几丁质的合成酶抑制剂
1. 几丁质(chitin) ,又称甲壳质,甲壳素[1], 是由β2(1 ,4)连接的N2乙酰氨基葡萄糖,是自然界中一种天然生物多糖,含量仅次于维生素2]。几丁质的生物合成需要多种酶的参与,是一个极其复杂的生理和生化过程。几丁质在自然界中有3 种晶形:α2几丁质和β2几丁质、2几丁质[3]。
2.几丁质合成酶
几丁质合成酶(chitin synthase ,CS) 是一种膜结合的糖苷转化酶,在它的作用下,几丁质前体物尿苷二磷酸酯2N2乙酰氨基葡萄糖(UDP2GlcNAc) 生物合成几丁质(图1).。
3 几丁质合成酶抑制剂对几丁质合成酶抑制剂的研究始于多氧霉素(polyoxins)及尼克霉素(nikkomycins) 的发现。
醛固酮
醛固酮 简介 是人体内调节血容量的激素，通过调节肾脏对钠的重吸收，维持水平衡。醛固酮是调节细胞外液容量和电解质的激素，醛固酮的分泌，是通过肾素一血管紧张素系统实现的。当细胞外液容量下降时，刺激肾小球旁细胞分泌肾素，激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统、醛固酮分泌增加，使肾脏重吸收钠增加，进而引起水重吸收增加，细胞外液容量增多；相反细胞外液容量增多时，通过上述相反的机制，使醛固酮分泌减少，肾重吸收钠水减少，细胞外液容量下降。血钠降低，血钾升高同样刺激肾上腺皮质，使醛固酮分泌增加。 原理 醛固酮进入远曲小管和集合管上皮细胞后，与胞浆内受体结合，形成激素-受体复合体，后者通过核膜，与核中DNA特异性结合位点相互作用，调节特异性mRNA转录，最终合成多种醛固酮诱导蛋白，进而使关腔膜对Na+的通透性增大，线粒体内ATP合成和管周膜上钠泵的活动性增加。从而导致对Na+的重吸收增强，对水的重吸收增加，K+的排出量增加。 醛固酮的分泌与血压的关系 醛固酮的分泌主要受肾素—血管紧张素调节，即肾的球旁细胞感受血压下降和钠量减少的刺激，分泌肾素增多，肾素作用于血管紧张素原，生成血管紧张素。血管紧张素可刺激肾上腺皮质球状带合成和分泌醛固酮。当循环血量减少时，醛固酮的分泌量会增加，使钠和水的重吸收增强，以此维持水盐代谢的平衡。 醛固酮aldosterone C21H28O5。11β，21-二羟-3．20-二氧-4-孕烯-18-醛（11→18）乳醛（Ⅰ）。是肾上腺皮质激素的一种。具有代表性的强电解质代谢作用的盐皮质类固醇。其作用是促进Na+在体内贮留，同时排出K+。是由肾上腺皮质球状带生成，并受肾脏分泌的血管紧张肽原酶，即血管紧张肽（renin即angiotensin）的调节。另也有11β-羟-18-醛型（Ⅱ）。 螺内酯 其受体拮抗剂是螺内酯，又称安体舒通，与醛固酮竞争结合人体内相应的受体，为保钾利尿剂，螺内酯的降压作用也是源于此。 螺内酯 一、药品简介 通用名:螺内酯片 别名：安体舒通 商品名: 英文名:Spironolactone Tablets 汉语拼音:Luoneizhi Pian 本品主要成分及其化学名称为:
酶反应与酶抑制剂之间关联度
酶反应与酶抑制剂关系 2．1 酶反应 酶是生物体内化学反应的催化剂，象细菌这样简单的生物，细胞内大约有3000种酶，分别催化3000种不同化学变化。 在生命活动中，有时在瞬间要消耗巨大能量。动物在原野奔腾追逐，禽鸟在高空展翅翱翔，伴随着肌肉迅速收缩，需要代谢反应迅速进行，将储存的能量高速释放，酶在这里起提高反应速率的催化作用。如果没有酶的帮助，我们一次进餐得化上50年的时间才能消化完毕，而在酶的帮助下，要不了几个小时，肚子又饿了。糖或脂肪氧化会产生能量，把糖或脂肪放在空气里燃烧，氧化作用很快完成，热量一下释放出来。这样的反应如果在体内进行，放热产生高温，会损伤机体。因此，在生命活动中，氧化作用必须缓慢进行，以便最有效地利用能量；同时热量必须温和地放出，以便长期保持一定的体温。所以代谢分解必须和燃烧有所不同，代谢分解每步反应由不同的酶催化。我们摄取食物后消化，由一系列酶催化分解，酶由体内各个部分分泌。唾液和胰腺分泌淀粉酶，化解淀粉；胃分泌蛋白酶；肠分泌蛋白酶和糜蛋白酶，水解蛋白质。肠还释放脂酶，。，于是食物从大分子分级分解成小分子。当食物变成单糖，氨基酸，脂酸后，便在肠壁吸收，渗入到血流，运输到各种组织。 当食物代谢分解释放的能量有盈余时，酶的催化作用又促使产生一些化学物质，把能量暂时储存起来，而当需用时，又可迅速释出。例如三磷酸腺苷（ATP ）即为能量储存物质，分子内有3个磷酸基，在分解而裂去一个磷酸基时，可释出33千焦能量，变为二磷酸腺苷（ADP ）。同样，二磷酸腺苷再水解，脱去一个磷酸基，变成单磷酸腺苷，又可释出33千焦能量，但单磷酸腺苷再水解脱去最后一个磷酸基时，只释出12.5千焦能量。 2.2 青霉素 许多药物的作用机理，在于抑制酶的催化作用，从而干扰生命活动。这种药物的结构，可能与酶反应的底物的结构相似。青霉素和头孢菌素的抑制细菌作用，是由于干扰细菌合成细胞壁。细菌依赖着细胞壁保护其细胞，细胞壁由一些多糖链和多肽链交织而成。在交织构成过程中，一条包括由D －丙氨酰－D －丙氨酸二肽的链加到一条有几个甘氨酸组成的肽链上，这加成反应由转肽酶与羧肽酶所催化。青霉素和头孢菌素的构象和D －丙氨酰－D －丙氨酸的构象十分相象，因之青霉素正好适应D －丙氨酰－D －丙氨酸在酶上的作用部位。而药物与酶分子作用部位的结合，意味着占有这部位而排斥了丙氨酸二肽的结合，这样就干扰了肽链的交织，从而阻止了细胞壁的构成，于是危及细菌的生长。这作用称为代谢拮抗（Biological antagonism ），丙氨酸肽链是代谢物，青霉素是拮抗物。拮抗物（ Antaganist ）与代谢物（Metabilite ）间存在一定构象关系。青霉素和头孢菌素的半合成类似物中，也存在类似构效关系，只有构象与前述青霉素或D －丙氨酰－D －丙氨酸相似的，才有抑菌作用。 S CH 3 CH 3N CO COOH CONH R C H 3N H COOH CO NH 2CH 3 A －P －P －P+H2O P －OH+33Kg A －P －P+H2O A －P A －P++P －OH P －OH +33Kg H2O +12.5Kg A++A －P －P
昆虫几丁质酶及其在植物保护中的应用
吴青君 女 岁 现在中国农业大学应用化学系攻读博士学位 主要从事农药学和昆虫毒理学研究?通讯地址 北京海淀区白石桥路 号 中国农业科学院蔬菜花卉研究所植保室?收稿日期 2 2 昆虫几丁质酶及其在植物保护中的应用 吴青君 张文吉 中国农业大学应用化学系 北京 张友军 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京 Ινσεχτχηιτινασεανδιτσποτεντιαλυσεινπλαντπροτεχτιον ? ± 2 ∏ ? 2 ?επαρτμεντοφΑππλιεδΧηεμιστρψ ΧηιναΑγριχυλτυραλΥνι?ερσιτψ ≤ ≠ ∏2 ∏ Ινστι2τυτεοφ?εγεταβλεσανδΦλοωερσ ΧηινεσεΑχαδεμψοφΑγριχυλτυραλΣχιενχεσ ≤ Αβστραχτ × ∏ 2 ∏ ∏ √ Κεψωορδσ ∏ 摘 要 本文从生理学!生物化学和分子生物学 个方面综述了昆虫几丁质酶的研究进展 并概述了它在害虫防治!主要是在抗虫育种中作为重要的基因源中的应用?关键词 几丁质 昆虫几丁质酶 植物保护 应用
几丁质是由 )乙酰葡萄胺通过Β) 键连接起来的直链多聚物 是自然界中含量最丰富的多糖之一 在昆虫的外骨骼和肠道内壁 真菌和一些藻类的细胞壁及甲壳动物的外壳中均发现它的存在?催化水解几丁质的水解酶广泛地存在于含几丁质的有机体及不含几丁质的生物 如微生物!高等植物和动物中?不同生物源的几丁质酶具有不同的生物功能 昆虫和甲壳动物的几丁质酶主要作用是蜕去外骨骼 真菌几丁质酶负责细胞的生长和分裂 细菌几丁质酶则分解几丁质提供营养源 而植物几丁质酶主要用于防御害虫和病菌的侵袭 增加植物的抗逆能力? 植物在逆境胁迫下体内几丁质酶的含量迅速升高 植物几丁质酶的诱导及防卫反应机制的研究是目前分子生物学研究的热点之一?大量的植物几丁质酶基因或 ? 被克隆 某些基因已被成功地导入植物中 成为抗病育种中的重要基因源?几丁质是昆虫表皮独特的组份 昆虫蜕皮时约有 的几丁质被降解≈ 因此 昆虫几丁质及其水解酶对昆虫的生长!发育起重要的作用 人们对它的重视也由来已久 但在总体研究水平上要落后于植物几丁质酶?进入 年代后 由于相关知识和精密技术不断被引入昆虫学领域 人们对昆虫几丁质酶的物理学!化学!动力学和基因调控特点 以及作为生物农药的发展潜力≈ 主要是在植物抗虫性方面的研究正在不断地探索 并取得了实质性进展?本文将综述该领域有关方面的主要研究进展? 1昆虫几丁质酶的生理学功能 昆虫的蜕皮和变态机制一直是昆虫生理学家研究的重点 早在 年 的一篇专题论文中有关家蚕Βομβψξμορι解剖学问题中就首次描述过蜕皮液 但人们对蜕皮液的功能认识很模糊 甚至有观点认为它主要用于贮存和释放营养物质≈ ?直到进入 世纪后才逐渐明确蜕皮液的功能是昆虫在蜕皮前用于消化旧的表皮? 昆虫周期性地蜕去旧表皮并合成新表皮 这一复杂的过程是由旧表皮和表皮层之间累积的蜕皮液中几丁质酶的精确滴度调节的 需要多种类型酶的参与 每种酶又具有多种异构形式?现已明确的有两种类型的几丁质水解酶?将从内部裂解 ≤多聚链的酶被称作几丁质酶 ∞≤ 从链的非还原性末端依次切下 ≤单体的酶为Β) )乙酰葡萄胺酶 ∞≤ ? ∏ 和 ≈ ? 以烟草天蛾Μανδυχασεξτα为模式昆虫 建立的二元酶系统模型较合理地解释了几丁质的水解机制?首先 不溶性的几丁质被几丁质酶随机裂解为寡糖 这些可溶性的寡糖即成为Β) )乙酰葡萄胺酶的底物 从链末端依次切下几丁质二糖 释放出 ≤ 2 ≤最终又被循环利用参与新表皮的形成?同时研究发现 这两种酶在分解几丁质中还具有较强的增效活性?几丁质酶和Β) )乙酰葡萄胺酶以适宜比例混合 分解几丁质的速度是二者单独作用速度总和的 倍? 除昆虫表皮外 在其肠道组织中也检测到几丁质酶的活性?肠道几丁质酶具有分解肠道内和围食膜中的几丁质及消化的功能?昆虫蜕皮过程完成后 肠道几丁质酶能够将蜕皮消化参与合成新的围食膜≈ ? 昆虫蜕皮机制问题的解决 促进了昆虫蜕皮液的生理学和生物化学的发展 其中最主要的几丁质酶和Β) )乙酰葡萄胺酶已被分离纯化 得到 ? 克隆 并有可能用于植物抗虫性的转基因育种研究中? 2昆虫几丁质酶的基因结构及表达 2 1昆虫几丁质酶基因的结构 昆虫几丁质酶基因的研究最早见于烟草天蛾? 年 等≈ 分离得到编码烟草天蛾几丁质酶基因的全长 ? 克隆 并进行了序列分析? 由 个核苷酸组成 可译框架含 个核苷酸 起始密码子 × 在 位 终止于 位 所编码的蛋白为 个氨基酸残基 分子量为 ??其 χ)端非翻译区含有 个核苷酸 # # 昆虫知识∞ × ≤ ? ∞? ∞
醛固酮增多症
醛固酮增多症
醛固酮增多症 醛固酮(aldosterone)是肾上腺皮质球状带分泌的最重要的盐皮激素，在维持机体钠平衡中起着十分重要的作用。醛固酮分泌过多导致钠潴留和钾丢失，称为醛固酮增多症(hyperaldosteronism，aldosteronism)，分为原发性和继发性两类。若因肾上腺以外的原因使有效血容量降低，肾血流量减少等引起肾素-血管紧张素-醛固酮系统功能亢进者，则称为继发性醛固酮增多症(简称继醛)；而由于肾上腺皮质腺瘤或增生，分泌过多的醛固酮，导致水钠潴留，体液容量扩增导致血压升高并抑制肾素-血管紧张素系统者，称为原发性醛固酮症增多症(简称原醛)。本章主要讨论原发性醛固酮增多症。1955年，ConnJW报道了第一例由肾上腺腺瘤所引起的原发性醛固酮增多症，故本症又称为Conn综合征。本病的发病率在未经选择的高血压患者中＜1％。多见于成人，腺瘤者女性较男性多见，特发性等其他病因者男性多于女性。各种年龄儿童也可发生原醛，并可出现生长迟缓，病因为腺瘤者其年龄通常低于特发性者。 【病因】 多种原因可致原发性醛固酮增多症，其临床类型与相对发病率见下表。 1．分泌醛固酮的肾上腺皮质腺瘤分泌醛固酮的肾上腺皮质腺瘤 (aldosterone-producingadenoma，APA)又称Conn综合征，最多见，约占原醛症的60％～90％。多为单侧腺瘤，左侧较右侧多见；大多数为单个，直径多在2cm以下，包膜完整，切面呈金黄色，在光镜下可见四种细胞：小和大的具有球状带和束状带细胞特征的杂交细胞以及其他的如同束、球状带的细胞，在电镜下，瘤细胞具有如同球状带细胞特征的线粒体管状嵴，若经螺内酯治疗后可发现螺内酯小体，常同时伴球状带增生或伴结节性增生。仅1％左右为双侧或一侧有2个以上腺瘤。70％的腺瘤见于女性，腺瘤形成的原因至今不明。 2．特发性原醛症(IHA)本型的肾上腺球状带通常为弥漫性或局灶性增生，超微结构基本正常，若伴有结节则多为微小结节，直径不一，可大致2cm，典型的细胞呈现来自束状带的透明样细胞。免疫组化研究表明：这些细胞均显示对细胞
昆虫的体壁和几丁质酶
几丁质酶 几丁质酶是以几丁质为作用底物的水解酶。在昆虫中，几丁质是围食膜及体壁的主要组成成分之一，通过几丁质酶对其有规律地降解以保证昆虫正常生长发育。若编码该酶的基因在不适当的时候表达或该表达时未表达，都会对昆虫造成伤害。在植物害虫防治中，昆虫几丁质是几丁质酶的一个极具吸引力的作用靶标。 1.1昆虫几丁质酶生物化学与生理作用 昆虫几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫的毒腺中，是一种糖蛋白,可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质，酶切位点通常随机发生在链中间的任何一个部位，其最终产物是可溶低分子量的GlcNAC寡聚物。昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解，几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态过程，包括经过几丁质结合区的吸附过程、水解过程、解吸附作用及活性催化区在作用底物表面的配置过程。昆虫几丁质酶分泌到肠道中,以无活性酶原形式存在，在需要时被胰蛋白酶激活而降解围食膜。蜕皮腺中的几丁质酶可调节昆虫的周期性蜕皮并合成新表皮。毒腺中的几丁质酶有助于毒腺物质在取食对象的组织中扩散渗透。 1.2昆虫几丁质酶基因的体内表达 昆虫几丁质酶的表达受蜕皮激素的诱导，而保幼激素抑制其表达。有研究表明，在没有几丁质酶基因表达的虫期,蜕皮激素类似物能够诱导云杉卷叶蛾几丁质酶基因的表达，在诱导36h后表达量最大，且几丁质酶基因仅在体壁表达，这种现象可能是因为诱导表达是一种间接表达，需要某些只在体壁才具有的因子参与。在昆虫生长发育过程中，几丁质酶表达具有组织特异性。 影响昆虫几丁质酶活性因素主要有温度、pH、紫外线等因子均可影响昆虫几丁质酶的活性。昆虫几丁质酶pH范围较宽，使其能在微酸(血淋巴)和微碱性环境(内脏)中起作用。昆虫几丁质酶在pH为4~8范围内具有活性，在30~60℃之间昆虫几丁质酶活性较高且较久。底物不同时，昆虫几丁质酶表达的适宜pH、温度也不尽相同。pH值对昆虫几丁质酶活性的影响，可能是因为昆虫几丁质酶在多区结构及氨基酸序列方面的不同造成的。某些二价阳离子也影响昆虫几丁质酶的活性。 对昆虫几丁质酶的利用，包括使昆虫体内的几丁质酶水平低于或高于正常水平两个方面，从而扰乱昆虫正常的生长发育节律，甚至使昆虫死亡。Blattner-R
产几丁质酶的筛选及活力测定
产几丁质酶的筛选及活力测定 一、实验材料 1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等(菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH 培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。) 2.试剂：DNS试剂:（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。，搅拌5 s，水浴至45。然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7 d后可以使用。) 几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。 几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。（胶体几丁质固体培养基。0.5 g K2HPO4，0.5 gKH2PO4，0.5 g MgSO4·H2O，0.1 g FeSO4·7H2O，0.1 gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml蒸馏水，15 g 琼脂，pH7.2，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板） 马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
苏云金杆菌几丁质酶新基因的筛选和全长基因的扩增
苏云金杆菌几丁质酶新基因的筛选和全长基因的扩增林毅1,关雄 23 (1.华侨大学生物工程与技术系,福建泉州362011;2.福建农林大学生物农药研究中心,福建福州350002) 摘要:以煮沸冻融法制备PCR 扩增模板,利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,Bt )几丁质酶基因特异引物进行15个Bt 血清变种的扩增分析,获得9个几丁质酶全长基因扩增产物。经克隆和序列测定,从Bt serovar.entomocidus H D109、Bt serovar.canadensis H D224、Bt serovar.alesti H D16和Bt serovar.toumano ffi H D201等4个菌株中分离了几丁质酶新基因。 关键词:几丁质酶基因;苏云金芽孢杆菌;筛选;血清变种 中图分类号:S482.292 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2004)03-0001-02 Screening and Full -length Amplification of N ovel Chitinase G enes from 15Serovars of Bacillus thuringiensis LI N Y i 1,G UAN X iong 23 (1.Departm ent o f Biotechn ology ,H uaqia o University ,Quanzh ou 362011;2.Biocide R esearch C enter ,Fujian Agriculture and F orestry University ,Fuzh ou 350002,P 1R 1C hina ) Abstract :Using boiling and thawing the thalli to prepare PCR tem plate ,the distribution of chitinase genes am ong the 15serovars of Bacillus thuringiensis were detected by specific primers.And 4novel full -length chitinase genes were is olated from Bt serovar .entomocidus H D109,Bt serovar.canadensis H D224,Bt serovar.alesti H D16,and Bt serovar.toumano ffi H D201.K ey w ords :chitinase gene ;Bacillus thuringiensis ;screening ;serovar 收稿日期:2003-10-18;修回日期:2003-12-27基金项目:国家“863”项目(2002A A245011);福建省重大项目(2002N004,2001Z 026);福建省青年科技人才创新项目(2003J024) 作者简介:林毅(1976-),男,博士,讲师,从事资源生物及其基因工程研究,E -mail :lyhxm @https://www.wendangku.net/doc/b8932777.html, ;联系作者:关雄(1957-),男,博士,教授,从事生物农药研究,E -mail :gx @https://www.wendangku.net/doc/b8932777.html, 。 几丁质广泛存在于甲壳纲动物、软体动物、昆虫、真菌、高等植物以及海藻、动物关节、蹄、足等处,自然界每年生成的几丁质约有100亿吨,是地球上除纤维素外数量最多、除蛋白质外含氮量最高的天然有机化合物[1,2] 。近年来,随着几丁低聚 糖、几丁寡糖等抗菌作用、抗肿瘤和增强机体免疫功能研究的 深入,几丁质酶(EC31211114)作为制备几丁质低聚糖的重要工 具而受到相当的关注[2]。同时,几丁质酶在作物病虫害防治 方面的作用也陆续见诸报道[3]。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,Bt )是一种重要的 环境微生物,广泛应用于农业和卫生害虫的防治,其作用因子 主要是杀虫晶体蛋白[4]。几丁质酶往往作为添加剂,以缓解 害虫对Bt 杀虫晶体蛋白的抗性[5]。近年来,苏云金芽孢杆菌 自身的几丁质酶及其编码基因受到格外重视[6-9]。 本文通过苏云金芽孢杆菌不同血清变种的几丁质酶全长 基因的扩增分析,旨在快速获得Bt 几丁质酶新基因,促进Bt 的研究和应用。 图1 苏云金芽孢杆菌全长几丁质酶基因的扩增产物 Lane M:λDNA d ouble digested by EcoR Ⅰand Hind Ⅲ;Lane 1:Bt serovar.entomocidus H D109;Lane 2:Bt serovar.pakistani H D395;Lane 3:Bt serovar.dakota H D511;Lane 4:Bt serovar.kenyae H D560; Lane 5:Bt serovar.canadensis H D224;Lane 6:Bt serovar.alesti H D16; Lane 7:Bt serovar.israelensis ONR60A ;Lane 8:Bt serovar.galleriae H D161 1 材料和方法1.1 菌株和载体 15个苏云金芽孢杆菌血清变种的菌株来自美国芽孢杆菌遗传保藏中心(Bacillus G enetic S tock Center ,BG SC ),分别是:Bt serovar.finitimus H D19,B t serovar.alesti H D16,Bt serovar.kur staki 2,Bt serovar.kenyae H D560,Bt serovar.galleriae H D161,Bt serovar.canadensis H D224,Bt serovar.entomocidus H D109、Bt serovar.aizawai H D11,Bt serovar.tolworthi H D537,Bt serovar. toumano ffi H D201,Bt serovar.thompsoni H D542,Bt serovar.pak 2 istani H D395,Bt serovar.israelensis ONR60A ,Bt serovar.dakota H D511,Bt serovar.indiana H D521。 大肠杆菌DH5 α菌株来自福建农林大学植物病毒研究所。1.2 引物根据NC BI 中收录的Bt 几丁质酶基因序列设计合成一对特异引物chi -A 和chi -B ,扩增产物为全长的几丁质酶基因,大小为2.0～2.1kb 。序列如下: chi -A :5’-ATGG T C ATG AGG T CT C -3’chi -B :5’-CT ATTT CG CT AATG ACG-3’1.3 载体和试剂克隆载体pM D18-T (约2.7kb )购自大连宝生物。T aq DNA 聚合酶和DNA 限制性内切酶为大连宝生物产品,PCR 产物回收试剂盒Ultraclean T M 15DNA Purification K it 购自上海博亚,其它试剂均为分析纯。1.4 模板的制备采用煮沸冻融裂解法制备PCR 模板。取50μL 对数生长期Bt 菌液,离心收集菌体,加入100μL 超纯水,涡旋使菌体均 匀扩散,于沸水中煮5min ,-20℃冻3min ,沸水中再煮5min , -20℃再冻3min ,12000r/min 离心3min ,所得上清即可作为 PCR 模板。 1.5 PCR 扩增和分析 以制备的菌体裂解液上清为模板,在T 3Therm ocycler (Biometra R )基因扩增仪上进行PCR 扩增,反应程序为:94℃变性60s ,55～50℃退火60s (每3个循环降1℃,50℃时20个循环),72℃延伸2min 。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳,E B 染色后经凝胶成像系统成像。1.6 大肠杆菌感受态细胞的简易制备 收集对数生长期的大肠杆菌DH5 α菌体,加入预冷的0.1M CaCl 2溶液悬浮,离心20s ,加入适量预冷的0.1M CaCl 2溶液悬浮,4℃保存备用,10h 后7d 内可用。1.7 克隆和序列测定PCR 产物回收纯化后,与pM D18-T 载体连接,转化 E.coli DH5α,酶切鉴定后进行序列测定,先各测定一个反应。序列分析利用NC BI 上的BLAST 软件进行T ranslated query vs.pro 2 tein database (blastx )分析。2 结果 表1 15个苏云金芽孢杆菌血清变种的几丁质酶基因检测结果Bt serovar S train Presence of chitinase gene indiana HD521-finitimus HD19-entomocidus HD109+ pakistani HD395+kenyae HD560+tolworthi HD537-canadensis HD224+dakota HD511-aizawa HD11+ alesti HD16+thompsoni HD542-israelensis ONR60A +kur staki 2+toumano ffi HD201+galleriae HD161- 对15个血清变种的苏云金芽孢杆菌菌体裂解液进行的PCR
醛固酮缺乏症
疾病名：醛固酮缺乏症 英文名：aldosterone deficiency 缩写： 别名：hypoaldosteronism；低醛固酮血症；醛固酮减少症；醛固酮缺乏 ICD号：E34.8 分类：内分泌科 概述：醛固酮缺乏症(aldosterone deficiency)又称为低醛固酮血症(hypoaldosteronism)，是由于醛固酮(aldosterone，ALD)分泌减少或者外周作用缺陷所致的一种内分泌疾病。临床上以高血钾、低钠血症、低血容量、体位性低血压和尿盐丢失为主要表现。醛固酮缺乏可能是全肾上腺皮质功能减退症的表现之一，也可能是单纯的选择性醛固酮缺乏。前者包括Addison病、先天性肾上腺皮质增生症、慢性垂体功能减退症、感染、出血或转移瘤破坏肾上腺，手术切除肾上腺后等；后者指醛固酮选择性分泌不足，肾上腺其他激素(如糖皮质激素)正常，而或ALD的外周作用缺陷所致。流行病学：曾认为选择性醛固酮缺乏症是一种罕见病，但随着对该病的重视以及诊断技术的提高，近年来报道的病例渐趋增多。有人估计在高钾血症中约占10%，在不明原因的高钾血症中可达50%。病因：根据病因和发病机制不同，可将醛固酮缺乏症分为4类：即先天性原发性醛固酮缺乏症，获得性原发性醛固酮缺乏症，获得性继发性醛固酮缺乏症，以及假性醛固酮缺乏症。原发性与继发性是根据血浆肾素活性(PRA)与醛固酮的比值来划分的。原发性醛固酮缺乏症的比值低于正常(高肾素性低醛固酮血症)，而继发性的比值正常(低肾素性低醛固酮血症)，见表1。 C D D C D D C D D C D D
发病机制：获得性继发性醛固酮缺乏症是本症最常见的类型，主要病因有各种肾脏疾病，如慢性肾小球肾炎、间质性肾炎、慢性肾小球肾炎、肾脏淀粉样变性、肾结石、肾囊肿等；系统性疾病引起的肾脏损害如糖尿病肾病、狼疮性肾炎、多发性骨髓瘤、痛风肾等；其他疾病如肝硬化、镰状细胞贫血、血色病、急性呼吸窘迫综合征等；长期服用β受体阻断剂、前列腺素抑制剂(如吲哚美辛)也可引起本症。醛固酮缺乏继发于肾素水平降低是此型的病理生理特征，故称为低肾素性低醛固酮血症。 获得性原发性醛固酮缺乏症的病灶在肾上腺，多种原因毁损皮质组织，导致肾上腺皮质功能减退，故多数病人可合并有糖皮质激素的缺乏，选择性原发性获得性醛固酮缺乏症少见。自身免疫性肾上腺皮质功能不全、感染(结核常见)、脓毒血症、转移性肿瘤等可引起肾上腺组织结构破坏；肝素可直接抑制醛固酮生物合成。先天性原发性醛固酮缺乏症与遗传有关，是由于有关酶缺陷导致醛固酮合成障碍。胆固醇碳链酶缺乏使胆固醇转变为△5孕烯醇酮发生障碍，故不能生成任何一种类固醇激素。C D D C D D C D D C D D
尼可霉素(Nikkomycins)多组分结构及其生物合成相关基因的研究进展
!"卷#期 $%%%年&月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12’()*!"+(*#,-. ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!/-01-2$%%%收稿日期：$%%%3%!3%#，修回日期：$%%%3%43%# 。基金项目：国家自然科学基金重点资助项目（4&54%%!% ）。"通讯联系人。 尼可霉素（!"##$%& ’"()）多组分结构及其生物合成相关基因的研究进展 陈蔚谭华荣" （中国科学院微生物研究所北京!%%%5% ）摘要尼可霉素是一种新的抗真菌抗生素，在分离到的$%多种活性单组分中，6、7、8、9为主要生物活性组分。 本文介绍了尼可霉素的结构，结构与活性的关系及其生物合成途径中有关基因的研究进展。关键词尼可霉素，结构与活性，基因 中图分类号:5!$文献标识码;文章编号!%%%34%"!（$%%%）%#3%#<53%4 抗生素是以低微浓度能抑制或影响活机体生命过程的次级代谢产物。目前已知的天然抗生素约!万余种，包括抗 细菌、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗原虫、抗藻类、抗寄生虫等 抗生素。其产生菌主要来源是微生物，特别是土壤微生物， 其中从放线菌目链霉菌属中找到的抗生素累计已达#%%%多 种，占放线菌目所产生抗生素的5%=以上， 占微生物来源抗生素的#%=以上。抗生素的种类繁多， 按其化学结构大致可分为!%类：（!）! 3内酰胺类抗生素；如青霉素、头孢菌素及其衍生物等。（$ ）氨基糖甙类抗生素；如链霉素、卡那霉素。（4 ）大环内酯类抗生素；如红霉素、竹桃霉素、螺旋霉素等。（<）肽类抗生素；如杆菌肽、多粘菌素等。（# ）苯烃基胺类抗生素；如氯霉素。（" ）四环素类抗生素；如四环素、土霉素、金霉素。（>）多烯类抗生素；如制霉菌素、两性霉素?。（5 ）蒽环类抗生素；如道诺霉素。（& ）核苷类抗生素；如多氧菌素、尼可霉素。（!% ）其他；如磷霉素和硫霉素等。核苷类抗生素是包括核苷、核苷酸及其衍生物的一大类 抗生素。由于核苷、核苷酸在许多重要的细胞生理代谢中的 多效作用如作为能量供体、二级信使、代谢物运载体等而表 现出抗细菌、抗真菌、抗锥虫、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活 性。目前已发现的!%%多种核苷类抗生素依其结构不同划 分为<大类：@*碱基类似物，1*简单的核苷，A * 酰基和糖基核苷，B * 核苷酸［!］。本文所讨论的尼可霉素即是酰基和糖基核苷中的一种———核苷肽基抗生素。它是由德国的7C D E -2等 首先从唐德链霉菌的发酵液中分离的［$］。由于它同几丁质合成酶的天然底物F G H 3+3乙酰葡萄糖胺具有结构类似性而竞争性地抑制真菌、昆虫、酵母（包括人体致病菌白色念珠菌!+$3#3++,4#0+$&）的几丁质合成酶，因而表现出抗真菌、杀昆虫、杀螨虫的活性［4，<］。同时，它对哺乳动物、蜜蜂、植物、细菌等无毒害作用或毒性极低，并在自然界中易被降解，而被认为是一种理想的农用抗生素。还有研究表明，尼可霉 素对鼠的球孢子菌病、网状内皮细胞真菌病和酵母病都有很 好的疗效［#］。因此作为一种新型医用抗真菌抗生素亦有良好的应用前景。从>%年代中期尼可霉素被发现至今，已开展了广泛的研究。本文主要从以下两个方面进行介绍，希望对本领域的同仁起到抛砖引玉的作用。*尼可霉素的结构与生物活性的关系尼可霉素是一类两性水溶性核苷类物质，到目前为止已从野生株及突变株的发酵液中分离到$%多种活性单组分，其中+I J J (0K A I E6，7，8，9为主要生物活性组分，其结构如图!所示。尼可霉素是由肽基和核苷两部分组成。肽基组分为一种不常见的氨基酸———羟基吡啶同型苏氨酸（L K B 2(M K .K 2I B K )D (0(/D 2-(E I E -，L H L N ，又称+I J J (0K A I EG ）；核苷组分称为+I J J (0K A I E;，在+I J J (0K A I E6和7中同"3氨基己糖醛酸以+3;糖苷键相连的碱基分别为<3甲酰3<3咪唑3$3酮（O P Q ）和尿嘧啶，相应称为+I J J (0K A I E;M ，;R 。+I J J (0K A I E ;，G 均为"3氨基酸结构，它们通过肽键相连形成了二肽+I J J (0K A I E 6和7。三肽+I J J (0K A I E 8，9分别是+I J J (0K A I E6和7中的氨基己糖醛酸的"S 3羧基同谷氨酸形成肽键而成。早期采用了紫外线（F ’）、甲基磺酸乙酯（T P ,）、亚硝基胍（+N U ）等物理化学方法或用酶法［"，>］获得一系列的尼可霉素产生阻断突变株，它们能产生许多新的尼可霉素组分， 如+I J J (0K A I EQ M ，Q R ，V M ，V R ，:M ，:R ，,M ，,R ，W M ，W R ，H M ，X M ，X R ，#7，#9等。这些组分的生物活性因其结构的改变而 异，如W M 、W R 中由Y 3酪氨酸代替了6，7中的L H L N 则表 现为对!(5 *#$)&0#$%*%)&有强抑制作用，但对真菌和酵母无抑制作用。+I J J (0K A I EQ M ，Q R ，V M ，V R 由于肽基组分中的甲基缺失而抗真菌活性明显下降。+I J J (0K A I E #7，#9 中核苷
1293462556几丁质酶
几丁质酶(chitinase)是以几丁质(chitin)为作用底物的水解酶。几丁质又称甲壳素或甲壳质,存在于节肢动物、线虫和软体动物的体壁、真菌细胞壁(除卵菌)和一些藻类等生物的细胞壁中。在昆虫中,几丁质是围食膜及体壁的主要组成成分之一,通过几丁质酶对其有规律地降解以保证昆虫正常生长发育。如果编码该酶的基因在不适当的时候表达或该表达时未表达,都会对昆虫造成伤害。由于植物中不含几丁质,因此在植物害虫防治中,昆虫几丁质是几丁质酶的一个极具吸引力的作用靶标。 一、昆虫几丁质酶生物化学与生理作用 昆虫几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫的毒腺中,是一种糖蛋白,可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质,酶切位点通常随机发生在链中间的任何一个部位,其最终产物是可溶低分子量的GlcNAC寡聚物。昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解,几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态过程,包括经过几丁质结合区(CBD)的吸附过程、水解过程、解吸附作用及活性催化区在作用底物表面的配置过程。昆虫几丁质酶除能降解几丁质外,还担负许多重要生理功能,如昆虫肠道组织中的几丁质酶具有分解肠内和围食膜的几丁质和消化作用。昆虫几丁质酶分泌到肠道中,以无活性酶原形式存在,在需要时被胰蛋白酶激活而降解围食膜。蜕皮腺中的几丁质酶可以调节昆虫在生长发育中周期性蜕皮并合成新表皮。毒腺中的几丁质酶有助于毒腺物质在取食对象的组织中扩散渗透。 二、昆虫几丁质酶分子特征 1993年,编码昆虫几丁质酶的cDNA序列首次从烟草天蛾Manduca sexta中克隆出来。目前已克隆得到烟草天蛾、家蚕Bombyx mori和美国白蛾Hyphantria cunea等十几种昆虫的几丁质酶cDNA序列。这些克隆的基因主要集中在鳞翅目昆虫中,双翅目、鞘翅目和膜翅目仅有少数几丁质酶基因被克隆的报道。昆虫几丁质酶分子量在40~85kDa之间,比植物几丁质酶(25~40kDa)和细菌几丁质酶(20~60kDa)大。酶活性范围为pH4~8,等电点在5~7之间,大都属于18家族几丁质酶。昆虫几丁质酶为多结构域蛋白,一般都包含信号肽区、一个或多个N-端催化区、富含丝氨酸和苏氨酸(S/T)的糖基化位点区(linker区)、一个或多个fibronectin-like区和C-端富含半胱氨酸(Cys)的几丁质结合区(CBD)。但不同昆虫的几丁质酶,其多区结构有所不同,如一种寄生蜂Chelonus sp.的几丁质酶大小为52kDa,有一个富含丝氨酸和苏氨酸的区域,但缺少C-端富含半胱氨酸的区域。这些结构域构成上的变化以及氨基酸序列的不同导致了昆虫几丁质酶在最适pH、催化活性、对几丁质的亲合力及稳定性方面的差异。昆虫几丁质酶的多个结构区独自发挥功能,互不影响,其中N-端催化区序列具有保守性,决定酶的催化活性。连接N-端催化区和几丁质结合区的linker区,是经过O-位高度糖基化修饰,而催化区只是适度的N-位糖基化修饰,linker区使几丁质酶易于分泌到细胞外,并且在有蛋白水解酶存在的情况下,保持几丁质酶的稳定性。几丁质结合区(CBD)基本功能是使几丁质酶结合不溶性的底物并提高降解效率。具有多个CDB区时,能增强昆虫几丁质酶对大分子不溶底物的结合能力及作用活性,提高催化区在水解不溶性底物时的催化效率,linker区也可能影响碳水化合物结合区的功能。昆虫几丁质酶的CBD约为65个氨基酸,且不同的昆虫几丁质酶CBD序列有高度的相似性,其中6个Cys最为保守,存在于所有昆虫几丁质酶的CBD中。研究表明, 几丁质酶的活性仅与活性催化区有关,而昆虫几丁质酶与体壁和中肠几丁质的相互作用依赖于几丁质结合区和活性催化区同等、共同的作用。昆虫几丁质酶中有几个重要的氨基酸残基保守位点:W145,D144,E146和D142。W145维持几丁质酶催化区域结构,对酶的催化活性产生重要影响。如以甘氨酸替代则活性完全丧失,但是W145对几丁质酶与几丁质之间的结合并不是必需的。E146在水解中起酸碱催化剂的作用,D144维持一种电离平衡,D142影响几丁质酶最适pH值,该位点的突变可使几丁质酶最适PH由碱性变为酸性。三、昆虫几丁质酶基因的体内表达 昆虫几丁质酶的表达受蜕皮激素的诱导,而保幼激素抑制其表达。研究表明,在没有几丁
产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定
第35卷第8期东 北 林 业 大 学 学 报Vol.35No.8 2007年8月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug.2007 产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定1) 惠丰立 冯金荣 杨柯金 文祯中 (南阳师范学院,南阳,473061) 摘 要 从番茄果实表面筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐 病菌(Fusarium oxysporum)有较强的抗菌活性并具有较广的抗菌谱。形态及生理生化特征测定结果表明:菌株CY- 6与伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(I.terricola)种的特征基本一致;测定了该菌株的26S r DNA D1/ D2区域序列并根据26S r DNA构建了系统发育树;在系统发育树中,菌株CY-6与陆生伊萨酵母形成一个类群, 序列同源性高达99.6%。因此,将菌株CY-6鉴定为陆生伊萨酵母。 关键词 菌株CY-6;几丁质酶;26S r DNA;系统发育 分类号 S476 Screen i n g and I den ti f i ca ti on of Ch iti n a se2Produc i n g Y ea st/Hui Fengli,Feng J inr ong,Yang Kejin,W en Zhenzhong (College of L ife Science and Technol ogy,Nanyang Nor mal University,Nanyang473061,P.R.China)//Journal of Northeast Forestry University.-2007,35(8).-66～67,70 A chitinase2pr oducing yeast is olate CY26was screened fr o m the surface of t o mat o fruits.The chitinase pr oduced by strain CY26could str ongly inhibit the gr o wth of Fusariu m oxysporu m and exhibited inhibiti on against a wide2range of p lant pathogenic fungi.Mor phol ogical,physi ol ogical and bi oche mical characteristics of strain CY26sho wed that the characteristics of strain CY26 were essentially consistent with those of Issatchenkia terricola.The analysis of26S r DNA D1/D2do main sequence fr o m strain CY26suggested that strain CY26was clustered t ogether with I.terricola in the phyl ogenetic tree,and the sequence identity be2 t w een strain CY26and I.terricola was99.6%.The result indicates that strain CY26bel ongs t o I.terricola. Key words Yeast CY26;Chitinase;26S r DNA;Phyl ogenetic analysis 果蔬采后的病害主要由病原真菌引起[1]。长期以来,使用化学合成杀菌剂一直是控制果蔬采后病害发生的主要手段之一,但是随着人类对食品安全、环境保护和克服有害生物抗性等问题的日益重视,化学杀菌剂的使用正受到越来越严格的限制[2-3]。因此,研究和开发控制果蔬采后病害的新方法,对于降低腐损率、控制农残量、确保食用安全和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。 几丁质酶(Chitinase,Ec.3.2.14)被普遍认为是一种与重寄生、抗病防卫反应有关的酶类,许多拮抗菌通过产生几丁质酶来降解病原菌细胞壁[4]。因此,几丁质酶产生菌在果蔬采后病害防治方面有巨大的应用潜力。近年来,酵母菌分泌的胞外几丁质酶在果蔬采后病害生物防治中的作用已引起人们的重视。范青等人[5]利用膜毕赤酵母(Pichia m e m branefaciens Hansen)和季也蒙假丝酵母(Candida guillier m ondii)防治桃采后的真菌病害,发现这2种酵母菌产生的几丁质酶对桃软腐病菌(Rhizopus stolonifer(Ehrenb:Fr)Vuill)孢子萌发有明显的抑制作用。本研究从番茄果实表面分离筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强抑制作用,并对其进行了形态、生理生化鉴定及基于26S r DNA序列的系统发育分析。 1 材料与方法 菌株CY-6是从番茄果实表面分离得到;番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)及其供试病原菌由本实验室分离保存。 1)河南省自然科学基金项目(0411032300)。 第一作者简介:惠丰立,男,1965年7月生,南阳师范学院生命科学与技术学院,教授。 收稿日期:2006年10月17日。 责任编辑:潘 华。 固体几丁质培养基:胶状几丁质15.0g、酵母粉5.0g、(NH 4 ) 2 S O41.0g、M gS O4?5H2O0.3g、KH2P O41.36g、H2O 1L,pH为4.5;液体几丁质培养基:固体几丁质培养基不加琼 脂;P DA培养基:马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂13g、H 2 O1mL。 菌株的分离筛选:从市场上购买新鲜的苹果、梨、桃、番茄等水果样品,分别取果皮组织5g,加入45mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in振荡培养48h。取0.1mL稀释一定倍数的稀释液均匀涂于固体几丁质平板上,28℃培养6d后,挑取具有明显透明圈的菌株纯化,置于4℃保存。将初筛菌株接种于50mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in摇瓶发酵72h后,测定发酵液几丁质酶活力。 几丁质酶活性测定:参照Ant oni o和Masarus方法[6-7]。1mL胶体几丁质与稀释的1mL酶液放于50℃水浴保温1h,上清液中的还原糖按DNS法测定。一个酶活力单位定义为每小时释放相当于100μg N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。 酶抗菌活性测定:采用打孔法[8]。将供试病原菌接种于直径为9.0cm的P DA平板上,28℃培养2～4d,在菌苔周围1.0cm处打3个孔(d=0.5cm),孔中加入50μL质量浓度分别为100、200mg/L的几丁质酶,对照以等量的无菌水代替,继续培养2～3d,观察抑菌情况。 形态和培养特征:参照微生物学实验手册[9]对菌株CY-6进行形态和培养特征观察。 生理生化特征:参照微生物学实验手册和酵母菌的特征与鉴定手册[9-10],对菌株CY-6进行糖发酵、碳源同化、氮源同化、无维生素培养基生长等生理生化鉴定。 26S r DNA序列分析:参照白逢彦等方法[11]提取菌株CY-6基因组DNA,用引物NL1(5’-GCA T AT C AA T AA GCG G AGG AA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAG