寡核苷酸近末端位点的酶切
寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl 或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
酶寡核苷酸序列链长
切割率%
2 hr 20 hr
Acc I G GTCGAC C
CG GTCGAC CG
CCG GTCGAC CGG 8
10
12
Afl III C ACATGT G
CC ACATGT GG
CCC ACATGT GGG 8
10
12
>90
>90
>90
>90
Asc I GGCGCGCC
A GGCGCGCC T
TT GGCGCGCC AA 8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Ava I C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
TCC CCCGGG GGA 8
10
12
50
>90
>90
>90
>90
>90
BamH I C GGATCC G
CG GGATCC CG
CGC GGATCC GCG 8
10
12
10
>90
>90
25
>90
>90
Bgl II C AGATCT G
GA AGATCT TC
GGA AGATCT TCC 8
10
12
75
25
>90
>90
BssH II G GCGCGC C
AG GCGCGC CT
TTG GCGCGC CAA 8
10
12
50
>90
BstE II G GGT(A/T)ACC C 9
10
BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGG
AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA
CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT 22
24
27
25
25
50
>90
Cla I C ATCGAT G
G ATCGAT C
CC ATCGAT GG
CCC ATCGAT GGG 8
8
10
12
>90
50
>90
50
EcoR I G GAATTC C
CG GAATTC CG
CCG GAATTC CGG 8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Hae III GG GGCC CC
AGC GGCC GCT
TTGC GGCC GCAA 8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Hind III C AAGCTT G
CC AAGCTT GG
CCC AAGCTT GGG 8
10
12
10
75
Kpn I G GGTACC C
GG GGTACC CC
CGG GGTACC CCG 8
10
12
>90
>90
>90
>90
Mlu I G ACGCGT C
CG ACGCGT CG 8
10
25
50
Nco I C CCATGG G
CATG CCATGG CATG 8
14
50
75
Nde I C CATATG G
CC CATATG GG
CGC CATATG GCG
GGGTTT CATATG AAACCC
GGAATTC CATATG GAATTCC
GGGAATTC CATATG GAATTCCC 8
10
12
18
20
22
75
75
>90
>90
CG GCTAGC CG CTA GCTAGC TAG 10
12
10
10
25
50
Not I TT GCGGCCGC AA
ATTT GCGGCCGC TTTA
AAATAT GCGGCCGC TATAAA
ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT
AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA 12
16
20
24
28
10
10
25
25
10
10
90
>90
Nsi I TGC ATGCAT GCA
CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT 12
22
10
>90
>90
>90
Pac I TTAATTAA
G TTAATTAA C
CC TTAATTAA GG 8
10
12
25
>90
Pme I GTTTAAAC
G GTTTAAAC C
GG GTTTAAAC CC
AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG 8
10
12
24
75
25
50
>90
Pst I G CTGCAG C
TGCA CTGCAG TGCA
AA CTGCAG AACCAATGCATTGG
AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA
CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT 8
14
22
24
26
10
>90
>90
10
>90
>90
Pvu I C CGATCG G
AT CGATCG AT
TCG CGATCG CGA 8
10
12
10
25
10
Sac I C GAGCTC G 8
10
10
Sac II G CCGCGG C
TCC CCGCGG GGA 8
12
50
>90
Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28
30
32
10
10
50
75
Sca I G AGTACT C
AAA AGTACT TTT 8
12
10
75
25
75
Sma I CCCGGG
C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
TCC CCCGGG GGA 6
8
10
12
10
>90
10
10
50
>90
GG ACTAGT CC CGG ACTAGT CCG CTAG ACTAGT CTAG 10
12
14
10
>90
50
50
Sph I G GCATGC C
CAT GCATGC ATG
ACAT GCATGC ATGT 8
12
14
10
25
50
Stu I A AGGCCT T
GA AGGCCT TC
AAA AGGCCT TTT 8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Xba I C TCTAGA G
GC TCTAGA GC
TGC TCTAGA GCA
CTAG TCTAGA CTAG 8
10
12
14
>90
75
75
>90
>90
>90
Xho I C CTCGAG G
CC CTCGAG GG
CCG CTCGAG CGG 8
10
12
10
10
25
75
Xma I C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
CCC CCCGGG GGG
TCCC CCCGGG GGGA 8
10
12
14
25
50
>90
75
>90