绿茶儿茶酚对活性氧和血管细胞增殖的影响研究_杨红

第40卷 第1期 电 子 科 技 大 学 学 报 V ol.40 No.1

2011年1月 Journal

of University of Electronic Science and Technology of China Jan. 2011 绿茶儿茶酚对活性氧和血管细胞增殖的影响研究

杨 红，刘贻尧

(电子科技大学生命科学与技术学院 成都 610054)

【摘要】以内皮细胞、中膜平滑肌细胞和HL-60细胞(异常细胞模型)，研究了绿茶儿茶酚对3种细胞增殖的影响。用次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶化学发光法研究了绿茶儿茶酚清除活性氧的效果。研究结果表明，1 μg/mL 的绿茶儿茶酚略可促进内皮细胞增殖；1、3 μg/mL 的绿茶儿茶酚对中膜平滑肌细胞增殖没有抑制作用；10 μg/mL 的绿茶儿茶酚减少中膜平滑肌细胞数量。HL-60细胞数量的减少与绿茶儿茶酚浓度呈剂量效应关系。并发现绿茶儿茶酚对细胞活性氧的清除与剂量有关。

关 键 词 动脉粥样硬化; 细胞增殖; 绿茶儿茶酚; 活性氧

中图分类号 R965; Q27 文献标识码 A doi:10.3969/j.issn.1001-0548.2011.01.028

Effect of Green Tea Catechins on Vascular Cell Proliferation and Reactive Oxygen Species

YANG Hong and LIU Yi-yao

(School of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology of China Chengdu 610054)

Abstract One of the most important causes of the atherosclerosis is reactive oxygen species (ROS) to induce lipide overoxidation, which leads to endothelial cells dysfunction and vascular smooth muscle cells (VSMCs) abnormal proliferation. Recent investigations demonstrated that polyphenon has prevention effect in the treatment of atherosclerosis or other vascular diseases. In this paper, endothelial cells (ECs), VSMCs and HL-60 cell (as the abnormal cell model) were used to investigate the effects of green tea catechins on the proliferation. Furthermore, the clearance ability of ROS by catechins was detected by hypoxanthine-xanthineoxidase chemiluminescence method. It was found that the green tea catechins could lightly increase ECs proliferation at the concentration of 1 μg/mL, and green tea catechins of 1 and 3 μg/mL have no obvious effect on VSMCs proliferation. However, green tea catechins of 10 μg/mL significantly inhibited VSMCs proliferation. For HL-60 cells, the cell viability was presented in a dose-dependent manner. Similarly, the ROS clearance ability was also related to the dosage of green tea catechins.

Key words atherosclerosis; cell proliferation; green tea catechins; reactive oxygen species

收稿日期： 2009 ? 11 ? 16; 修回日期：2010 ? 03 ? 05 基金项目：国家自然科学基金(30700151)

作者简介：杨 红(1974 ? )，女，博士，主要从事生物物理和纳米医学等方面的研究.

心血管疾病是一类严重危害人们健康的疾病，

造成心血管疾病很重要的一个原因是动脉粥样硬

化。动脉粥样硬化指动脉内皮上由于脂质沉着，内

皮细胞纤维化，功能紊乱；中膜平滑肌细胞和弹性

组织变性，组织失去弹性，纤维组织取代弹性组织，引起动脉中膜病变。动脉粥样硬化的发生包括血液中脂质和活性氧反应，引起脂质过氧化，过氧化的脂质在内皮细胞上沉着，使内皮细胞受到伤害；在脂质沉积处，血小板富集，中膜平滑肌细胞向内皮细胞迁移并产生结缔组织，使内膜增厚。血液中的巨噬细胞聚集，并将过氧化的低密度脂蛋白吞噬，形成泡沫细胞，最终形成动脉硬化[1-2]。动脉粥样硬化的一个重要原因是中膜平滑肌细胞异常增殖，而多酚类物质能抑制这一过程。多酚是绿茶、红茶、乌龙茶、红葡萄酒等都含有的物质，它具有抗氧化作用，能够抑制动脉硬化初期低密度脂蛋白氧化的功效[3-5]。 中国是最早使用茶叶的国家，茶具有兴奋中枢神经系统、恢复疲劳、通便、利尿等生理功效。茶叶中有用的成分很多，如最早发现的咖啡因、单宁物质、儿茶酚类等多酚物质、维生素C 等。绿茶及抽提物含有的儿茶酚种类很多，有表儿茶酚、表没食子儿茶素、儿茶素多酚等[6]。近年来又发现绿茶有抗氧化作用，抗肿瘤细胞增殖，抑制血小板凝集等作用[7]。 活性氧是造成细胞老化、肿瘤发生、动脉硬化

电子科技大学学报第40卷148

的主要原因，生物体在代谢过程中产生活性氧。活性氧能造成机体多种损伤和病变，伤害生物体DNA 等生物大分子，加速机体的衰老。活性氧种类很多，如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基等。生物体本身具有清除多余自由基的能力，主要是靠内源性自由基清除系统，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶等酶和外源性的维生素C、维生素E、还原性谷胱甘肽、胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂[8]。儿茶酚类物质的抗氧化作用主要在于B环上的酚基能供给氢除去自由基。一分子的自由基与氢发生反应使自由基安定，连锁反应停止，生成酚氧自由基，最后生成稳定的醌类物质[9]。

本文使用的内皮细胞和中膜平滑肌细胞是从猪的主动脉分离得到。HL-60细胞是人急性骨髓性白血病患者末梢血分离的骨髓球样细胞，本文作为异常细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料

本文采用的内皮细胞及中膜平滑肌细胞均取自猪胸主动脉，HL-60细胞购自Gene Bank(Riken, Japan)；DMEM培养基及RPMI1640培养基购自Gibco (USA)；绿茶抽提物(Polyphenon100，含有多种绿茶儿茶酚类物质)、其中绿茶儿茶酚的两种主要成分是表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)及表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-gallate，EGCg)均购自Kurita Co. (Japan)。

1.2 内皮细胞原代培养

取猪胸主动脉，两端扎紧，将血液全部清除，然后浸泡于酒精，除菌。将血管切成适度长度的小段，沿血管长轴方向将血管切开，用手术刀片垂直轻刮血管内面，轻轻地剥离内皮细胞。将剥离下来的细胞块放置于15%胎牛血清、DMEM培养液(含1%氨苄青霉素-链霉素-谷氨酸盐)中悬浮。1 000转/min、离心5 min，去上清，加入新鲜的胎牛血清1 mL，悬浮细胞。将细胞悬液与培养液分别加入培养瓶中，在37℃、5%CO2的条件下进行培养。待细胞长满80%，传代培养，细胞数量足够多时，冻存细胞。

1.3 血管平滑肌细胞原代培养

本文通过外植块方法获取血管平滑肌细胞。如上所述，在刮取内皮细胞后，分别取出内膜和中膜，将中膜小心地剪成约3 mm2的小块，移植进入培养瓶中。每培养瓶中放置约10个小的外植块，加入DMEM 培养液，在37℃、5%CO2的条件下进行培养。传代及冻存方法同内皮细胞。

1.4 HL60细胞培养

HL60细胞在10%胎牛血清、RPMI1640培养液培养，传代及冻存方法同上。

1.5绿茶儿茶酚对内皮细胞、血管平滑肌细胞及HL60

细胞增殖的影响

绿茶抽提物Polyphenon100溶液以生理盐水配制，Polyphenon100溶液的终浓度分别为20、60、200、600、2 000 μg/mL。培养好的细胞用含0.02% EDTA的PBS 溶液清洗两次，加入0.2%胰酶溶液1 mL孵育5 min；待细胞脱落，加入胎牛血清混匀，中和胰酶。将细胞转移至离心管中2 000 转/min，离心5 min，移去上清；然后将细胞用培养液调整浓度至1.0×104、2.0×104、3.0×104 cells/mL共3个浓度。

将各浓度的细胞转移到24孔板中，每个浓度梯度的细胞分别有6个孔，每个孔里细胞体积为950 μL。然后向每孔中加入50 μL绿茶儿茶酚(Polyphenon100)溶液，使儿茶酚终浓度分别为None(+)、1、3、10、30、100 μg/mL。在None(+)中加入生理盐水作为对照，24 h后进行胰酶处理，染色，用TATAI型血细胞计数仪测量细胞数目。另外，表没食子儿茶素(EGC)及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCg)配制方法同Polyphenon100。EGC及EGCg对多种细胞增殖的影响的实验方法同上。

1.6 绿茶儿茶酚清除活性氧的实验

为了研究绿茶儿茶酚类物质清除活性氧的效果，本文采用次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系化学发光法来测定。次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应生成超氧阴离子自由基O?2，加入化学发光探针2-methyl-6-(p- methoxyphenyl)-3,7-dihydroimi-dazo[1,2-a]pyrazin-3-one (MCLA)。MCLA与O?2反应，脱氢、脱羰基，生成物由激发态回到基态，发光波长为465 nm，由闪烁计数器或荧光计数器测定，由此计算O?2的生成量[9-10]。将8 μL黄嘌呤氧化酶(10.4 U)、7 μL MCLA(1 μmol/L)、333 μL Tris-HCl(50 mmol/L)缓冲液、绿茶儿茶酚Polyphenon100溶液及适量双蒸水加入反应体系，混合2 min，最后加入次黄嘌呤100 μL(5×105 mol/L)，反应体系总体积为2 000 μL。在反应体系中，绿茶儿茶酚终浓度分别为3.63、7.25、12.50、25.00 μg/mL，空白对照为双蒸水；用Luminescence Reader(Aloka, Japan)测定发光强度。

第1期 杨红, 等: 绿茶儿茶酚对活性氧和血管细胞增殖的影响研究 149

2 结 果

2.1 Polyphenon100对各种细胞增殖的影响

Polyphenon100对内皮细胞增殖的影响如图1所示。在3个接种不同浓度(1.0×104、2.0×104、3.0×104 cells/mL)内皮细胞情况下，其细胞增殖趋势基本相同(结果未显示)。在Polyphenon100浓度为1 μg/mL 时，细胞增殖率略有增加；但Polyphenon100浓度超过3 μg/mL 后，细胞增殖率随浓度增加而明显减少，表明细胞的生长被较高浓度的Polyphenon100显著抑制。

None(+)

3 1 10 30 100

Polyphenon/μg ?mL ?1

0 20 40 60 80 100 120 140 细胞增殖率/(%)

图1 Polyphenon100对内皮细胞增殖率的影响

*P <0.05，**P <0.01 vs. None(+)

Polyphenon100对血管平滑肌细胞增殖的影响如图2所示。当Polyphenon100浓度小于3 μg/mL 时，细胞增殖率减少不明显；当Polyphenon100浓度大于

3 μg/mL 时，细胞增殖率随Polyphenon100浓度增加而显著减少。

None(+)

3 1 10 30 100

Polyphenon/μg ?mL ?1

20 40 60 80

100 120 140 细胞增殖率/(%)

图2 Polyphenon100对血管平滑肌细胞增殖率的影响

**P <0.01 vs. None(+)

Polyphenon100对HL-60细胞增殖的影响如图3所示。在加入生理盐水的情况下，细胞数量少量地增加，但差异无统计学意义。随着Polyphenon100浓度的增加，HL-60细胞增殖率受到明显的抑制。

None(+)

3 1

10 30 100Polyphenon/μg ?mL ?1

20406080100120细胞增殖率/(%)

图3 Polyphenon100对HL60细胞增殖率的影响

*P <0.05，**P <0.01 vs. None(+)

2.2 EGC 及EGCg 对各种细胞增殖的影响

EGC 和EGCg 是绿茶儿茶酚中的两种主要活性成份，以下实验比较了这两种成分对各种细胞增殖的影响。EGC 及EGCg 对内皮细胞增殖率的影响如图4所示。EGC 及EGCg 对内皮细胞的增殖有很大的影响，随着浓度的增加，内皮细胞增殖率减少。两者相比，EGC 的抑制效果更明显。 None(+)

3 1

10 30100Catechins/μg ?mL ?1

20406080100120140

细胞增殖率/(%)

EGCg EGC

图4 EGC 及EGCg 对内皮细胞增殖率的影响

*P <0.05，**P <0.01 vs. None(+)

None(+)

3 1

10 30 100

Catechins/μg ?mL ?1

020406080100120

140细胞增殖率/(%)

EGCg EGC

图5 EGC 及EGCg 对血管平滑肌细胞增殖率的影响

*P <0.05，**P <0.01 vs. None(+)

EGC 及EGCg 对血管平滑肌细胞增殖的影响如图5所示。随着EGC 和EGCg 的浓度增加，血管平滑

电 子 科 技 大 学 学 报 第40卷

150 肌细胞增殖率降低，在10 μg/mL 浓度以上，EGC 的抑制效果更明显。

EGC 及EGCg 对HL60细胞增殖率的影响如图6示。低浓度的EGC 及EGCg 能明显抑制HL60细胞的增殖，其中EGC 的抑制效果更明显。 None(+)

3 1 10 30 100

Catechins/μg ?mL ?1

20 40 60 80 100 120

细胞增殖率/(%)

EGCg EGC

图6 EGC 及EGCg 对HL-60细胞增殖率的影响

**P <0.01 vs. None(+)

2.3 Polyphenon100清除活性氧的实验

将发光强度读取的数值换算成活性氧的清除率，清除率为：

00%[()/]100%i I I I =?×清除率 式中，0I 为对照组发光强度值；i I 为实验组发光强度值[10]。Polyphenon100对活性氧清除的影响如图7所示。从图7可看出，Polyphenon100浓度为3.63 μg/mL 时，细胞中生成的活性氧清除率约为18%；Polyphenon100浓度为25 μg/mL 时，能清除细胞中生成活性氧的近70%。 Polyphenon/μg ?mL ?1

清除率/(%)

5 10 1520 25

30

0 10 20 30 40 50 60 70 80

图7 Polyphenon100对活性氧清除的影响

3 讨 论

绿茶抽提物Polyphenon100对血管平滑肌细胞增殖的影响结果表明，浓度小于或等于3 μg/mL 时，细胞增殖几乎不受影响；但大于该浓度以后，细胞增殖明显受到抑制。加入生理盐水对内皮细胞增殖

有轻微的抑制作用；但Polyphenon100浓度为1 μg/mL 时，细胞数量增殖，只是高于1 μg/mL 这个浓度后，内皮细胞的增殖明显受到抑制。而HL-60细胞随着浓度的增加，其增殖受到更大的抑制，有明显的浓度依赖效应。

当Polyphenon100浓度为1 μg/mL 时，内皮细胞数量增加的原因是绿茶儿茶酚有清除活性氧的功效。活性氧是好氧生物代谢过程中产生的一种副产物，是细胞老化、病变的原因之一。在内皮细胞培养的过程中添加Polyphenon100，使细胞周边乃至细胞内部的活性氧清除，细胞生存环境变好，细胞增殖，数量增加。实验和临床研究表明，儿茶酚类物质能显著地增强内皮的功能，为心血管疾病患者提供额外的好处，如EGCg 能增强内皮功能，降低高血压大鼠的血压[11]。

对于血管中膜平滑肌细胞，文献[12]发现儿茶酚能抑制血管紧张素II 刺激的血管平滑肌细胞增殖，通过抑制血管紧张素II 活化MAPK 途径和AP-1的信号通路来实现。本文的实验中，Polyphenon100浓度为1、3 μg/mL 对血管中膜平滑肌细胞的增殖都没有明显的抑制作用，其可能的原因是血管中膜平滑肌是正常动脉的重要组成细胞，与内膜平滑肌相比，其正常的增殖没有内膜平滑肌细胞快，所以呈现不了明显的抑制效果。

文献[13]采用儿茶酚类物质处理HL-60细胞，能够抑制HL-60细胞增殖，诱导其凋亡。细胞凋亡的原因是细胞核的片段化，核片段化呈时间依赖效应。另一方面，儿茶酚类物质对正常细胞系V79-4无细胞毒性 [13]

。Polyphenon100对HL-60细胞增殖起抑制作用，这可能与Polyphenon100引起了细胞DNA 的片段化有关。HL-60细胞是外膜平滑肌细胞的细胞模型，正常动脉几乎没有外膜平滑肌，正因为如此，HL-60细胞也被认为是一种异常的细胞模型，Polyphenon100也能抑制像HL60细胞一样的异常细胞的增殖。

EGC 及EGCg 对内皮细胞增殖的影响如下：

3 μg/mL 以上浓度对内皮细胞有明显的抑制作用；EGCg 浓度为1 μg/mL 时，与对照相比，增加了细胞增殖率，而EGC 没有明显变化。EGCg 引起内皮细胞增殖的原因与Polyphenon100的一样。

EGC 及EGCg 对中膜平滑肌细胞增殖的影响如下：EGCg 浓度为3 μg/mL 时，显著地抑制细胞增殖；

10 μg/mL 浓度时，EGC 比EGCg 的抑制率更高。

EGC 及EGCg 对HL-60细胞增殖的影响如下：与Polyphenon100一样，浓度越高，抑制效果越明显。

第1期杨红, 等: 绿茶儿茶酚对活性氧和血管细胞增殖的影响研究151

EGC及EGCg抑制HL-60细胞增殖的原因与Polyphenon100的一样，都可能是引起了细胞凋亡而导致增殖受到抑制。以上的实验主要是为了比较EGC及EGCg对细胞增殖的抑制作用的强弱。

从本文的实验结果可知，Polyphenon100清除活性氧呈浓度依赖关系，即随着Polyphenon100浓度的增加，其清除活性氧的能力也随之增加。为了降低活性氧自由基对人体的危害，除了依靠体内活性氧自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性活性氧自由基清除剂；利用这些物质作为替身，让它们与自由基结合，以阻断外界自由基的攻击，使人体免受伤害。

4 结论

综合上述实验结果可知，Polyphenon100浓度为1 μg/mL时，促进内皮细胞的增殖，对正常的中膜平滑肌细胞的增殖无影响，而对于异常细胞HL-60细胞有明显的抑制增殖作用；而且，随着Polyphenon100浓度的增加，其清除活性氧的能力也增强。对于正在进行的动脉粥样硬化，绿茶儿茶酚类物质能抑制脂质的过氧化，抑制内膜平滑肌细胞的增殖，促进内皮细胞增殖以修复破坏的内皮细胞，进而对预防疾病的进一步发生具有积极的作用。

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编辑黄莘

细胞增殖教学设计

浙科版·生物学·必修一 §4.1细胞的增殖 授课对象：高二年级 授课类型：新授课 课时：一课时 一、教材分析 《细胞的增殖》是浙科版高中生物必修一第四章第一节的内容，本节课涉及的主干知识有细胞周期的组成、细胞有丝分裂的过程以及有丝分裂过程中染色体数目和DNA数目的变化情况。教材对于有丝分裂的引出，首先介绍细胞周期的概念，即有丝分裂的准备阶段。观察植物细胞有丝分裂装片的实验，旨在能熟练地将理论知识运用到实践中，在观察中更形象地加深对有丝分裂过程的理解。本课时的内容学习对后续知识如细胞减数分裂的内容学习很有帮助，特别是要发掘其中蕴含的生物学方法和观点，对于学生生物科学素养的养成具有重要作用。 二、学情分析 根据本节课的授课对象是高二年级的学生，他们正处于皮亚杰的认知发展的形式运算阶段，已经具有较理性的逻辑思维能力，在教师的指导下能有自主学习和独立学习的能力。学生在之前已经学习了细胞的结构的内容，对细胞的内部结构如细胞质、细胞核较为熟悉，教师在讲授有丝分裂过程中只要说明过程经过，学生能较快理解有丝分裂过程中物质变化。通过学生实验，更能训练学生的动手能力，让学生在做中学。 三、教学目标 【知识与技能】 1.概述细胞有丝分裂的过程。 2.区别各时期细胞分裂图。

3.概述有丝分裂过程中染色体数目和DNA数目的变化规律。 【过程与方法】 1.经历抽象过程在脑中具体化的过程，有利于学生更好地学习以后更抽象的生物学知识。 2.通过对染色体模型的制作，培养学生对理论知识的运用和动手实践能力。 【情感态度价值观】 1.通过对有丝分裂意义的学习，体会生物自身发展的规律，培养对立统一和发展变化的观点。 2.建立起生物学基础理论，保持对生物学的兴趣，这样可以维持学生学习生物的热情。 四、重点难点 重点：细胞有丝分裂的过程 难点：细胞有丝分裂过程中各个时期染色体行为和数目的变化以及DNA数量的变化。 五、教法学法 【教法】问题导学法、传授法、讨论法、flash动画演示法 【学法】自主、探究、合作学习 六、教学过程 环节一：创设情境，导入新课（约3min） 【教师活动】 展示大小长颈鹿的图片，引导思考：在图片上你发现了什么？能得到什么结论。 【学生活动】 回答：两者个体大小不同 【教师活动】 归纳阐述：两者个体大小不同的根本原因是成年长颈鹿的细胞数目比幼年的要多，而细胞数目的增多是细胞有丝分裂的结果。今天，我们就来讨论一下细胞的有丝分裂过程。 引导讲授:前面我们已经学习了细胞周期的内容，知道了分裂间期为细胞分裂期准备好了双

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再扩大，有些可以自行消退，较大或广泛者可持续终生。 b.单纯性血管瘤：又称毛细血管瘤或草霜状瘤，表现为一个或数个鲜红色半球形柔软而分叶状肿瘤，多在出生时或出生后3-5周出现，生长速度快，在部分在1岁内长到最大限度，可消退，少数并发海绵状血管瘤。 c.海绵状血管瘤：常发生在皮下和粘膜下，可深达肌层，多在出生时或出生后不久发生，好发于头部和面部，损害为红色、紫红色、深紫色，呈扁平状、半球形、结节形，不规则形，指头大至鸡蛋大，边界清楚或不清楚，触之柔软似海绵样，压之缩小，去压后恢复，增大时可破溃或继发感染。 d.混合型：由两种类型的血管瘤同时存在，而以一型为主。 上面已经为您介绍了什么是浅表性毛细血管扩张，可见这是很严重的一种肌肤疾病，大家一定要慎重对待，日常一定要好好的呵护疾病，不使用装量差的化妆品，也不要随便什么东西都往身上抹，以免滋生细菌，诱发肌肤疾病，祝您身体健康。

细胞培养技术在医药研究中的应用

细胞培养技术在医药研究中的应用 摘要：近年来，动物细胞培养技术在生物制药领域成为最受关注的热点之一，动物细胞培养技术广泛应用于动物细胞高密度培养，推动了现代生物医药 产业的发展。动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外模拟体内的: 生理环境 , 在无菌、适宜的培养条件下生长、繁殖的过程。利用人工培养的动物细胞可以进行科学研究和生物制药, 动物细胞的大规模的培养技术是生物制药中非 常重要的环节。在动物细胞培养过程中, 最重要的是使细胞的培养条件达到最 优化程度, 尽可能消除或减轻环境对细胞的影响, 因此动物细胞培养环境的控 制是细胞培养的关健技术。 关键词：动物细胞培养技术，生物制药，培养条件,人工培养。 自1885 年，Roux 从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养; Dulbecco于1943 年创建单层细胞培养已有半个多世纪。因其具有的培养简单、操作方便、消耗少、大量运用等优点，被广泛运用于生命科学的各个领域[1]。全球生物制药技术和市场的迅速发展为动物细胞培养基市场提供了快速成长的发展环境， 并使之保持强劲的发展势头。 1 细胞培养的环境及条件 1.1 无污染的环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件[3]。 1.2 适宜的温度 维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同[3]。 1.3 气体环境和氢离子浓度 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一, 所需气体主要有氧气和二氧化碳[3]。 1.4 适宜的p H 值 每种细胞都有其最适p H 值。p H 值随培养的细胞种类不同而不同, 大多数细胞的适宜pH 为7.2至7.4, 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响[3]。 1.5 培养基 培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质, 而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境[3]。 1.6 细胞培养外部环境 细胞培养是一种无菌操作技术, 对实验室、常用设施及设备、培养器皿等都有严格的要求[3]。 2 细胞培养无菌操作基本技术无菌操作技术分为: 工作环境及表面、细胞培养所用器皿、培养液与培养细胞的处理。 2.1 工作环境的处理 使用层流超净工作台是最经济有效的手段[3]。 2.2 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒 消毒方法分为物理灭菌法( 紫外线、湿热、干烤、过滤等), 化学灭菌法( 各种化学消毒剂) 和抗生素三类。[3] 细胞培养基的质量标准及产品质量控制参考国内外细胞培养基产品企业标 准的现状，着重考虑了生物制药用户对产品质量的要求以及《中华人民共和国

第11讲细胞增殖

第11讲 细胞增殖 考纲解读：细胞的生长和增殖的周期性（A ） 细胞都有丝分裂（B ） 细胞的无丝分裂（A ） 基础知识回顾： 一、细胞不能无限长大 1．多细胞生物体体积的增大，即生物体的生长，既靠 增大细胞的体积，还要靠 增加细胞的数量。 2．细胞不能无限长大的原因 ① ② 思考：细胞是不是越小越好呢？为什么？ 二、细胞通过分裂进行增殖 1． 细胞增殖的方式： 。细胞增殖包括： 和 整个连续的过程。 2． 真核细胞增殖方式： 、 、 。 3． 细胞增殖意义：重要的细胞生命活动，是生物体 、 、 、 的基础。 三、有丝分裂 1.真核生物进行细胞分裂的主要方式是 。细胞进行有丝分裂具有周期性。 2.细胞周期 （1）概念： 的细胞，从一次分裂 开始，到下一次分裂 为止，为一个细胞周期。一个细胞周期包括两个阶段分裂间期和分裂期。 （2）图例（写出各图中表示分裂间期、分裂期和细胞周期的过程） 直线图 扇形图 分裂间期： 分裂间期： 分裂期： 分裂期： 细胞周期： 细胞周期： 曲线图 该图中表示细胞周期的是： 注意： 、 没有细胞周期， 高度分化的细胞脱离细胞周期。 3． 分裂间期（以高等植物有丝分裂为例，体细胞中染色体数目为2N ，N=2） 特点：①完成 的复制和有关 ② 细胞有适度生长 4． 分裂期 （1）前期——膜仁消失现两体 特点：①两核消失，两体出现

②染色体分布在纺锤体中央 （2）中期——形定数晰赤道齐 特点：①染色体的着丝点排列在 ②染色体形态稳定、数目清晰，是观察染色体的最佳时期 （3）后期——点裂数加均两极 特点：①着丝点分裂成两个（一分为二），姐妹染色单体变成两条子染色体， 使 （4）末期——兩消两现质分离 特点：①两体消失，两核出现 ②赤道板位置出现进而向四周扩展形成新的。 任务一.依据上述表格完成相关曲线图

细胞生物学研究技术答案

第四章细胞生物学研究技术 一、填空 C-四-1.一般观察培养的活细胞用相差显微镜，各种细胞工程中显微操作时用激光扫描共焦显微镜、分辨干涉差显微镜，用荧光染料对细胞结构标记后观察用荧光显微镜。 C-四-2.由起始实验材料所进行的细胞培养叫原代培养，对已有细胞进行的继续培养叫传代培养。 C-四-3.由单一类型的细胞所组成的细胞系称为细胞株。 C-四-4.处于对数生长期的细胞群体，当它的细胞数量增加一倍所需要的时间称为群体倍增时间。 C-四-5.两个或两个以上细胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象称为细胞融合。 D-四-1.激光扫描共聚焦显微镜的主要用途有：①荧光检测；②细胞结构的三维重现；③显微操作。 D-四-2.细胞器和大分子的离心分离方法常用有：①差速离心；②密度梯度离心。 D-四-3.常用的离心分离方法包括：①差速离心；②密度梯度离心。 D-四-4.双向电泳的操作可以分成两部分，第一步是等电聚焦，第二步是SDS-PAGE 。 二、单项选择 A-四-1.下列显微镜中，可以对活细胞进行观察的是（ C ）。 A 普通光学显微镜 B 荧光显微镜 C 相差显微镜 D 电子显微镜 A-四-2.下列显微镜中，可以用于细胞工程中显微操作的是（ C ）。 A 普通光学显微镜 B 荧光显微镜

C 微分干涉显微镜 D 电子显微镜 A-四-3.下列显微镜中，用于荧光染料标记细胞结构后观察的是（ A ）。 A 荧光显微镜 B 普通光学显微镜 C 相差显微镜 D 电子显微镜 A-四-4.冷冻蚀刻技术是（ B ）样品制备的一种方法。 A 普通光镜 B 透射电镜 C 暗视野显微镜 D 相差显微镜 A-四-5.群体倍增时间越短，表明细胞的增殖速度（ A ）。 A 越快 B 越慢 C 维持不变 D 无关 A-四-6.如果一种细胞在体外不能传代，或者只能传少数几代，就可以将其称为（ A ）。 A 有限性细胞系 B 永生性细胞系 C 转化性细胞系 D 细胞株 A-四-7.如果一种细胞在体外能无限的传代，永远的活下去，就可以将其称为（ B ）。 A 有限性细胞系 B 永生性细胞系 C 转化性细胞系 D 细胞株 B-四-1.有关体外培养细胞，下列说法不正确的是（ D ）。 A 可根据需要人为地建立培养条件，来观察和研究细胞生命活动的规律 B 通过传代培养可获得研究所需要的细胞量 C 可摆脱活体组织的复杂背景 D 可获得与其在活体组织中完全相同的实验结果 B-四-2.在制备单克隆抗体的过程中，使得与骨髓瘤细胞发生融合的细胞是（ A ）。 A B淋巴细胞 B T淋巴细胞 C 巨噬细胞 D 粒细胞 B-四-3.要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过（ C ）技术实现。 A Southern blot B Northern blot C Western blot D 原位分子杂交 DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印

第一节细胞增殖的教学设计

第一节《细胞的增值》的教学设计 孝义三中高一生物组孟春香 一、教材分析分析 本节课是人教版普通高中生物必修1《分子与细胞》第六章第一节的内容。本节主要讲述了细胞的增值、细胞周期、有丝分裂与无丝分裂，是以后学习减数分裂和遗传规律的基础，也为后面的细胞分化、细胞的衰老和死亡打下铺垫。本节课涉及到的内容与前几章所学的细胞器功能的知识融会贯通，进一步掌握以往的知识，有利于学生用学过的知识解释生命现象，在教材中起着重要的作用。 本节的核心问题如下： 1.细胞问什么不能无限长大呢？ 2.细胞通过什么方式增值？主要方式是什么？什么叫细胞周期？ 3.细胞有丝分裂的过程是怎样的？它有什么生物学意义？ 二、学生分析 因为高一年级的学生生物学基础知识很少，因此，要像对初学生物学的学生那样对待。在教学过程中可以利用前五章学生对于细胞的结构和功能的学习展开，通过适当的策略使新知识融入到原有的知识网络中。虽高一的学生已有较强的抽象思维能力与综合思维能力，但本节内容确实抽象，估计学生对细胞分裂过程中DNA和染色体数的变化难理解，对于有丝分裂各个过程所出现的一系列现象，学生可能仍无法想象清楚，或无法将几个时期的事件串联成一条直链，因此，在教学中可用课件演示的方式使抽象的内容具体化，连续化，复杂的问题简单化。令教学中充分体现以问题解决为核心的课改理念，体现学生的主体地位和教师的主导地位，调动学生的积极性。 三、教学目标 （1）细胞增殖的方式和意义。 （2）细胞周期的概念，植物细胞有丝分裂的过程。 （3）理解植物细胞有丝分裂过程中染色体、DNA的变化规律。 （4）能够通过小组讨论和总结发言体验合作学习的过程和方法。 （5）通过有丝分裂动画的展示培养观察和获取信息的能力。 （6）养成质疑、严谨、求实、创新及勇于实践的科学态度和科学精神。 四、教学重点与难点 1.教学重点 （1）细胞生长和增殖的周期性。 （2）真核细胞有丝分裂的过程。 2.教学难点 真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体行为和数目的变化，以及DNA数量的变化。 3.学生学习重点 （1）细胞为什么要进行分裂？ （2）细胞有丝分裂的过程是什么？ 4. 学生学习难点

细胞衰老与肿瘤的发生的研究进展

细胞衰老与肿瘤的发生的研究进展 广东药科大学公共卫生学院卫生检验与检疫15 戚嘉铭 【摘要】近几年，细胞衰老成为一种针对癌细胞永久性生长的治疗肿瘤新途径，一直是细胞生物学家的研究重点。研究发现，细胞衰老可以作为阻碍癌细胞致癌的抑制机制。原因在于癌基因诱导具有双向性，癌基因的活化可以诱导细胞衰老。但研究发现，细胞衰老同样可能促使癌细胞的增值。 【关键词】细胞衰老肿瘤癌细胞 细胞衰老是生物体中普遍存在的一种永久性生长抑制现象，能够防止老化的或非正常细胞的进一步生长，对抗细胞的无限增殖能力而对机体起到保护作用。因此，死亡的细胞衰老与无限增殖的癌细胞一直都是细胞生物学家们致力研究的重点。本文主要是描述探究决定细胞走向衰老还是转为癌细胞的因素的相关研究进展。 1、细胞衰老:一种阻碍癌细胞致癌的机制 在多种衰老细胞中,某些抑癌基因的过表达会引起细胞进入衰老程序,细胞绕过衰老途径是其永生化及癌变的必要条件,因而细胞复制性衰老是抑制肿瘤的一种可能机制.这样对衰老细胞的研究将为肿瘤的预防和治疗方法提供新的策略[12]。细胞衰老是人体防癌的机制之一,研究细胞衰老对于抗肿瘤是很有意义的,同时为打开抗肿瘤药物治疗和新药的研发提供了依据。 1961年,Hayflick在体外培养成纤维细胞的研究中发现,正常二倍体细胞在体外条件下增殖分裂50~70代即进入一种衰老的状态,无法进一步传代培养,但仍然存活.正常的动物细胞无论是在体内生长还是在体外生长,其分裂次数总存在一个"极限值",此值被称为"Hayflick"极限,亦称最大分裂次数[11].研究表明，恶性肿瘤细胞系会发生自发性老化,其程度与细胞系种类有关.短期饥饿培养会明显增加老化细胞所占的比率,提示饥饿诱发细胞老化可能是抗肿瘤治疗的又一快速、简单且有效的途径[13]。 2、癌基因诱导的双向性 在人部分的肿瘤中都发现有癌基因的活化，癌基因的活化被认为是导致肿瘤发生的重要原因。然而，在野生型细胞内，癌基因的活化可以诱导细胞衰老，称为癌基因诱导的细胞衰老(oncogene-induced senescence, OIS)[1]。癌基因诱导的衰老( OIS)是指癌基因突变所产生的异常增殖信号，通过MAPK和PI3 K信号通路，使细胞处于生长停

小血管增生的原因

小血管增生的原因 随着社会主义的发展，人们的生活水平取得了显著提高。随着各种工作和学习压力的加重，越来越多的疾病和病菌开始侵袭到我们全身。人们总皂想尽一切办法去改善，但是最终的结果并不太理想。这些疾病使我们精神无法集中，并且给我们感觉极其烦恼和痛苦。那么小血管增生的原因? 指通过内皮细胞的增殖和迁移,从原先存在的血管处以出芽或套迭方式生成新的血管.受一系列刺激和抑制因子调节。 先天性静脉壁薄弱和静脉瓣膜结构不良是发病的主要原因。重体力劳动，长时间站立和各种原因引起的腹腔压力增高等，均可使瓣膜承受过度的静脉压力，在瓣膜结构不良的情况下，可导致瓣膜关闭不全，产生血液反流，由于浅静脉管壁肌层薄且周围缺少结缔组织，血液反流可引起静脉增长增粗，出现静脉曲张，由于下肢静脉压的增高，在足靴区可出现大量毛细血管增生和通透性增加，产生色素沉着和脂质硬化。由于大量纤维蛋白原的堆积，阻碍了毛细血管与周围组织间的交换，可导

致皮肤和皮下组织的营养性改变。 血管增生的预防方法：饮食均衡，适量运动，适当补充维生素。 生理性血管增生是由本来静止的内皮细胞滋生出十分规则 的毛细血管网。肿瘤血管增生对超过数毫米直径实体瘤的生长至关重要。积极治疗原发病可最大限度的预防该疾病的发生。 血管增生是指由现有的血管网生出新的微血管，它对组织的再生、发育、修复来说都是关键性的。生理性血管增生是由本来静止的内皮细胞滋生出十分规则的毛细血管网。肿瘤血管增生对超过数毫米直径实体瘤的生长至关重要。指通过内皮细胞的增殖和迁移，从原先存在的血管处以出芽或套迭方式生成新的血管。受一系列刺激和抑制因子调节。 看了上述对于小血管增生的原因的介绍后，我想大家应该已经有所了解了吧。关于小血管增生的原因有很多，我们要正确认识和掌握该种疾病的知识，并根据其病因和病症采取相对应的措施去进行针对性的治疗。所以我们要好好注意身体，好好保护它。

毛细血管(二)

毛细血管（二） 毛细血管（capillary）是管径最细，分布最广的血管。它们分支并互相吻合成网（图8－8）。各器官和组织内毛细血管网的疏密程度差别很大，代谢旺盛的组织和器官如骨骼肌、心肌、肺、肾和许多腺体，毛细血管网很密；代高血压较低的组织如骨、肌腱和韧带等，毛细血管网则较稀疏。 图8-8 人胃粘膜血管铸型扫描电镜像示毛细血管网 （一）毛细血管的结构 毛细血管管径一般为6～8μm，血窦较大，直径右达40μm。毛细血管管壁主要由一层内皮细胞和基膜组成。细的毛细血管横切面由一个内皮细胞围成，较粗的毛细血管由2～3个内皮细胞围成。内皮细胞基膜外有少许结缔组织。在内皮细胞与基膜之间散在有一种扁而有突起的细胞，细胞突起紧贴在内皮细胞基底面，称为周细胞（pericyte）（图8－9，8－10）。周细胞的功能尚不清楚，有人认为它们主要起机械性支持作用；也有人认为它们是未分化的细胞，在血管生长或再生时可分化为平滑肌纤维和成纤维细胞。 图8-9 毛细血管扫描电镜像示周细胞 P 周细胞胞体 1、2周细胞突起

图8-10 毛细血管电镜像 左图连续毛细血管，中图有孔毛细血管，右图毛细血管扫描电镜像示内皮孔 E 内皮细胞，P周细胞，↑内皮细胞孔 (二)毛细血管的分类 光镜下观察，各种组织和器官中的毛细血管结构相似，但在电镜下，根据内皮细胞等的结构特点，可以将毛细血管分为三型。 1．连续毛细血管连续毛细血管（continuous capillary）的特点为内皮细胞相互连续，细胞间有紧密连接等连接结构，基膜完整，细胞质中有许多吞饮小泡。连续毛细血管分布于结缔组织、肌组织、肺和中枢神经系统等处。肺和中枢神经系统内的毛细血管内皮细胞甚薄，含吞饮小泡较少（图8－10）。 2．有孔毛细血管有孔毛细血管（fenestrated capillary）的特点是，内皮细胞不含核的部分很薄，有许多贯穿细胞的孔，孔的直径一般为60～80nm（图8－10）。许多器官的毛细血管的孔有隔膜封闭，隔膜厚4～6nm，较一般的细胞膜薄。内皮细胞基底面有连续的基板。此型血管主要存在于胃肠粘膜、某些内分泌腺和肾血管球等处。肾血管球的内皮细胞的孔没有隔膜。 3．血窦血窦（sinusoid）或称窦状毛细血管（sinusoid capillary），管腔较大，形状不规则，主要分布于肝、脾、骨髓和一些内分泌腺中。血窦内皮细胞之间常有较大的间隙，故又称不连续毛细血管（discontinuous capillary）。不同器官内的血窦结构常有较大差别，某些内分泌腺的血窦，内皮细胞有孔，有连续的基板；有些器官如肝的血窦，内皮细胞有孔，细胞间隙较宽，基板不连续或不存在。脾血窦又不同于一般血窦，其内皮细胞呈杆状，细胞间的间隙也较大。 （三）毛细血管与物质交换 毛细管是血液与周围组织进行物质交换的主要部位。人体毛细血管的总面积很大，体重60kg的人，毛细血管的总面积可达6000m2。毛细血管管壁很薄，并与周围的细胞相距很近，这些特点是进行物质交换的有利条件。 物质透过毛细血管壁的能力称毛细血管通透性（capillary permeability）。毛细血管结构与通透性关系的研究表明，内皮细胞的孔能透过液体和大分子物质，吞饮小泡能输送液体，细胞间隙则因间隙宽度和细胞连接紧密程度的差别，其通透性有所不同。基板能透过较小的分子，但能阻挡一些大分子物质。另外一些物质，如O2、CO2和脂溶性物质等，可直接透过内皮细胞的胞膜和胞质。

细胞增殖及其调控

第十二章细胞增殖及其调控 主要内容 ●细胞增殖(cell proliferation)的意义 ●细胞周期与细胞分裂 ●细胞周期调控 细胞增殖(cell proliferation)的意义 ◆细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，是生物繁育的基础。 ◆单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。 ◆多细胞生物由一个单细胞(受精卵)分裂发育而来，细胞增殖是多细胞生物繁殖基础。 ◆成体生物仍然需要细胞增殖，主要取代衰老死亡的细胞，维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。 ◆机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等，都要依赖细胞增殖。 ◆细胞增殖受到严密的调控。 第一节细胞周期与细胞分裂 ●细胞周期(cell cycle)概述 ●有丝分裂(mitosis) ●胞质分裂(Cytokinesis) ●减数分裂(Meiosis) 细胞周期调控的主要研究内容 一、寻找与细胞周期调控密切相关的基因及其表达蛋白，研究它们在细胞周期中的动态变化及相互作用的规律。 二、这些基因和蛋白如何启动和影响细胞周期各时相发生的分子事件，进而影响细胞周期的表型。 三、内外环境因素是怎样通过细胞内信号传递系统影响细胞周期的。 第二节细胞周期的调控(Cell-Cycle Control) ●细胞周期调控系统的主要作用 ●细胞周期检验点(Cell Cycle Checkpoint) ●MPF ●Cyclin-Cdk复合物的多样性及细胞周期运转 ●细胞周期运转的阻遏(细胞周期运转的负调控) 一、细胞周期(cell cycle)概述 ●细胞周期 ●细胞周期中各个不同时相及其主要事件 ●细胞周期长短测定 ●细胞周期同步化 ●特异的细胞周期 二、有丝分裂(mitosis) ●前期(prophase) ●前中期(prometaphase) ●中期(metaphase) ●后期(anaphase) ●末期(telophase)

肿瘤的发生与发展

肿瘤的发生与发展 肿瘤的定义：肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。 过程：局部组织的细胞—基因突变—细胞异常增生—新生物—局部肿块 发病机制：肿瘤的发病是一个多因素、多步骤参与的过程。 恶性肿瘤的病因（尚未完全了解）， 1.环境因素：化学，物理，生物因素 2.机体因素 化学致癌 化学致癌物：目前认为凡接触引起人或动物形成肿瘤的化学物质，称为化学致癌物（chemical carcinogen）。目前发现对动物有致癌作用的化学物质已达2000余种，其中有些可能和人类肿瘤的形成有关 分类：1。作用分式：直接致癌物，间接致癌物，促癌物 2.与肿瘤的关系：肯定致癌物，可疑致癌物，潜在致癌物 ? 1.直接致癌物：进入机体后与细胞直接作用，诱导细胞癌变的化学物质。 ? 2.间接致癌物：进入体内经微粒体氧化酶活化，变成具有致癌作用的化学物质 ? 3.促癌物：能促进其他致癌物诱发肿瘤形成的化学物质 ? 4.肯定致癌物（defined carcinogen）经流行病学调查确定，临床医师和科学工 作者都承认对人和动物有致癌作用，其致癌作用具有剂量反应关系的化学致癌物。 ? 5.可疑致癌物（suspected carcinogen）具有体外转化能力，而且接触时间和发 病率相关，动物致癌实验阳性，结果不恒定，且缺乏流行病学方面的证据。 ? 6.潜在致癌物（potential carcinogen）是在动物实验中可获得某些阳性结果， 但在人群中尚无资料证明对人具有致癌性的物质。 １、化学致癌物的作用点：为细胞的癌基因和抑癌基因 ２、作用：使癌基因激活，抑癌基因失活。 １、累积作用:(summation effect) 是指两种或多种致癌物同时或相继作用于机体，其复合效应等于单独作用之和２、协同作用:(synergistiic effect) 机体同时暴露于几种致癌物中其致癌作用高于个单独致癌物作用之和 常见的化学致癌物：多环芳香烃类，芳香胺与偶氮染料，亚硝胺类 化学致癌例子。苯胺染料：膀胱癌，烟草：肺癌，黄曲霉素：肝癌 物理致癌 1.电离辐射是最主要的物理性致癌因素 2.放射性同位素：镭、铀、氡等放射性同位素 3.紫外线：皮肤癌，着色性干皮病 病毒致癌 1/3为DNA病毒，2/3为RNA病毒 ?一、乳头状瘤病毒与宫颈癌（HPV） ?二、乙型肝炎病毒与肝癌（HBV） ?三、EB病毒与鼻咽癌和Burkit肉瘤（EBV） ?四、HTL V与人类T细胞白血病（HTL V） 致瘤性DNA病毒

小鼠肺微血管内皮细胞使用说明

小鼠肺微血管内皮细胞 小鼠肺微血管内皮细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肺微血管内皮细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肺微血管内皮细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞

仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响(精)

仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响 作者：金照，金可可，陈雷，刘长宝 【摘要】目的：观察仙人掌对体外培养成纤维细胞增殖的影响及其量-效关系。方法：以小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)为研究对象，采用四氮唑盐(MTT) 比色法测定仙人掌对成纤维细胞增生的影响(以OD值反映细胞活性)，采用免疫细胞化学染色法检测成纤维细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果：在一定浓度范围内(0.0625～0.5 mg/mL)，仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖，同时促进PCNA蛋白的表达，并随着仙人掌浓度的增加，成纤维细胞数量和PCNA蛋白的表达均不断增加，在0.5 mg/mL浓度时达到高峰，呈现明显的剂量-效应关系(r分别为0.761，0.783;P均<0.01)。结论：在一定浓度范围内，仙人掌具有促进体外培养成纤维细胞增殖的作用，并表现为明显的量-效关系。 【关键词】仙人掌;成纤维细胞;增殖 Abstract: Objective: To explore the effects of Opuntia on fibroblast proliferation in vitro and its concentration-effect relationship. Methods: The effects of Opuntia on proliferation of fibroblast were measured with MTT colorimetric assay，and PCNA productions were examined with immunocytechemistry. Results: Opuntia could provoke fibroblast proliferation and increase PCNA protein expression in concentration range 0.0625～0.5 mg/mL. Furthermore，the effects exhibited a significant concentration-dependent relationship (r =0.761，0.783 respectively，P <0.01). Conclusion: Opuntia can provoke fibroblast proliferation within a certain concentration range， which exhibits a significant concentration-effect relationship. Key words: Opuntia;fibroblast;proliferation 仙人掌(Opuntia)，又名神仙掌、老鸦舌、观音掌等，已经被用来治疗糖尿病、溃疡等症[1-2]。仙人掌治疗胃溃疡的机制可能与成纤维细胞的增殖有关[3]。近几年来，虽然仙人掌的药理作用已成为医学热门研究方向，但有关仙人掌对体外培养的成纤维细胞增殖的影响未见报道。本研究以体外培养成纤维细胞为实验对象，观察仙人掌对成纤维细胞生长增殖的影响及其量-效关系。 1 材料和方法 1.1 材料小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)购自上海肯强仪器有限公司，鼠抗人PCNA单克隆抗体及其他试剂均购自武汉博士德生物有限公司。仙人掌干粉为鲜茎片80 ℃烘干制成，由福州日冕科技开发有限公司生产提供。

细胞增殖实验word版

细胞增殖检测方法 细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP 浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。 1.DNA合成检测 这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。 2.代谢活性检测 检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。 四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT 主要作为终点检测方法。其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue 的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、

表现为内皮细胞病的Castleman病临床分析(一)

表现为内皮细胞病的Castleman病临床分析(一) 【摘要】目的提高对表现为内皮细胞病的Castleman病的认识。方法对3例肾病病理表现为内皮细胞病的Castleman病进行病例分析，并复习国内外有关文献。结果3例Castleman病患者，临床分型均为多中心型，主要表现为乏力、全身浅表淋巴结肿大、脾大、轻度贫血、血尿、蛋白尿和C反应蛋白增高，临床诊断2例为慢性肾脏病，1例为急性肾衰竭。结论肾脏病理表现为内皮细胞病的Castleman病临床表现多样，极易漏诊，诊疗工作中如遇肾脏病变伴淋巴结肿大病例，应尽早行淋巴结活检，以期能早期诊断，及时明确治疗方案。 【关键词】巨大淋巴结增生;内皮细胞病;临床分析 Castleman病又称血管滤泡性淋巴组织增生或巨大淋巴结增生，是一种临床少见的以淋巴结肿大为特征的慢性淋巴组织增生性疾病，临床表现多样，主要表现为乏力、全身浅表淋巴结肿大、脾大、轻度贫血、血尿、蛋白尿和C反应蛋白增高，极易漏诊，为提高对Castleman 病的认识，笔者结合相关文献对近年来我院确诊的3例表现为内皮细胞病的Castleman病的临床资料进行分析，现报道如下。 临床资料 1.病例1患者，丁某某，男，51岁，农民。因“间断发热、浮肿5个月，血肌酐高、血小板低1个月”入院。患者5个月前出现上腹胀痛、发热，当地B超示“胆囊炎”，治疗7天热退，出现颜面浮肿及“蛋白尿”，服40付中药(具体不详)后水肿消退，但上腹痛未缓解而来本院就诊。病后觉双手麻木，尿量600～900ml/d。既往史：15年吸烟史，20支/天，父亲因“血压高”去世，姐姐患“肾炎”。查体：BP120/90mmHg，全身皮肤稍黑，颈后、锁骨上、双腋下、腹股沟均可触及0.5～1cm淋巴结，可活动，质地中等，无压痛，两肺闻细小湿啰音，余(-)。主要实验室检查结果：血常规：血红蛋白87g/L，血小板16×109/L;小便常规：蛋白(+++)，红细胞(++)，24小时尿蛋白定量 1.39g;血浆白蛋白25g/L，血沉(ESR)35mm/h，C反应蛋白(CRP)75mg/L，血肌酐518μmol/L，肾小球滤过率(GFR)31.5ml/(min·1.73m2)，乳酸脱氢酶536μmol/L，肝功能正常，免疫球蛋白IgA、IgG、IgE明显升高，自身免疫、风湿、ANCA、血尿免疫电泳等检查均阴性。B超示：①全身浅表多发淋巴结肿大;②腹水;③脾大。淋巴结病理：表现为淋巴滤泡增生，生发中心形成，毛细血管穿入滤泡。毛细血管壁增厚并玻璃样变，滤泡的套区小淋巴细胞增生常呈同心圆排列，呈葱皮样结构，滤泡间大量毛细血管后微静脉增生，符合透明血管型Castleman病。肾病理：免疫荧光IgM2+颗粒样、团块样系膜区、毛细血管壁沉积，光镜毛细血管腔可见微血栓形成，结合光镜、电镜：考虑为内皮细胞病(透明血管型)。临床诊断：①Castleman病(透明血管型);②血栓性微血管病，③急性肾衰竭。入院后予甲基强的松龙冲击治疗1疗程(0.5g/d×3d)，并予强的松60mg/d+长春新碱1mg/周，化疗1周后淋巴结明显缩小，色素沉着减轻，血小板76×109/L，血肌酐118μmol/L，CRP 2.21mg/L，IgA2.04g/L，IgG11.8g/L，C30.63g/L。 2.病例2患者，张某某，女，36岁，农民。因“间断头晕、头痛3年，颜面、下肢肿2年”入院。患者3年前间断出现头晕、头痛，血压未测，2年前久坐后出现双下肢水肿，尿色深黄，伴腹胀、乏力，均未行诊治，1年前右眼视力下降，接触冷水后觉双手麻木，当地医院检查为“尿蛋白(++)，肾功正常，血压高并有眼底出血”(具体不详)，按“慢肾”治疗(卡托普利+中药)，查“肌酐高”加用硝苯地平、雷米普利治疗后血压140/90mmHg，为明确诊断而就诊。病后无明显少尿、多尿。查体：BP130/80mmHg，双颈部褐色片状斑，颈、锁骨上、双腋下、腹股沟均可触及1～2cm淋巴结，可活动，质地中等，无压痛，余(-)。实验室检查结果：血常规：血红蛋白96g/L，血小板116×109/L;小便常规：蛋白(++)，红细胞(+)，24小时尿蛋白定量1.2g;血浆白蛋白29g/L，血沉(ESR)25mm/h，C反应蛋白(CRP)15mg/L，血肌酐98μmol/L，肾小球滤过率(GFR)80.5ml/(min·1.73m2)，肝功能正常，自身免疫、风湿、ANCA、血尿免疫电泳等检查均阴性。B超示：①全身浅表多发淋巴结肿大;②腹水;③脾大。淋巴结病理：

细胞增殖教案一

第一节细胞增殖（有丝分裂）教案 卞祥 一、教材分析 细胞都是通过细胞分裂产生的，细胞分裂是生物体生长、发育和生殖的基础。。在细胞增殖这一部分中，有丝分裂是教学重点也是教学难点，是学生理解细胞生命历程中的一个非常重要的基础知识。同时又是学生后面学习减数分裂的理论基础。并且也便于学生理解在模块二中遗传的基本规律和生物变异，所以在知识的学习上起着承上启下的重要作用。 二、教学目标 知识目标 1、理解细胞周期的概念。 2、准确描述细胞有丝分裂各阶段的重要特征。 3、掌握有丝分裂的过程、特征和意义。 情感目标 1、通过对细胞周期以及有丝分裂过程中DNA和染色体的规律性变化的学习，培养学 生树立唯物主义的世界观。 2、通过对实验思路的分析和对实验现象的观察培养学生实事求是的科学态度 三、教学重点难点： 重点：1、细胞周期的概念。 2、细胞有丝分裂过程以及有丝分裂的特点 3、有丝分裂过程中DNA和染色体的规律性变化。 4、细胞分裂的意义 难点：1、细胞周期的概念。 2、细胞有丝分裂的特点及意义 3、有丝分裂过程中DNA染色单体和染色体的数量变化规律及其相互间的关系 四、教学方法 1.讲授法与讨论相结合 2.直观式教学为主，结合启发式教学 3.PPT幻灯片、有丝分裂的flash动画 4.随堂巩固练习 五、课时安排1课时 六、教学过程： 导入：温故知新： 1提出细胞增殖的方式？有几种？ 2回顾植物细胞结构图，以及染色体染色质DNA,及姐妹染色单体的关系学生回答 学点一细胞增殖的周期性学生阅读P112第四自然段并讨论： 1、学生分析有关文字描述找出关键词语（什么样的细胞？起、止的标志？为何这样划分？）

《卡瑞利珠单抗致反应性皮肤毛细血管增生症临床诊治专家共识》(2020)要点

《卡瑞利珠单抗致反应性皮肤毛细血管增生症临床诊治专 家共识》（2020）要点 近年来，采用新型免疫方法和药物，特别是免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗多种恶性肿瘤已经取得突破性进展，开启了肿瘤免疫治疗的新时代，但是同时也带来诸多的免疫相关不良反应(irAEs)问题。irAEs与既往的化疗、靶向治疗和中药治疗引起的不良反应多有不同，需要高度重视，积极防治。 卡瑞利珠单抗(Cam)是一种具有自主知识产权、独特结构和功能的国产ICIs，经国家药品监督管理局(NMPA) 批准上市，陆续获得了治疗多种肿瘤的适应证，正在临床上广泛使用。 1 概述 ICIs是一类新型、广谱抗肿瘤药物，目前主要包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂、程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)抑制剂及其配体(PD-L1)抑制剂。 在我国，2018年起NMPA也陆续批准了多种PD-1/PD-L1单抗上市，适应证包括非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、黑色素瘤、经典型霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌(HCC)、食管鳞癌、胃癌、尿路上皮癌和头颈部鳞癌等，且随着临床研究的不断进展，应用范围逐渐扩大。诚然ICIs治疗多种

恶性肿瘤疗效上有显著提高，但是可能引起机体免疫功能的过度激活，从而导致全身多个系统的irAEs，常累及皮肤、结肠、内分泌器官、肝脏和肺脏等。通常情况下，irAEs大多数为1～2级，但是极少数情况下比较严重，甚至危及生命，比如免疫性肠炎、免疫性肺炎、免疫性肝炎以及免疫性心肌炎等。 皮肤不良反应是ICIs最常见的irAE 之一，其确切发生机制尚不清楚。 2 Cam与RCCEP的关系 2.1 RCCEP的发生率 RCCEP是一种主要发生于皮肤的irAE，以真皮层毛细血管增多和毛细血管内皮细胞增生为其病理学特征，具有独特的形态学表现，且呈动态变化，是Cam最常见的药物治疗相关不良反应(TRAE) 。 2.2 RCCEP的临床特点 RCCEP主要发生于人体的体表皮肤，大多见于头面部和躯干部；按照外观形态，大致可分为“红痣型”、“珍珠型”、“桑椹型”、“斑片型”和“瘤样型”5种类型，以“红痣型”和“珍珠型”最为多见(图1)。大多数患者的RCCEP 在首次用药后第1 个周期(2～4周时间内) 出现，在用药当天或随后数天内

小鼠心肌微血管内皮细胞使用说明

小鼠心肌微血管内皮细胞 小鼠心肌微血管内皮细胞产品说明: 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠心肌微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠心肌微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠心肌微血管内皮细胞产品简介: 1、产品名称：小鼠心肌微血管内皮细胞 2、组织来源：小鼠心肌血管组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠心肌微血管内皮细胞简介： 小鼠心肌微血管内皮细胞分离自正常小鼠心肌血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。 本公司生产的小鼠心肌微血管内皮细胞，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 小鼠心肌微血管内皮细胞培养基信息：