生物素标记提取膜蛋白以及WB具体步骤

一，Lipo2000转染

1,准备细胞：转染前一天，向含9mlDMEM（含血清不含抗生素）的9cm平板接入细胞，使其在转染时长到90%。转染前用DMEM（—）洗2遍后，加入9mlDMEM（不含血清不含抗生素）

2,准备混合物：

①将6ug质粒稀释于300ulDMEM（—）中，涡旋1s，静置5min。

②将18ul Lipo2000稀释于300ulDMEM（—）中，涡旋1s，静置5min。

③将①②混匀，静置20min。

3，将混合物加入平板，前后摇匀。

4,6h后给细胞换DMEM（含血清不含抗生素）。

5，继续培养8—48h，观察。

二，生物素标记

1,向皿中加入2ml 1mg/ml的生物素试剂。

2,4℃，温和shaking30min，孵育后有一些细胞会悬浮起来，转移这些细胞至离心管中，离心收集细胞，并按下面方法洗涤细胞。

3，用2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+，100Mm Glycine的PBS清洗细胞2次，这时也会有一些细胞悬浮起来，转移它们到一个离心管，离心收集细胞。

4，加2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+的PBS到皿中。

5，4℃，45min停止未反应的生物素试剂的反应。（使生物素试剂失活），并收集浮起来的细胞，离心收集细胞。

6，收集细胞：将皿中的细胞和浮起来的细胞转移进入一个1.5ml的离心管。

7，向1.5ml的离心管中加入1ml RIPA/lysis buffer。（含蛋白酶抑制剂1table /50ml）8，4℃涡旋1h。

9,20000g,10min,4℃,以沉淀核酸与其他残渣。

10，把上清转入新的EP管，（这是总蛋白，T，一般情况下浓度应该在1-5mg/ml，可以用Bradford method来测定浓度，并调整全部样品至同一浓度）

11，向300ul pre-cleared sample中加入300ul含50% slurry-Avidin beads的PBS,PI孵育。

（PI，蛋白酶抑制剂，的工作浓度0.1-1mM，17-174ug/ml）

12，室温涡旋1h。（使生物素和亲和素充分结合）

13，离心除去beads，将上清转移至一新离心管中。（这是位结合的蛋白质，浓度相对于总蛋白被稀释了1.5倍。）

14，向beads中加入150ul 2×Laemmli buffer来将beads上的蛋白质洗掉。（洗下来的蛋白浓度是总蛋白浓度的2倍）

三，WB

(一)做胶

1，将板洗干净，晾干

2，把两个板合在一起放到模具上，板要对齐放平，板下垫胶皮垫，防止液体渗出。

3，配制分离胶：1.5mm的胶，一块大约7ml

用一个小烧杯，按顺序加入，每加入一样都混匀一下，再加下一样。加入

TEMED后，混匀，用枪头搅拌30s。

4，用蓝枪头吸取配制好的分离胶，慢慢加入两板之间，从板的一角竖直加入。

加到离梳齿下缘1cm处。

5，用蓝枪头吸取ddH2O，从两板之间的上方水平加入，直到水平面与玻璃板

持平。静置30min。（其中30%丙烯酰胺和TEMED要避光保存，10%过硫酸

铵分装到EP管里）

6，把水倒掉，将板倒过来，用纸吸干

7，配制积层胶：方法同分离胶，注意混匀。1.5mm板每块约需3ml。

8，用蓝枪头加积层胶，从板的一角加入，胶面与板持平。

9，加入梳子，将梳子按下去，梳子顶部与版面持平。会有液体渗出来，注意不要溅到身上。静置30min。

(二)点样：把板取出放到电泳槽内，小槽内液体要灌满，大槽可以不满。

(三)跑胶：先以60V跑30min,等样品进入分离胶后可加电压至80V。

(四)转膜

待溴酚蓝跑出去后，停止电泳。

1，用剪刀剪取名片大小的minipore PDVF膜，剪去一个角做标记。

2，向两个小方盒里transfer buffer和甲醇。

①将PDVF膜放入甲醇1min，取出放到转印滤纸上，滤纸是用transfer

buffer浸湿的。（用一个夹眉毛似的小镊子，取膜会很方便）

②用一个塑料刀片将胶取出，除去积层胶，切角做标记。放到有transfer

buffer的方盒中。

③PDVF膜与滤纸之间不能有气泡，将胶放到PDVF膜上，做标记的一角

对齐。保证胶与PDVF膜之间没有气泡。

④盖上另一层转印滤纸。（可以多加几层）。用刮子刮一下，保证没气泡，

合起来就好了，放入转膜模具。

⑤膜朝正极，胶朝负极。

(五)封闭

1，直接从转膜模具中拿出来，不用洗

2，5%脱脂奶粉+1×TBST现配，将膜放入，摇床室温2h。

(六)一抗

1，把封闭液倒掉

2，向5ml新的封闭液中加10ul一抗，加到盛膜的盒子里，摇床室温1-2h。

(七)二抗

1，将一抗液体倒掉，洗转印膜，1×TBST3次，每次10min。

2，加二抗

3，二抗孵育完也要洗，1×TBST3次，每次10min。

(八)曝光

1，取一张保鲜膜，取出PDVF膜，在纸巾上竖着碰几下，让水微微干

2，加ECL，用枪头赶平，室温1min，最后用保鲜膜包起来，剪去周边。

3，曝光30s，在暗室进行，底片也剪个小角，底片小角与膜小角对应。

4，在显影液中显影，在定影液中定影，在水中清洗，晾干即可。

Nature Methods：一种全新的邻近蛋白质生物素化标记方法—可直接用于原代组织

Nature Methods：一种全新的邻近蛋白质生物素化标记方法—可直接用于原代组织 订阅号APExBIO 研究意义 在生物学研究中，获取某一细胞系的蛋白质相互作用图谱或许并不难，但是直接从原代组织中检测蛋白质组图谱甚至它们之间的相互作用是一个重大的挑战。近日，来自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)的研究团队设计了一种新的生物素标记方法，用抗体代替传统的酶融合，标记靶蛋白邻近的蛋白。即使用针对靶蛋白的抗体来引导生物素沉积到与其相邻的蛋白质上，通过链霉亲和素磁珠捕获这些蛋白质并用质谱鉴定，样本可以是细胞或原代组织。该团队使用这种方法检测了多种细胞和组织类型中靶蛋白即核纤层蛋白A的邻近蛋白组成。 有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分都是与分子伴侣或者其它蛋白质组装在一起发挥作用。蛋白质组装（Protein assemblies）对于所有活细胞的功能都至关重要。细胞或组织中完整的蛋白质-蛋白质相互作用网络称为蛋白质相互作用组（protein interactome），是动态的，会随着时间、发展阶段、细胞周期进程或组织类型而改变。因此，表征蛋白质之间的相互作用可以获得靶蛋白质的位置和功能等重要信息。然而，特定突变对组织特异性蛋白质相互作用组的影响很少被详细研究。 我们都知道单个基因的不同突变可能会导致不同的疾病。如核纤层蛋白 A / C （LMNA）基因有400多个不同的突变，会产生超过14种不同的表型，这些表型引起不同病症包括脂肪营养不良、肌营养不良和早衰综合症。然而这些单基因突变与其高度可变表型之间的机制联系尚不清楚。尤其是组织特异性核纤层蛋白（lamin）的相互作用组也有待阐明。 通过标准的免疫共沉淀（CoIP）分析核纤层蛋白的相互作用组是不切实际的，因为由核纤层蛋白长丝产生的不溶性高阶结构导致无关蛋白的过量沉淀。已经用各种遗传和生物化学方法来鉴定核纤层蛋白A的相互作用蛋白，如利用生物素化的邻近标记方法、表达高亲和力的OneSTrEP-标签和免疫共沉淀、蛋白芯片等。虽

蛋白提取步骤

提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制： 1ml cell lysis 10ul NP-40（离心机后） 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱） 10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒） 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左 右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。 3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往 上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部） 超声波设置： 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s，关机时间30s 温度0度， 报警温度1度 5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，） 蛋白保存 6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。

BCA测定蛋白浓度 1、测空白板，选差异较小的孔。 BCA测定法波长570，Bracford：595 2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样： 浓度0 BSA（ul）0481216 PBS（ul）20161284 4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量， 一般防止损耗，多算一个样。 6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果） 7、计时30min 8、配分离胶，灌胶，加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白：先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用 水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致） 11、计时10min ，变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次） 液面刚覆盖胶，不能有气泡。 13、上样：maker 上样量为3ul。依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去 14、电泳 分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。

34抗体的标记——生物素(Biotin)

抗体/蛋白的生物素（Biotin）标记 一般每个抗体可以标记3～5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。 蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。 SOP35 抗体/蛋白的生物素（Biotin）标记 1. 抗体/蛋白的前处理： 1.1 选择适当截留的超滤柱中加入400μl 标记反应溶液（0.1M PBS pH 7.2），加入1mg抗体，混匀。 1.2 4℃，6,000rpm，离心2min，弃滤液；于超滤柱中再加入200μl标记反应溶液，混匀。4℃，6,000rpm，离心2min， 1.3 重复步骤1.2 6～7次。 1.4 混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min；将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，6,000rpm，2min，收集液体。 1.5 取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。倒置超滤柱，4℃，6,000rpm，2min，收集液体。 1.6 步骤1.4 与步骤1.5 的收集的滤液合并，用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml，4℃放置备用。 2. 生物素的标记： 2.1 将生物素溶解在合适的溶剂中（请参照所选购生物素的说明书，不同的生物素其溶剂不同），浓度为20mg/ml,按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入抗体溶液，室温反应1h。 2.2 葡聚糖凝胶分离纯化/透析袋或者超滤管去除游离生物素及其他试剂。 2.3 将抗体保存于合适的抗体保存液。 进行抗体标记的时候，需要对抗体性质、交联剂和标记物的性质非常了解，否则很难标记出高品质的抗体；标记量低，导致信号值低；标记量太高，不但容易造成背景，并且还容易由于标记物的聚集造成信号拮抗，反而降低或者淬灭信号值。标记物的种类繁多，不同类型的标记物其性质完全不一样，标记物很难选择和把握，建议初学者使用专业化的试剂盒进行标记，或者直接委托专业化公司标记。福因德生物提供以下抗体标记相关产品，同时可以提供抗体/蛋白标记服务。

生物素标记EMSA探针-AP1

生物素标记EMSA探针－AP1 产品简介： 生物素标记EMSA探针－AP1是用于EMSA(也称gel shift)研究的并经生物素(Biotin)标记的AP1 consensus oligonucleotide。 这个生物素标记的双链寡核苷酸含有公认的AP1结合位点，可以用作EMSA研究时的探针。 AP1 consensus oligo的序列如下： 5’-CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA-3’ 3’-GCG AAC TAC TGA GTC GGC CTT-5’ 本生物素标记EMSA探针已经过纯化，可以直接用于EMSA结合反应。 本生物素标记EMSA探针可以和碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)配套使用。 一个包装的生物素标记探针可以进行约200-400个样品的EMSA检测。 保存条件： -20℃保存，一年有效。 注意事项： 避免加热到40℃以上，温度过高会导致双链DNA探针解聚成单链。而单链无法用于EMSA研究。 对于基于生物素标记的EMSA检测的详细操作可以参考碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)的使用说明。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.本生物素标记EMSA探针用于EMSA结合反应时，参考如下步骤进行： A.如下设置EMSA结合反应： 阴性对照反应： Nuclease-Free Water 7-7.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 0μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 探针冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 未标记的探针 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl Super-shift反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 目的蛋白特异抗体 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 样品反应： Nuclease-Free Water 5-5.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 突变探针的冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 未标记的突变探针 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl

Biotin 生物素简介

Biotin 生物素簡介 Biotin 生物素簡介生物素是一環狀有如尿素的化學物質，具有一硫酚(Thiophene)的結構環，此種學物質有八種同形異構物，但也只有右旋生物素(d-biotin)是存在於自然界中，也才有維生素的功能。生物素是一無色、針狀的物質，稍微溶解在冷水中，較易溶解於酒精裡，但不溶有機溶劑中。生物素對熱還算穩定，並不被酸或鹼所破壞的。生物素是某些微生物發育所必須的營養素之一，只要很少量即可助微生物之生長。其廣存於自然界中所以正常人不虞匱乏，唯飲食大量缺乏時，可能會伴隨生物素的缺乏。功能：細胞的生長脂肪酸的生成蛋白質、脂肪、碳水化合物的代謝維生素B群的利用缺乏症狀沮喪，2.乾燥皮膚，3.疲勞，4.稍帶灰色皮膚，5.失眠症，6.肌肉蒼，7.食欲不振。用人做試驗時，4週時會出現中度性的皮膚炎，到7~8週後形成脫屑性膚病，尤其在四肢手腳部份，帶有麟片似地灰斑。舌狀乳突萎縮，反胃、食欲不振等毛病。肌肉蒼白、神經過敏症(hyperaesthesia)，厭倦、疲乏、貧血亦會發生。皮脂溢出性的皮膚炎、脫屑性的紅皮症等與生物素缺乏有關。用來治療的症候皮膚炎、粉刺溼疹腳痙攣禿頭。治療時，每日5mg生物素注射或 2~5mg口服，療程數天。增進效率的物質1.維生素B群，2.維生素B12，3.葉酸(folic acid)，4.泛酸(patothenic acid)，

5.維生素C，5.硫(sulphur)。相抗抗衡的物質1.酒精，2.咖啡，3.生蛋白。中華民國衛生署每日營養素建議攝取量RDNA: -- (衛生署每日營養素建議攝取量以16歲男性為基準。)美國國立食品營養委員會每日營養素建議攝取量 RDA(Recommended Dietary Allowances): 300mcg 來源：內臟，蛋黃，豆類，穀類....等為最佳食物來源。雞肉 -------------------------------2~5 巧克力---------------------------32 花椰菜----------------------------17 蛋---------------------------------6 豬肉-------------------------------2~5 全麥------------------------------5 花生-------------------------------30 青豆------------------------------2 牛肝-------------------------------100 鮭魚------------------------------5 牛奶------------------------------5 牡蠣------------------------------9 牛肉-------------------------------4 玉蜀黍---------------------------6 胡蘿蔔----------------------------2 菠菜------------------------------2

DNA3’端生物素标记

1、准备工作： A、取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。 B、取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。如果待标记的EMSA探针为双链， 95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA探针转变为单链的探针，然后同样用水稀 释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA 探针浓度为0.5μM。 2、DNA探针的标记： Ultrapure water 29μl TdT Buffer(5X) 10μl 待标记探针(1μM) 5μl Biotin-11-dUTP(5μM) 5μl TdT(10U/μl) 1μl 总体积 50μl A、参考上述设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。 B、用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37℃孵育30分钟。 C、加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。 3、TdT的去除： A、探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。 B、12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。 4、探针的纯化(选做)： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。 如需纯化，可以按照如下步骤操作： A、对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。 B、-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。 C、4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。 D、4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 E、加入50μl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。 5、生物素标记探针标记效率的检测： A、取5μl Biotin-Control Oligo(0.4μM)，加入196μl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 B、取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μl TE，混匀，稀释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 C、参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。对于经过

各种蛋白标签汇总

各种蛋白标签汇总标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

各种蛋白标签汇总 蛋白标签 蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 标签纯化促进溶解度抗体效价细胞标记 His6++/-+/- Flag++/-+ GST+++ MBP++++ His-MBP++++ HA+ eGFP/CFP/YFP+++ Myc+ His-Myc++ His-AviTag++++++ Sumo++++ His-Sumo+++++ SNAP-Tag++++++ Halo Tag++++++ TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的分子量小，只有~，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能； His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性； His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究； His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和； 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。 FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询克隆产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究;

蛋白质提取方法

蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，

生物素标记试剂盒使用说明书

生物素标记试剂盒 使用说明书 货号: EBLK0002

产品介绍： Elabscience生物素标记试剂盒提供了生物素标记所需全部试剂，用于含有氨基（NH2-）抗体的标记。生物素已经活化，可直接使用，每个试剂盒足以完成3次标记，每次可标记0.2-2mg。试剂盒中包括6个用于抗体标记脱盐的Filtration tube，不用透析，操作简便，熟练操作90min可完成整个标记过程。 产品特点： 试剂全面:本试剂盒提供了生物素标记所需全部试剂。 快速:整个过程仅需90min。 方便:通过Filtration tube即可脱盐，无需透析或者凝胶过滤。 使用灵活:既可用于微量标记又可大量标记，每次可标记0.2-2mg。 理想的标记效果:已经优化确定了最适的标记比例，降低标记不足或由于过度标记而失活的可能性。 产品组成： 标记过程需要仪器： 1. 10ul，50ul，200ul，1000ul可调高精度移液器 2. 恒温箱（37℃） 3. 离心机（离心力可达到12,000×g） 储存条件： 本试剂盒未开封前在2-8℃可稳定保存一年

生物素标记反应原理： NH2-Reactive Biotin专一地与伯胺反应（N-末端及赖氨酸残基侧链）形成稳定的酰胺键 生物素标记NH 2 -Reactive Biotin使用量的计算： 每个反应中生物素试剂的使用量取决于待标记蛋白质的量和浓度。通过优化，我们确定了标记2mg/ml的抗体（IgG ，150KD），使用生物素和抗体的分子比为20:1能达到较理想的标记效果。 1、标记2mg/ml的抗体，使用生物素和抗体的分子比为20:1时，应加入生物素量的计算方 法： ml蛋白×2mg蛋白 ml蛋白×1mmolIgG 150,000mgIgG ×20mmol生物素 mmol蛋白 = mmol生物素 2、对于10mmol的生物素溶液，应加入反应中该生物素体积的计算方法： mmol生物素×1,000,000μL L ×L 10mmol = ul生物素 计算示例： 对于0.5ml 2mg/ml的IgG（分子量为150,000）溶液，需加入10mM的生物素溶液13.3ul。 0.5ml IgG×2mgIgG 1mLIgG ×1mmolIgG 150,000mgIgG ×20mmol生物素 1mmolIgG =0.000133mmol生物素 0.000133mmol生物素×1,000,000μl L ×L 10mmol =13.3ul生物素溶液 操作过程： 实验前准备： 1.仔细阅读使用说明书。 2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。 3.提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的NH2- Reactive Biotin 继续放置冰箱中）。

蛋白提取方法

?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品

生物素标记抗体的免疫荧光方法

生物素标记抗体的免疫荧光方法 *重要提示：在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用（APPLICATIONS）部分，确认这支抗体已经验证过可用于你计划采用的本实验方法中的特定方案。 A.所需溶液和试剂 注意：用Milli-Q超纯水或是相当级别的水配制溶液。 1.10 X磷酸盐缓冲液(PBS): 1升水中加入80 g 氯化钠(NaCl), 2 g 氯化钾(KCl), 14.4 g 磷 酸氢二钠(Na2HPO4) and 2.4 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)。调整pH到7.4。 2.甲醛溶液，16%，无甲醇的类型，Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。开封 以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。 3.二甲苯 4.无水乙醇，组织学级，100%和95%。 5.蒸馏水(dH2O) 6.封闭缓冲液：配制25ml时，2.5 ml 10X PBS和1.25ml正常血清（来源与二抗相同， 例如正常山羊血清，正常驴血清）兑到21.25ml的蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入75μL Triton X-100(100%) 7.抗体稀释缓冲液配置40ml时，取4 ml 10X PBS兑入36 ml蒸馏水，混匀。加入0.4 BSA，使溶解。边搅拌边加入120μL Triton X-100(100%)。 8.10 mM 柠檬酸钠缓冲液配置1L时，称取2.94g二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7?2H2O) 溶解在1L蒸馏水中。调整pH为6.0。 9.荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin 注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低 11.Prolong? Gold 抗淬灭试剂(Invitrogen, Eugene, OR, Cat# P36930) B.样品制备 I.细胞系培养物来源(IF-IC) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-IC。 注意：细胞应直接在多孔板，腔室玻片或是盖玻片上直接培养，处理，固定和染色。 1.用PBS稍加润洗。 2.吸去PBS，将细胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（PBS配制）中。 注意：甲醛有毒，需要在通风橱中操作。 3.室温下固定细胞15分钟。 4.吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟。 5.甲醇打孔步骤（是否需要参考抗体说明首页）在甲醛固定后，将细胞浸泡在冰纯甲 醇中（加入足量甲醇完全盖住细胞，液层厚度在3-5mm，千万别让细胞干掉），–20°C 孵育10分钟。用PBS润洗5分钟。 6.继续C部分的免疫染色。 II.石蜡切片(IF-P) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。 脱蜡处理/再水化 1.用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。 2.用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。 3.用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟 4.在蒸馏水中润湿2次，每次5分钟。 抗原暴露：

细胞的总蛋白质提取全过程及经验

细胞的总蛋白质提取全 过程及经验 The manuscript was revised on the evening of 2021

细胞的总蛋白质提取全过程及经验 如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS 洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s 每次，间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:，体积比。一般我加的是裂解液体积的5 倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，的EP tube 也可以使用。之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL 之间，所

蛋白提取实验步骤

蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。

4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。

提取蛋白的常规方法

1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间

蛋白标记技术详解

蛋白标记技术详解 蛋白质标记的主要目的是监测生物过程、辅助检测（例如化合物的可靠定量、蛋白质修饰的特异性检测）或者纯化蛋白及其结合对象。蛋白质的标记能够提高检测灵敏度以及简化检测工作流程。 目前有多种蛋白质标记技术来帮助我们研究感兴趣的蛋白质的丰度、位置、相互作用、翻译后修饰、功能，乃至监测活细胞中的蛋白质运输等问题。目前有多种类型的标记物和标记方式可供选择，但是针对特定的应用应当选择适合的标记策略。 1.代谢标记策略 代谢标记策略是一种体内标记方法，在这种方法中，细胞被“喂养”了化学标记的营养物，然后这些标记物被掺入新合成的蛋白质、核酸或代谢物中。然后，我们可以收集细胞并分离这些分子以获得细胞生物过程的全局视图。 蛋白同位素标记 原理 蛋白同位素标记是一种经典的蛋白示踪和蛋白组学定量技术，用天然同位素（轻型）或稳定同位素（重型）标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，这样细胞新合成的蛋白质可以在细胞生长期间通过掺入含有不同同位素的氨基酸进行标记。 应用举例 蛋白质组学研究方向流行的代谢标记方法是SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture），即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记。结合质谱技术，SILAC 通过使用重型氨基酸（例如，15N-或13C-赖氨酸）标记其中一组培养物或细胞系，而向另一组添加正常的轻型氨基酸，从而量化两种培养物或细胞系之间蛋白质丰度的差异。然后将在这两种条件下生长的细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的

生物素标记提取膜蛋白以及WB具体步骤

一，Lipo2000转染 1,准备细胞：转染前一天，向含9mlDMEM（含血清不含抗生素）的9cm平板接入细胞，使其在转染时长到90%。转染前用DMEM（—）洗2遍后，加入9mlDMEM（不含血清不含抗生素） 2,准备混合物： ①将6ug质粒稀释于300ulDMEM（—）中，涡旋1s，静置5min。 ②将18ul Lipo2000稀释于300ulDMEM（—）中，涡旋1s，静置5min。 ③将①②混匀，静置20min。 3，将混合物加入平板，前后摇匀。 4,6h后给细胞换DMEM（含血清不含抗生素）。 5，继续培养8—48h，观察。 二，生物素标记 1,向皿中加入2ml 1mg/ml的生物素试剂。 2,4℃，温和shaking30min，孵育后有一些细胞会悬浮起来，转移这些细胞至离心管中，离心收集细胞，并按下面方法洗涤细胞。 3，用2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+，100Mm Glycine的PBS清洗细胞2次，这时也会有一些细胞悬浮起来，转移它们到一个离心管，离心收集细胞。 4，加2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+的PBS到皿中。 5，4℃，45min停止未反应的生物素试剂的反应。（使生物素试剂失活），并收集浮起来的细胞，离心收集细胞。 6，收集细胞：将皿中的细胞和浮起来的细胞转移进入一个1.5ml的离心管。 7，向1.5ml的离心管中加入1ml RIPA/lysis buffer。（含蛋白酶抑制剂1table /50ml）8，4℃涡旋1h。 9,20000g,10min,4℃,以沉淀核酸与其他残渣。 10，把上清转入新的EP管，（这是总蛋白，T，一般情况下浓度应该在1-5mg/ml，可以用Bradford method来测定浓度，并调整全部样品至同一浓度） 11，向300ul pre-cleared sample中加入300ul含50% slurry-Avidin beads的PBS,PI孵育。 （PI，蛋白酶抑制剂，的工作浓度0.1-1mM，17-174ug/ml） 12，室温涡旋1h。（使生物素和亲和素充分结合） 13，离心除去beads，将上清转移至一新离心管中。（这是位结合的蛋白质，浓度相对于总蛋白被稀释了1.5倍。） 14，向beads中加入150ul 2×Laemmli buffer来将beads上的蛋白质洗掉。（洗下来的蛋白浓度是总蛋白浓度的2倍） 三，WB (一)做胶 1，将板洗干净，晾干 2，把两个板合在一起放到模具上，板要对齐放平，板下垫胶皮垫，防止液体渗出。 3，配制分离胶：1.5mm的胶，一块大约7ml 用一个小烧杯，按顺序加入，每加入一样都混匀一下，再加下一样。加入 TEMED后，混匀，用枪头搅拌30s。 4，用蓝枪头吸取配制好的分离胶，慢慢加入两板之间，从板的一角竖直加入。 加到离梳齿下缘1cm处。 5，用蓝枪头吸取ddH2O，从两板之间的上方水平加入，直到水平面与玻璃板