非常重要的特性：1)，稳定慢病毒载体颗粒，使得其可以承受超离心的剪切力，因此可以进行浓缩，从而可以获得超高滴度(1011IU/ml)以用于体内实验(动物实验和基因治疗)；2)，其受体为细胞膜上的磷脂酰丝氨酸分子，因此极大拓展慢病毒载体的侵染谱系；3)，介导慢病毒载体进入胞吞途径，从而使得整个侵染整合过程减少了对慢病毒自身辅助蛋白的依赖。当然，VSV-G蛋白也有一些缺点：1)，用于动物体内实验时，有报道出现针对VSV-G蛋白的补体和抗体介导的免疫反应从而阻碍慢病毒载体的功能 发挥；2)，体内少数组织，比如气管上皮细胞的顶端面缺乏VSV-G受体，因此携有VSV-G的慢病毒载体在体内对其侵染性极低。通过使用埃博拉病毒的包膜蛋白可以解决这个问题，从而使得囊性纤维化疾病的基因治疗(其主要靶底是气管组织)成为可能。因此，显然为了进一步拓展慢病毒载体的侵
病毒载体概述
病毒载体概述 引言 基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。 然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。 然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助
GDNF及EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定
上海交通大学 硕士学位论文 GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定 姓名：陈艳春 申请学位级别：硕士 专业：耳鼻咽喉科学 指导教师：王士礼 20090101
GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的 构建及鉴定 摘要 目的构建胶质细胞源性神经营养因子和增强型绿色荧光蛋白双基因表达杆状病毒载体并检测其在体外的表达。 方法采用分子克隆技术，从pAA V－GDNF质粒酶切获得大鼠GDNF 目的基因，胶回收目的片段，连接目的基因与载体pFB－EGFP片段，通过测序明确目的基因成功克隆在载体中。利用Bac－to－Bac杆状病毒表达系统制备穿梭杆粒Bacmid，用PCR方法鉴定Bacmid，脂质体cellfectin 转染sf9细胞获取杆状病毒，空斑实验测定病毒滴度，细胞免疫荧光法测定GDNF、EGFP蛋白的表达。 结果重组质粒BamHI和SalI双酶切后琼脂糖电泳可见640bp处出现特异性条带，证明pFB－GDNF－EGFP重组质粒构建成功，测序发现基因序列完全正确。用M13引物鉴定Bacmid，产物经琼脂糖电泳见4000bp 片段，与预期结构相符；转染sf9细胞扩增后获得病毒滴度为3×1010pfu/ml, sf9中共表达GDNF和EGFP蛋白。 结论成功构建质粒pFB－GDNF-EGFP，包装杆状病毒，且获得高滴度的重组杆状病毒，且能共表达胶质细胞神经营养因子以及增强型绿色荧
光蛋白。为后续GDNF重组杆状病毒载体应用于内耳基因治疗打下基础。 关键词杆状病毒，胶质细胞源性神经营养因子，增强型绿色荧光蛋白，共表达，基因治疗
狂犬病防治手册
狂犬病防治手册 1．为何要停止生产含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗？ 研究发现，含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗较无佐剂狂犬病疫苗免疫人体后中和抗体的产生晚7天左右。狂犬病疫苗的暴露后免疫是一种应急使用，抗体的产生越早越好。因此，氢氧化铝佐剂对狂犬病的暴露后治疗十分不利。另据报道，使用了丹麦Statens血清研究所生产的氢氧化铝吸附的百白破疫苗，导致546例注射部位出现顽固性硬结性瘙痒的严重不良反应。其中77％的不良反应病例经皮肤试验确认为对氢氧化铝过敏。狂犬病疫苗中的的氢氧化铝佐剂同样可以导致不良反应增多。因此，2004年12月的人用狂犬病疫苗质量工作会议上，国家食品药品管理局已要求各生产企业在2005年6月30日前停止氢氧化铝佐剂人用狂犬病疫苗的生产。 2．为什么人用纯化狂犬病疫苗禁止臂部肌肉注射？ 因为臂部脂肪较多，疫苗注射后不易扩散，可能会影响免疫效果。因此，要求成人在上臂三角肌注射，儿童最好选择大腿前外侧区肌肉注射。 3．正在接种其它疫苗，是否可以注射狂犬病疫苗？ 正在接种其它疫苗，仍可注射狂犬病疫苗，但接种部位应远离前一种疫苗的接种部位。 4．使用疫苗的同时使用抗生素，会影响疫苗的效果？ 二者同时应用不会影响疫苗的效果。 5．年幼儿童注射疫苗为什么选择大腿前外侧？ 因为臂部肌肉脂肪较多，疫苗注射后不易扩散。上臂三角肌不发达，会影响疫苗的吸收。大腿前内侧因有大血管和神经经过，在此接种易发生危险。所以，年幼儿童应在大腿前外侧区肌肉注射，这里肌肉丰厚，易接种。
6．狂犬病病毒从感染至发病有哪些步骤？ 狂犬病病毒从感染到发病的步骤为：①病毒感染；②病毒在肌肉内复制；③病毒在神经肌肉结合处，与乙酰胆碱受体结合；④病毒通过快速轴突传递方式在周围神经的轴突内传播；⑤在脊髓的神经元与局部的周围感觉（背根）神经节内复制并快速上行到脑；⑥脑部神经元感染伴发神经功能障碍；⑦沿神经离心扩散到唾液腺、皮肤、角膜以及其他器官。 7．狂犬病病毒是如何与神经细胞相互作用的？ 狂犬病病毒与神经细胞的相互作用分四个阶段：①吸附：狂犬病病毒吸附于健康的神经细胞；②侵入：病毒被细胞吸入，进入细胞内；③复制：在细胞内，病毒迅速繁殖；④出芽：新的狂犬病病毒离开宿主细胞，吸附于其他神经细胞。然后，病毒从脑通过神经扩散到身体的其他器官。 8．狂犬病病毒的特性有哪些？ 狂犬病病毒是嗜神经性病毒，对神经组织有特殊亲和力。病毒不能穿透健康皮肤，主要通过损伤皮肤和粘膜入侵，少数由呼吸道吸入感染。病毒侵入后，沿传入神经到达中枢神经，侵害中枢神经细胞，然后再由中枢沿传出神经侵入各脏器组织，如唾液腺、眼、舌、皮肤、心脏等。因唾液腺最适狂犬病病毒繁殖，故唾液中含病毒最多，早在症状出现前14天即有病毒出现。因此唾液为主要传染源，既可通过舔咬感染人和畜，又可通过流涎污染环境，引起吸入性感染。 9．狂犬病的病原体是什么？ 狂犬病的病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒。整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA分子构成。 10．曾经注射过狂犬疫苗的人又被犬咬伤还用再打针吗？ 全程接种符合效价标准的疫苗后1年内再次被动物致伤者，应于0和3天各接种一剂疫苗；在1-3年内再次被动物致伤，且已进行过上述处置者，应于0、3、7天各接种一剂疫苗；超过3年者应接种全程疫苗。此外，对暴露前后所用的疫苗效价无法证实者及免疫回忆应答无法确认者仍应进行全程免疫。
杆状病毒表达系统简介
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。 1、杆状病毒的生物学特性 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用： ①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。 ②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。 昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。 近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae 的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。 杆状病毒基因组的结构和功能研究 杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法 摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。 关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法 狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。 据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。 1、狂犬病病毒形态特征 RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白
病毒有关知识点复习总结
高中生物病毒有关知识点归纳 病毒是一类非细胞结构的生物。由于它的结构与高等动植物及其他生物完全不同，所以生物学家在分类时将它作为特殊的一类，单独列为病毒界。在高中生物学以及高考中也经常涉及有关病毒的知识点及考点。 一、大小 发现史：19世纪,伊万诺夫斯基在研究烟草花叶病的病因时，推想这种病是由细菌引起的。他将患花叶病的烟草榨出汁液，用能将细菌滤去的过滤器进行过滤，再用过滤后的汁液去感染正常的烟叶，结果发现正常的烟叶还能患病。 发现问题： 提出假说： 设计实验：（加法、减法） 得出结论：这表明烟草花叶病是由比细菌还小的病原体引起的，他把这种病原体叫做"滤过性病毒"。 病毒形体极其微小，必须在电子显微镜下才能观察到，一般可以通过细菌滤器(一般的直径为1-10μm，而多数病毒的直径在100 nm左右)。 二、成分和结构 1、成分 病毒没有细胞结构，主要成分仅为核酸和蛋白质两种。核酸位于病毒粒子的中心，构成了它的核心或基因组，蛋白质包围在核心周围，构成病毒粒子的衣壳。衣壳对核酸有保护作用，是病毒粒子的抗原成分。它们共同称为核衣壳，是任何病毒(指“真病毒”)所必需的基本结构。有些较复杂的病毒，在其核衣壳外还有一层囊膜包被。 2、结构 衣壳：蛋白质 髓部：DNA或RNA 特殊包膜 刺突 每一种病毒只含有一种核酸，不是DNA就是RNA，这也是病毒分类的依据之一。如DNA病毒有：噬菌体、疱疹病毒、各种腺病毒等。RNA病毒有：艾滋病毒、烟草花叶病毒、车前草病毒等。 三、生活方式 1、生活方式 病毒在宿主的活细胞内寄生生活。离开宿主细胞，病毒能以无生命的化学大分子状态存在，并可形成结晶 不同的病毒只能寄生在特定的宿主细胞内，具有专一性，这也是病毒分类的另一个重要依据。如专门寄生在动物细胞中的称为动物病毒(艾滋病毒等)，专门寄生在植物细胞中的称为植物病毒(烟草花叶病毒等)，专门寄生在细菌细胞中的称为细菌病毒(噬菌体)。 噬菌体的繁殖一般可分为五个阶段：即吸附一侵入→增殖(复制与生物合成)→成熟(装配)→裂解(释放)。整个过程必须在它的宿主活细胞中完成。 只有核酸进入宿主细胞，换言之，只提供了复制和表达的模板，其他的原料、能量、酶、
杆状病毒介绍
杆状病毒 关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式： 一种为包含体病毒(occluded virus，OV)， 另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。 它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 摘要 本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。 说明 定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 技术领域 [0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。背景技术 [0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白； [2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。 [0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量(TCID5tl)来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[DulbeccoR.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles ofanimal virus.Proc Nat Acad Scil952; 38 (8): 747-752], Hink 和Vial 后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。
狂犬病题目及答案完整版
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狂犬病暴露处置技术培训试题 姓名：单位：分数： 一.填空题（每题4分，共20分） 1.狂犬病是由感染人体引起的一种传染病，发病后病死率达。 2.狂犬病病毒是一种侵犯中枢神经系统,引起____和____狂犬病的病原体. 3.人被犬、猫等宿主动物咬、抓伤后，凡不能确定伤人动物为健康动物的，应立即进行受伤部位的彻底清洗和消毒处理。用或彻底冲洗伤口至少分钟。彻底冲洗后用涂擦伤口。 4.狂犬疫苗接种程序为：、、、、天各注射一支狂犬疫苗，成人、儿童用量。婴幼儿可在大腿前外侧肌肉内注射。禁止注射。对于Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露，接种疫苗的同时要在伤口周围浸润注射或。二．单选题（每题5分，共50分） 1.关于狂犬病病毒不正确的描述是（） A.狂犬病毒为弹状病毒科 B.狂犬病毒是非嗜神经性病毒 C.不会引起化脓性脑炎 D.在中枢神经细胞胞浆内形成内基小体(NegriBodies) E.病毒对外界抵抗力不强,56℃30分钟即可杀灭 2.Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露,最正确的处理措施是（）
A.注射狂犬病毒免疫血清＋抗病毒药物 B.注射大剂量丙种球蛋白＋抗病毒药物 C.清创＋抗生素 D.清创＋注射狂犬病被动免疫制剂＋接种疫苗 E.清创＋注射狂犬病毒免疫血清 3.狂犬病标本采集叙述正确的是（） A.从事标本采集和运送的工作人员均要进行暴露前免疫 B.在狂犬病病人入院后，尽可能早期采集标本 C.用于病原学检测的标本，以脑组织阳性率最高 D.A＋B＋C E.B＋C. 4.狂犬病病毒最不可能感染的动物是（） A.狗 B.猫 C.蝙蝠 D.家禽 5.暴露前的免疫程序是（） A. 0、7、21 天各 1 剂的程序 B. 0、3、7、14 和28天各接种 1 剂 C. 0天两剂，7、21 天各1剂的程序 D.直接注射免疫球蛋白 6.狂犬病临床表现有：（） A.有怕水、怕光、怕声的“三怕”症状
慢病毒包装体系使用说明
慢病毒包装体系使用说明 本说明书适用于以下产品： 名称货号 慢病毒包装体系KLV3501 慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502 慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503 慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504 北京英茂盛业生物科技有限公司 Web site：https://www.wendangku.net/doc/b07321054.html,
1 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.wendangku.net/doc/b07321054.html,/ 产品内容 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504 慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3 3 3 3 辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂 3 3 载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。 慢病毒载体 慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网站https://www.wendangku.net/doc/b07321054.html, 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体 慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：
HEK293V细胞 包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。 Polyfect‐V转染试剂 Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。 3 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.wendangku.net/doc/b07321054.html,/
杆状病毒表达系统00000001
昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白 ●杆状病毒表达系统介绍 ●杆状病毒蛋白表达系统的优势 ●杆状病毒表达载体系统（BEVS） ●杆状病毒表达宿主细胞 ●表达优化条件 ●翻译后修饰对蛋白表达的影响 ●高通量表达 ●总结
杆状病毒介绍 1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状 DNA病毒。 2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态： 一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另 一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。 3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。 4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。 5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。 6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期 ●早期（0‐6h PI） ?核衣壳迁移到细胞核 ?病毒DNA释放 ?开始早期基因表达 ●晚期（6‐24h PI） ?更多DNA复制 ?新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质 ?的过程中得到囊膜蛋白 ?产生新的出芽病毒 ●极晚期 Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia ?出芽病毒减少 ?核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs ?MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形 成包含体病毒。 多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
杆状病毒表达系统及其应用进展
综述与专论 生物技术通报 BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2010年第10期 杆状病毒表达系统及其应用进展 韦永龙 李轶女 张志芳 沈桂芳 (中国农业科学院生物技术研究所,北京100081) 摘 要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。 关键词: 杆状病毒 BEVS 表达 Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste m W ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng (B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081) Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce be i ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e . K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on 收稿日期:2010 04 26 基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863?计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n 杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约 80-160kb 之间。杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,目前已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目[1] 。根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状病毒分为核多角体病毒属(nucleopolyhedr ovirus ,NP V ) 和颗粒体病毒属(g r anulov ir us ,GV )[2] 。杆状病毒表达系统(baculov ir us e xpression vector syste m,BE VS )是一个利用杆状病毒作为载体,在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。具有安全性高,真核修饰环境,容量大,表达量高等特点,自Sm it h GE 等于1983年利用A c NPV 成功表达外源蛋白以来,经过不到30年的发展,杆状病毒表达系统已经成为当今基因工 程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物 细胞表达系统)之一。 杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移载体上,此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子下游之后,与杆状病毒重组,获得重组病毒,将重组病毒纯化,感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着病毒的复制的而获得表达。 1 重组杆状病毒的构建和纯化 最早的重组病毒构建使用的是野生病毒,当病毒与转移载体发生重组之后,病毒的多角体蛋白基因受到破坏,不能形成多角体,感染这种重组毒株的
狂犬病毒的作用原理
狂犬病毒的作用原理？是对人的神经起作用还是？ 狂犬病（rabies）又称恐水症（hydrophobia），为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。多见于狗、狼、猫等食肉动物。人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命。 [病原学] 狂犬病病毒属核糖核酸型弹状病毒。狂犬病毒具有两种主要抗原。一种为病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体。中和抗体具有保护作用。另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。从患者和病兽体内所分离的病毒，称自然病毒或街毒（stree virus），其特点是毒力强，但经多次通过兔脑后成为因定毒（fixed virus），毒力降低，可制做疫苗。 狂犬病毒易被紫外线、甲醛、50～70%乙醇、升汞和季胺类化合物（新洁尔灭）等灭活。其悬液经56℃30～60分钟或100℃2分钟即失去活力，对酚有高度抵抗力。在冰冻干燥下可保存数年。 [流行病学] 狂犬病在世界很多国家均有发生。我国解放后由于采取各种预防措施，发病率明显下降。近年因养狗逐渐增多，故发病率有上升的趋势。 （一）传染源发展中国家的狂犬病主要传染源是病犬，人狂犬病由病犬传播者约占80～90%，其次为猫和狼，发达国家由于狗狂犬病被控制，野生动物如狐猩、食血蝙蝠、臭鼬和浣熊等逐渐成为重要传染源。患病动物唾液中含有多量的病毒，于发病前数日即具有传染性。隐性感染的犬、猫等兽类亦有传染性。 （二）传播途径主要通过被患病动物咬伤、抓伤，病毒自皮肤损伤处进入人体。粘膜也是病毒的重要侵入门户，如眼结合膜被病兽唾液沾污，肛门粘膜被狗触舔等，均可引起发病。此外，亦有经呼吸道及消化道感染的报道。 （三）传播途径人对狂犬病普遍易感，兽医、动物饲养者与猎手尤易遭感染。一般男性多于女性。冬季发病率低于其他季节。 [发病机理与病理变化] 狂犬病病毒对神经组织有很强的亲和力。发病原理分为三个阶段：①局部组织内小量繁殖期。病毒自咬伤部位入侵后，在伤口附近横纹细胞内缓慢繁殖，约4～6日内侵入周围神经，此时病人无任何自觉症状。②从周围神经侵入中枢神经期。病毒沿周围传入神经迅速上行到达背根神经节后，大量繁殖，然后侵入脊髓和中枢神经系统，主要侵犯脑干及小脑等处的神经元。但亦可在扩散过程中终止于某部位，形成特殊的临床表现。③向各器官扩散期。病毒自中枢神经系统再沿传出神经侵入各组织与器官，如眼、舌、唾液腺、皮肤、心脏、肾上腺髓质等。由于迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核受损，可以发生呼吸肌、吞咽肌痉挛。临床上出现恐水、呼吸困难、吞咽困难等症状。交感神经受刺激，使唾液分泌和出汗增多。迷走神经节、交感神经节和心脏神经节受损时，可发生心血管系统功能紊乱或猝死。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。