液相色谱使用注意及保养

高效液相色谱(HPLC)使用中常见故障及解决方法

（一）峰型异常问题

峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。

1、色谱图中未出峰。解决方法：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。

2、一个峰或几个峰是负峰。解决方法：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。

3、所有峰均为负峰。解决方法：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。

4、所有峰均为宽峰。解决方法：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。、

5、所出峰比预想的小。解决方法：样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确．定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。

6、出现双峰或肩峰。解决方法：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。

7、前伸峰。解决方法：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。

8、。解决方法：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。

9、出现平头峰。解决方法：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。

10、出现鬼峰。解决方法：进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。

（二）液相色谱柱的使用注意事项及再生

1、色谱柱的使用说明：

（1）色谱柱使用前注意事项：

色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

（2）流动相：

流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。

以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。

（3）样品：

样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。

2、色谱柱的保存

（1）反相色谱柱每天实验后的保养：

使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。

（2）长期保存色谱柱：

如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。

3、色谱柱的再生

因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。

（1）反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。

（2）正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法

色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），以下列举了部分常见原因及解决办法：

（1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。

如果确认色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的，可选择以下方式进行补救：

1. 先在色谱柱前加上保护柱或在线过滤器，然后用甲醇/水＝20/80 1.0ml/min 反向冲洗色谱柱180min。

2. 先在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器，然后反向使用。

（三）防止强保留物质在色谱柱中存留

强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰形变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分

离的影响是一个累积效应，需要一定的时间才会体现出来，但对许多样品特别是复杂样品而言，很难判断其是否含有强保留物质，因此要防止强保留物质的累积，需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙腈清洗色谱柱。

清洗方法：

1. 未使用缓冲盐：每天分析完成后，用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱60min。

2. 使用过缓冲盐：分析完成后，先用上述方法除去缓冲盐，然后再用纯甲醇或乙腈反向冲洗色谱柱60min。

3. 补救方法：

水——乙腈——氯仿（或异丙醇）——乙腈——水

每一步以1.0ml/min流速反向冲洗色谱柱60min。

比如纯水第二天就有长菌的可能，而甲醇：水=10：90则在5天左右可以看到长菌的状况，事实上只要柱子中有机相的比例大于50%，通常半年之内不会长菌，我公司常用的甲醇：水=75：25，一、两年也没有过长菌的现象。

色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

高效液相色谱柱在使用过程最容易碰到的问题就是柱压升高。如果柱压是在长时间使用过程中缓慢地增加，通常这属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：

（1）、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

（2）、色谱柱头的填料被样品污染；

（3）、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；

（4）、流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

解决办法如下：

（1）、当确定是色谱柱头的过滤筛板被污染时，卸下色谱柱头，将其放在30%在右的稀硝酸内用超声波超声清洗约10分钟，后再用超纯水超声约10分钟，重新装入色谱柱。

（2）、当断定是色谱柱头的填料被污染时，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。 (3)、当断定是盐结晶时，用甲醇含量相对较低的甲醇-水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

（4）、如果因PH值使用不当，很难恢复。

色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。对于在正相条件下评价的色谱柱，如果使用的条件为反相时，请用一个中介流动相（如异丙醇）先置换掉柱内的储存液，然后再应用于反相条件，否则，会对色谱柱造成极大的伤害，将会明显地减少色谱柱的使用寿命。在反相色谱柱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，一定不要把色谱柱直接接上，应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过度一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机中很容易析出，而使色谱柱堵塞，无法恢复。

（四）做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?

答：原因可能有：1、泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；2、比例阀失效,更

换比例阀即可。3、泵密封垫损坏，更换密封垫即可。4、溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时

改变脱气方法；5、系统检漏，找出漏点，密封即可。6、梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么?

答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1、拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；

2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。

3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，(此时不要连接检测器，以防固体

颗粒进入流动性)。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4、更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂

或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，

在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

过滤器，一般在液相里面出现的地方有三个。最前面的在溶剂瓶中，接在溶剂管路的头上，一般是不锈钢烧结材料的，也有是高分子材料的。可以过滤掉溶剂中的杂质。溶剂一般应该是很干净的，有机相使用色谱纯溶剂，水是去离子水，都是经过了0.22微米滤膜过滤的。缓冲溶液应该经过滤膜过滤后再使用。夏天，容易长霉菌，应该经常注意清洗，换溶剂的时候可以用手摸一下，如果摸上去滑滑的，肯定是脏了，清水里面超声即可，不行再加点酸。第二个出现过滤器的地方是泵后两相混合的地方，一般是为了防止两相溶剂混合后有析出情况，是和混合器合在一起的，也是一个烧结的不锈钢筛板，也应该定期清洗的。第三个会出现过滤器的地方就是柱前了，通常接的是保护柱，其最主要的作用就是保护后面昂贵的色谱柱。原理一个是会过滤掉流动相中的颗粒物，再就是遇到对色谱柱有伤害的溶剂时，牺牲自己，保护后面的色谱柱，前提是保护柱与后面的色谱柱是同一种颗粒的，其实，个人认为，这种情况几户不会发生，即使发生了，短短的

一段保护柱，能否保护后面的色谱柱也很难说。色谱柱最大的敌人，还是流动相中出现的小颗粒物，正式基于这种思路，现在的UPLC，为了最大限度的减少管路死体积，采取了在线过滤器，以烧结不锈钢筛板代替保护柱，同样可以有效的保护后面的色谱柱。

1.容易出故障的HPLC配件：

（1）吸滤器：由不锈钢粉烧结而成，孔径为10 μm，流动相中的固体杂质（比如粉尘、微生物）、缓冲盐析出以及长时间在水中浸泡均会导致吸滤器上的孔隙堵塞。吸滤器堵塞的现象：高压泵工作时，吸滤器中不断涌出气泡(柱塞杆前本来就是负压环境，而液体因吸滤器孔隙堵塞难以进入系统，这就形成了真空，涌入的气泡为真空或有机溶剂的蒸气而非空气)；解决办法：将吸滤器卸下，用有机溶剂反冲或用5%的HNO

超声清洗，如果仍不能解决应更换新的吸滤器。

3

（2）在线在过滤器：在线过滤器（一个筛板）位于柱塞泵的后面，流动相中的固体杂质以及柱塞杆与密封圈摩擦掉下的碎屑会使其堵塞。在线过滤器堵塞的现象：不连色谱柱，系统压力大于3 kg/cm2（约为0.3 Mpa）。解决办法：用5%超声清洗，如果仍不能解决应更换新的筛板。

的HNO

3

（3）单向阀：液相中的单向阀由红宝石球和球座构成，由于制作精致小巧，极易被颗粒物堵塞。单向阀的故障主要有两种，其一：红宝石球被杂质卡住无法实现密封，导致压力波动较大，解决办法：用异丙醇冲洗或取下单向阀用异丙醇超声清洗；其二：红宝石球被杂质堵塞，泵无法正常吸入流动相，解决办法：取下单向阀超声清洗或用注射器在排液口抽真空。由于材质较好，单向阀仅仅会发生上面的小故障，几乎不会发生损坏。

（4）柱塞杆密封圈：密封圈为橡胶材质，长期使用会因磨损而导致密封不良，使用缓冲盐时，如果冲洗不充分磨损会更快。现象：系统压力波动大或漏夜。措施：更换密封圈

（5）六通阀：组成复杂，是故障多发区，最常见的故障是泄漏。A进样时液体从塑料导针口漏出，原因：转子密封的孔径缩小，进样针的针尖未插入转子密封圈上的针密封；或者是虽插入针密封，但针密封不够紧密，解决办法：对于前一种情况，应取出转子密封，用22号针头穿过孔内，以增大孔径；对于后一种情况，用铅笔头上的橡皮挤压塑料导针口，压实针密封。b进样后液体漏出塑料导针口或通风管，原因：通风管出口与塑料导针口不在同一水平面上，虹吸使液体漏出。解决办法：调整通风管出口位置，使其与塑料导针口处于同一水平面。（6）流通池污染：以纯溶剂为流动相时，基线起伏不平，噪声较高，样品池与参比池能量相差较大，即可怀疑流通池污染。判定方法：波长设定为254 nm，通甲醇或水，查看SMPL EN和REF EN，如两者相差较大，则样品池受污。解决办法：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。

（五）应常备的HPLC配件：

（1）管路以及接头：不锈钢管路、螺帽和纫环，PEEK管路和PEEK螺帽；（2）用于在线过滤的筛板；

（3）柱塞杆密封圈；

（4）液相进样针。

HPLC日常维护办法之一：压力异常

操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象，并在右侧的列表中参考相应的解决方法。

A、没有压力显示，没有流动相流动

原因解决方法

1、电源问题 1、接通电源，开机

2、保险丝被烧坏 2、更换保险丝

3、控制器设定不正确或设定失败 3、a、采取恰当的设定 b、修理或更换控制器

4、柱塞杆折断 4、更换柱塞杆

5、泵头内有空气 5、溶剂脱气、启动泵抽出空气

6、流动相不足 6、a、补充流动相 b、更换入口滤头

7、单向阀损坏 7、更换单向阀

8、漏液 8、拧紧或更换手紧接头

B、流动相流动正常，但没有压力显示

原因解决方法

1、仪表损坏 1、更换仪表

2、压力传感器损坏 2、更换压力传感器

C、压力持续偏高

原因解决方法

1、流速设定过高 1、调整流速设定

2、柱前筛板堵塞 2、a、在允许情况下反冲色谱柱 b、更换筛板 c、更换色谱柱

3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀 3、a、使用恰当的流动相 b、冲洗色谱柱

4、色谱柱选择不当 4、选择恰当的色谱柱

5、进样阀损坏 5、清洗或更换进样阀

6、柱温过低 6、提高温度

7、控制器失常 7、修理或更换控制器

8、保护柱阻塞 8、清洗或更换保护柱

9、在线过滤器阻塞 9、清洗或更换在线过滤器

高效液相色谱仪使用注意事项[1]

岛津液相色谱仪使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。 11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。液相色谱柱使用经验谈 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

常用高效液相色谱柱SOP

常用高效液相色谱柱S O P Prepared on 24 November 2020

常用高效液相色谱柱SOP 1 目的： 色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 建立高效液相色谱柱日常维护与保养规程，保证能正常使用。 2 适用范围： 本规程适用高效液相色谱柱的维护与保养。 3 责任人： 液相色谱柱使用者。 4 液相色谱柱的安装： 液相色谱柱的结构： 4.1.1 液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。 柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。

密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。 4.1.2柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10 μm之间。 色谱柱的安装： 4.2.1拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 4.2.2拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 4.2.3 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57 mm、内径为-0.3 mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。

高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。

三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果

日立Chromaster液相色谱仪操作、清洁、维护、保养规程资料

文件目录 一、目的 (2) 二、范围 (2) 三、责任者 (2) 四、内容 (2) 五、修订历史 (2) 六、相关记录 (12)

一、目的 1、建立一个日立Chromaster液相色谱仪操作、清洁、维护、保养规程。 二、范围 1、日立Chromaster液相色谱仪。 三、责任者 1、中心化验室主任，操作者。 四、内容 1、仪器型号及组成： 2、工作环境 3、操作规程 3.1使用前准备 a）每次开机前先检查电源连接情况,确保电源正确的连接。 b）每次开机前检验流动相,以保证足够量的流动相。 3.2 开机确认电源连接正确后，打开各使用模块电源。 3.3打开与设备连接的电脑，在电脑桌面双击图标，使操作系统与设备联机，进入登录窗口。 3.4 第一次使用仪器时应对仪器进行配置。选择配置，进入仪器配置界面 3.4.1 点击“增加”，选择连接的仪器

3.4.2 打开仪器，自动检测配置的仪器模块

3.4.3 确认自动检测所有模块，确认泵的信息、自动进样器的信息、柱温箱信息（选择control off at shutdown）、检测器信息（选择lamp off at shutdown） 3.4.4 配置仪器，点击向右箭头，命名仪器名称。 3.5 输入用户名、密码，选择创建新工程登录。 3.6 仪器准备 3.6.1 排空打开设备监视器，打开排空阀，设流速为5，流量100%，点击“清洗”，分别将四条管路排气泡，结束之后关闭排空阀。 3.6.2 自动进样器清洗点击“清洗”，依次对柱塞、注射器进行清洗 3.7方法设置 点击“新建方法”，在“方法”下选择“事件表”按照检测需要对自动进样器、LC梯度、液相色谱控制、测量、采集、恒温器、积分、计算进行设置，设置完成后点击“发送方法” 3.8 基线方法发送仪器运行稳定之后，点击“数据采集”查看基线 3.9 序列设置及运行点击“序列”，分别对样品起始位置“SV”、结束位置“EV”、样品

高效液相色谱方法的验证

高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法

方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。

方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性

准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值

精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。

专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查

Agilent-1260LC液相色谱仪使用、维护保养规程

Agilent 1260-LC液相色谱仪使用、维护 操作规程 目录 一、目的 (2) 二、适用范围 (2) 三、内容 (2) 四、附件 (18) 五、变更历史 (18)

一、目的 明确Agilent 1260 LC型液相色谱仪硬件使用、维护保养操作方法，使质量部检验人员有章可循。 二、适用范围 本规程适用于公司Agilent 1260-LC型液相色谱仪使用、维护保养操作。 三、内容 1.制定依据 《Agilent 1260 LC system Operating Manual》 《Agilent OpenLAB Control Operating Manual》 2.工作原理： 2.1.高效液相色谱法是用高压输液泵，将具有不同特性的单一溶液或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相，用泵压入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入色谱柱内，在色谱柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由色谱工作站进行记录处理。利用色谱图色谱峰面积或峰高大小可对待测样品进行定性定量分析。 Agilent 1260 LC型液相色谱仪主要由G1329B四元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316柱温箱、G4212B二极管阵列检测器和Open LAB色谱工作站等部件组成。 3.基本操作步骤 3.1.开机准备 3.1.1.启动计算机：打开计算机电源，登陆windows操作系统。 3.1.2.启动工作站：打开Agilent 1260LC各模块电源。待Agilent 1260LC 各模块自检完成后(各模块右上角指示 灯为黄色或者无色)，点击屏幕左下角 “开始”，选择“所有程序”，选 择”Agilent Technologies”选择“Open LAB”，选择OpenLAB Control,或单击 桌面图标则会进入到上图的界面。上面步骤如果已经配置过，则不需要

液相色谱系统的日常维护及注意事项

液相色谱系统的日常维护及注意事项 之一：仪器安装条件与注意事项 安装本仪器的实验台应水平、稳固、并具有足够的放置空间。避免在具有腐蚀性气体、大量灰尘或能产生强磁场的地方安装本仪器，否则将会影响仪器的正常运转及缩短仪器的使用寿命。 由于仪器所用溶剂是易燃并且有毒，故安装设备的房间应通风良好，应具有向外排风的装置，否则可能会引起中毒或身体不适，也可能会引起火灾。 应安装四个以上三芯电源插座（220V，5～10A），必须具有专门的接地线（注意,绝不能将电源线的中线作为接地线），并确保输出电源的电压稳定，否则会导致仪器的不正常运作。 如果实验室无专用的接地线，一般可用Φ15～20mm的铜棒打入地下1～1.5米，用Φ1.2mm 左右的塑胶单股导线连接到电源插座的接地端。 如果实验室电压不稳定，应使用稳压器等必要设备，使电源电压稳定。 实验室的室温应控制在15℃-30℃范围内，并且波动要小；湿度在45～85%范围内。 由空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器，避免光线直射及振动。 仪器的启动顺序：先开高压恒流泵和紫外检测器，待紫外检测器自检完毕，回到默认波长254nm后，再开计算机及打开工作站软件。 仪器关闭顺序：先按泵停止，关闭氘灯，退出工作站软件，然后再关仪器。 仪器应由专人负责，如果使用人员不固定，请准备《仪器使用登记本》，以明确使用情况，及时处理和保养。 之二：流动相使用的注意事项 必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45μm薄膜过滤。 过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如O2），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。 几中脱气方法比较： 1. 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。

高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证

高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺 来源：《维吾尔医药》2013年第07期 摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。 关键词：头孢氨苄高效液相色谱法 头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药 分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至

高效液相色谱法测定手册

高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

气相色谱仪维护保养知识

气相色谱仪的维护保养知识 俗话说得好：没有不好骑的马，只有骑不好马的骑师。只有把GC当朋友，好好了解它的习性、掌握维护保养要领并坚持保养它才能服服帖帖听你的话。 GC主要有载气系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统共五个主要组成部分，要做好保养首先得先了解GC各部分构造以及可更换或清洁的零部件，这部分知识可参考各种GC产品使用说明书。 下面主要就GC各功能部分维护保养经验、要领一一列举： 一、载气系统： 载气系统主要包括气源（气体钢瓶或发生器）、减压阀、限流器、净化器、载气管路等部分，载气系统最主要的维护工作就是检漏，可采用厂家提供的检漏液或者自行配制肥皂水振摇起泡，涂抹在管路连接或阀等有缝隙的地方察看。卸下高压、低压表头检定过的国产减压阀大部分用不了多长时间就会发生泄漏。检漏工作应定期作，周期示实际情况而定。每次更换气瓶、减压阀等也需要检漏。需要注意的是，不要将载气管路长时间放空，应采用堵头堵住两端，尽量避免空气进入载气管路。在质谱应用中，如果拆卸过载气管路，可看到水峰（18）和氮气峰（28）等长时间下不来，此时可稍微拧松GC入口管路螺帽，开载气吹半个小时或更长时间。 净化器在载气系统中作用很大，可以帮助去除气体源中污染设备和影响分析结果的水分、烃类、氧气等等杂质。净化管有很多种选择，主要有氧气净化管、水分净化管、烃类净化管、综合净化管等等。除了部分水分及烃类净化管可以再生处理以外，一般均为一次性使用，寿命示实际情况而定。可再生类净化管一般有显色指示，根据指示确定是否需要再生处理，再生处理步骤为取出吸附剂，烘箱中加热烘烤，最后干燥冷却后重新填装连接管路。 二、进样系统（进样口）： 目前各厂家GC进样口主要有填充柱进样口、分流/不分流柱进样口、PTV (温度可编程蒸发进样口) 、VI (挥发物接口) 、COC(冷柱头进样口) 、气体进样阀接 口 (气体样品)等多种进样口类型以及ALS(自动进样器) 、顶空进样、吹扫捕集进样等进样附件。其中主要以填充柱进样口、分流/不分流柱进样口应用最广，填充柱进样口主要在老的标准方法以及气体分析、大体积进样分析等应用中常用，目前主流的进样口主要为分流/不分流柱进样口，由于其分析要求一般比较高（如农残分析等），维护工作尤其重要，如维护不到位，其分析结果差异较大。

15-岛津LC-2030高效液相色谱仪使用、维修、保养操作规程

15-岛津LC-2030高效液相色谱仪使用、维修、保养操作规程

云南品斛堂生物科技有限公司 文件名称岛津LC-2030高效液相色谱仪使用、 维修、保养操作规程 页码2/10 文件类别工作标准颁发部门质量部文件编号SOP-03-015-00 制定审核批准 制定日期年月日审核日期年月日批准日期年月日分发部门质量部、生产部实施日期年月日文件状态修订口新订口原因：执行2010年版药品生产质量管理规 范 1目的：建立岛津LC-2030高效液相色谱仪使用、维修、保养操作规程，确保仪器的正确操作。 2范围：本规程适用于岛津LC-2030高效液相色谱仪使用、维修、保养。 3责任：化验室负责人，化验员。 4内容： 4.1概述 本系统由四元低压梯度系统输送泵、自动进样器、UV检测器、柱温箱、LabSolutions色谱数据工作站和电脑等组成。 4.2原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱固定相内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 4.3技术参数 流量设定范围0.0001～10 mL/min 流速精度±1% 或±2μL/min 最大操作压力44MPa 进样数216个样品外形尺寸mm 410×500×605mm 波长重现性±0.1nm 温控精度±0.1℃波长范围190～700nm 噪声±2.5×10-6AU 漂移100×10-6AU/h 4.4设备安装位置

(最新)液相色谱使用注意事项

流动相： 1. 流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2. 流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3. 含水流动相最好在临实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好 加入叠氮化钠，防止细菌生长。 4. 流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。 5. 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较 低的溶剂配制。 色谱柱: 1. 要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 2. 长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该 用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 3. C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 4. 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头 的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 5. 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动 相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规 分析需要50~75ml。 6. 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止 将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 使用注意事项： 1. 使用中避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高 处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流 速时应该缓慢进行。 2. 平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离 子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）。 3. 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲 醇/乙腈中。

液相色谱柱的使用和维护

前言 液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以 固定相中流出而得到分离。因此液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响目标化合物的分析和检测。但在液相色谱运行过程中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护 色谱柱的知识非常必要。色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致鬼峰等问题。引起这些问题的内在原因有: (1) 硅羟基的死吸附。色谱柱的基材硅胶粒子表面存在硅胶羟基。任何物质在色谱柱中都存在双分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在流动相与硅羟基之间进行分配。被分析物质被硅羟基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。当硅羟基对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱效下降,峰形出现拖尾、变宽。 (2) 重金属。色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度多高,无论怎样处理,都会有不少于5 ×10- 6 的重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。例如儿茶素和大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧化,影响其分离效果。 (3) 碳流失。固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。 (4) 缓冲液中盐的析出。在做色谱分析时,有时流动相中会含有缓冲盐溶液。分析结束后,如

果没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。 (5) 色谱柱变干。如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,影响分离效果。 2 色谱柱的使用 新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。认真阅读说明书及性能测试报告,了解新柱子的最佳性能指标,如某色谱条件下的柱压、柱效等。有时分析用的流动相与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18 柱通过出厂测试后多保存在乙腈中,可用10～20 倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速要缓慢提高,如开始0. 3～0. 5mL/ min , 10～15min 后可慢慢加快。 硅胶柱和极性色谱柱通过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需要使用含水的流动相,则使用前须用乙醇或异丙醇冲洗,流速0. 1～0. 3mL/ min ,将正庚烷冲洗干净后,再用流动相平衡。 实验过程中可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。每次分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。梯度洗脱用初始流动相平衡。一次样品分离完成后,要有足够的时间使系统恢复平衡,再进行下一次分析。一般流动相平衡时间为30min ,若系统中有盐或水,平衡时间应延长。 3 色谱柱的清洗与保存

高效液相色谱测定法标准操作规程

标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分

离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。

agilent高效液相色谱仪使用维护保养操作规则

优胜美特制药有限公司&浙江巨泰药业有限公司 --------药物研究所-------- 变更内容及定期审核 制定Agilent 1260型高效液相色谱仪操作维护规程，使操作维护规范化，保证检测结果准确可靠。

二、适用范围 本规程适用于Agilent 1260型高效液相色谱仪的操作维护。 三、职责 QC对本规程的实施负责，项目主管、研发总监对本规程实施进行监督。 四、程序内容 4.1仪器配置 本仪器由梯度泵，自动进样器，柱温箱，VWD检测器或DAD检测器和操作软件工作站组成。 4.2操作前的准备 色谱纯的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水为新鲜制备的重蒸馏水。对规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节，配制好的流动相应通过0.45μm以下的滤膜滤过，用前脱气，应配制足量的流动相。 4.2.2 供试溶液的配制供试品用规定溶剂配成供试溶液。定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45μm以下的滤膜滤过，必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 4.2.3 检查上次使用记录和仪器状态，检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4.3仪器的操作 4.3.1 接通电源，打开计算机及工作站其他各部件开关，约30秒后，各部件进入待机状态，指示灯为橘黄色，启动完成。 →梯度泵→柱温箱→检测器的状态，橘黄色为未就绪状态，绿色为空闲状态，粉色为进样状态，蓝色为运行状态，红色为出错状态。 显示所有数据：即打开运行样品时所有记录运行状态的数据图谱。 平铺数据：即将所有运行状态图谱平铺。 重叠数据：即将所有运行状态图谱重叠。 4.4色谱条件的设定及数据采集操作过程 一模块图标中的控制来开或关。把泵上的Purge阀逆时针松开，调流速为3.0ml/min,启动泵，系统开始排气泡，直到管线内（由容器瓶到泵出口）无气泡为止，切换通道继续Purge，直到所用流动相通道中无气泡为止，调流速为1.0ml/min，再把Purge 阀顺时针旋紧。 “与泵和进样器一致”使柱温箱温度一致，单击确定进入下一画面。 “最大压力限度”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子，单击确定进入下一画面。VWD检测器参数的设定

YYZL-液相色谱与质谱-液相色谱-HPLC-U3000-液相色谱仪操作注意事项

文件类型：Work Instruction 部门: China Service T&A UltiMate 3000 Series Column Compartments Operating Instructions UltiMate 3000 Autosampler Operating Instructions UltiMate 3000 Variable Wavelength Detectors Operating Instructions UltiMate 3000 Diode Array Detectors Operating Instructions U3000液相色谱仪操作注意事项 1.目的 规范U3000液相色谱仪开关机注意事项，正确使用仪器，保证检测工作顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。 2.适用范围 适用于U3000液相色谱仪(仪器配置:Pump+WPS+TCC+VWD/DAD+CM7.2)的使用操作。 3.职责 3.1U3000液相色谱仪操作人员应严格按照本规程进行仪器的开关机，对仪器进行正确地日常维护， 并填好使用记录。 3.2U3000液相色谱仪保管人员负责监督仪器操作是否符合规程，对仪器进行正确地开关机、定期维 护、保养。 3.3室主任负责仪器综合管理。 4.开关机操作程序 4.1开机注意事项 4.1.1流动相的配制：根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相；根据流动 相的性质确定采用有机膜还是水相膜对流动相进行过滤；将过滤后的流动相进行超声脱气5分钟。 4.1.2样品的处理：称取或量取适量的对照品或供试品，用适当的溶剂（最好采用流动相或流动相的主 成分）进行充分溶解（也可借助超声波进行超声溶解），根据检测结果再适当调节溶液的浓度; 样品尽量过滤（有机膜或者水膜）。 4.1.3请确认：清洗泵头密封圈的10%异丙醇或甲醇水溶液没有走空，洗针的D通道或者洗针液瓶没有 走空。 4.1.4依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源； 4.1.5双击电脑右下角“服务管理器/Chromeleon Service Manager”快捷图标,出现对话界面后点击“启动 仪器控制器/Start Instrument Controller”,等显示“本地仪器控制器运行空闲/The local Instrument Controller is running idle ”,可以关闭界面。 4.1.6双击在桌面上的Chromeleon 7图标（工作站主程序）。 4.1.7在左下方点击“仪器/Instruments”，则在右边会自动显示该仪器控制面板。 4.1.8泵排气泡/Purge：旋开泵上的排液阀(两圈以上)，设置A通道为100%，点击“冲洗/purge”，然后再

游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法)

八．饮料中游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法) 本方法适合饮料中游离色氨酸的测定 本方法检测限：饮料中游离色氨酸为30μg/100ml。 （一）方法提要 试样的游离色氨酸经处理后，在高效反相色谱C18柱上分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量游离色氨酸的含量。 （二）仪器 1. 高效液相色谱仪带紫外检测器或二极管阵列检测器。 2. 超声清洗仪（溶剂脱气用）。 3. 天平（精确到0.0001g）。 4. 微孔滤膜（HF 0.45 μm）。 （三）试剂 1. 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（分析纯），加适量去离子水并稀释到100ml。 2. 甲醇（色谱纯）。 3. 0.1%(m/V)磷酸溶液：1.0g磷酸（分析纯）加水至1000mL，溶解混匀，过微孔滤膜0.45μm，待用。 4. 色氨酸对照品，Fluka公司(纯度≥99.5%)。 5. 色氨酸标准溶液：精密称取色氨酸对照品约0.0300g，移入100ml容量瓶中，加入少许水，再加入50μL1.0mol/L氢氧化钠溶液，超声溶解并用水定容到100mL，成浓度为300μg/mL的标准储备液。取标准储备液5.0mL用去离子水定容到50mL，成为浓度为30μg/mL的标准溶液。 （四）测定步骤 1. 样品处理： ①汽水、可乐型饮料：取均匀试样置于小烧杯中，微温除去二氧化碳（或超声脱气10min），经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 ②果汁类：取均匀试样置于离心管中，5000rpm/min离心20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 2. 标准工作曲线制作。精密吸取色氨酸标准溶液1.0，5.0，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用水定容到100mL，摇匀。分别取10μL标准工作系列溶液进样

色谱柱管理规程

色谱柱管理规程 1.目的 本文件规定了色谱柱的采购、接收、使用、保养和保存，以确保色谱柱达到合理应用和规范应 用的管理规范。 2.适用范围 本文件适用于本公司色谱分析用色谱柱的管理。 3.责任 3.1.本文件由质量部QC负责起草，质量部部长审核，生产技术副总经理批准。 3.2.质量部QC负责实施。 3.3.QC主管负责监督检查。 4.内容 4.1.色谱柱的采购 QC根据检验需要提出购买申请，注明柱子固定性类型、购买数量、规格、用途等，QC主管审核批准。由供应部从定点供应商处购买。 4.2.接收 4.2.1.编号、登记 对于新购进的色谱柱必须造册编号登记，贴上标签,注明编号。编号用阿拉伯数字表示，以此类推不重复使用。 填写色谱柱登记表，内容包括:生产公司、品名、型号规格、编号、购进时间、启用时间、固定 相类型、单价等。 4.3.存放 色谱柱分类存放。不同的色谱柱按柱子当时柱效不同放入不同的盒中，并标注不同状态以便区分避免混淆。色谱柱按照不同的柱效分为三类，使用良好；需要保养；停止使用。 保养前放入“需要保养”的盒中； 保养后并能提高柱效达到检验要求的放入“使用良好”的盒中； 保养后不能提高柱效并影响检验结果的放入“停止使用”的盒子中。 4.4.使用与保养 每启用一根色谱柱,在色谱柱标签上填写启用日期，放入“使用良好”的色谱柱盒中。 对于不同的样品可使用不同的色谱柱，也可使用同一根色谱柱，但必须确保色谱柱类型、柱效符 合要求。 对于一些使用频率少的柱子,因为放置时间长,容易干柱影响柱效, 每根柱子每三个月保养一次, .

每一次做好保养记录。 频繁使用的柱子，因为使用时间长，造成柱效降低或柱压增高等不利于检验结果的现象时，也要 对柱子作出相应的保养处理，并做好保养记录。 4.5.使用后清洗 色谱柱每次使用后要对柱子进行冲洗。冲洗分为两个方法：方法一（流动相为简单的有机相与水 混合的）用50%的甲醇冲洗15-30分钟，最后用纯甲醇冲洗15-30min；方法二（流动相中含磷酸或盐类或缓冲液的）先用重蒸馏水冲洗15min，然后用50%的甲醇冲洗15-30min，最后用纯甲醇冲洗15-30min。色谱柱的使用和冲洗方法都体现在高效液相色谱仪使用记录里面。 4.6.色谱柱的保存 4.6.1.气相色谱柱 对于暂不使用的色谱柱，应小心存放，可用硅橡胶块、帽或其他方式将两端封闭，置于盒中。 4.6.2.液相色谱相 首先色谱柱必须清洗干净后才能贮存,柱子不能贮存于水或水性溶剂中,否则会引起微生物的滋生。反相色谱柱可以贮存于甲醇或乙腈中，正相色谱柱可以贮存于经脱水处理后的正已烷中， 离子交换柱可以贮存于含5%甲醇或含0.05%叠氮化钠的水中，并将色谱柱两端密封，以免干燥，室温保存。 4.7.色谱柱的保养方法 应按所附说明书的要求对色谱柱进行保养。不同的色谱柱采用不同的保养方法。对于较昂贵的液相色谱柱,可以在柱前加一保护柱(预柱),防止样品中杂质污染分析柱,对于制备柱,因其进样量大,使用保护柱尤为重要。 4.8.报废 对于柱效完全不符合要求的色谱柱或由于其他原因已不能使用的色谱柱，经QC主管批准后，做好停用记录,不能随意丢弃,存放与“停止使用”的盒子中。每年集中清理一次，废弃处理。 5．记录 色谱柱的相关记录由QC整理,QA收集归档保存三年. 6.相关记录 R-SMP07047-01色谱柱登记记录 R-SMP07047-02色谱柱保养记录 R-SMP07047-03色谱柱停止使用记录 .