2020届高中生物一轮复习苏教版DNA的粗提取与鉴定作业含答案

2020届一轮复习苏教版DNA的粗提取与鉴定作业

一、选择题

1．鉴定DNA的试剂是()

A．斐林试剂B．苏丹Ⅲ染液

C．双缩脲试剂D．二苯胺试剂

解析：选D鉴定DNA用的试剂是二苯胺，苏丹Ⅲ染液用于鉴定脂肪，斐林试剂用于鉴定可溶性还原糖，双缩脲试剂用于鉴定蛋白质。

2．在提取DNA的过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是()

A．不易破碎B．减少提取过程中DNA的损失

C．增加DNA的含量D．容易刷洗

解析：选B DNA易被玻璃器皿吸附，使用塑料试管和烧杯，可以减少DNA的损失。

3．(2018·江苏高考)关于还原糖、蛋白质和DNA的鉴定实验，下列叙述正确的是() A．在甘蔗茎的组织样液中加入双缩脲试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色

B．在大豆种子匀浆液中加入斐林试剂，液体由蓝色变成紫色

C．提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤液

D．将DNA粗提物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴后液体由无色变成蓝色

解析：选D甘蔗茎的组织样液中含有大量的蔗糖，蔗糖属于非还原性糖，与斐林试剂在50～65 ℃的水浴加热条件下不会产生砖红色沉淀；大豆种子的匀浆液中含有大量的蛋白质，鉴定蛋白质时应使用双缩脲试剂，双缩脲试剂在常温下能与蛋白质发生反应，生成紫色的络合物；提取DNA时，植物细胞需要先用洗涤剂瓦解细胞膜，在切碎的洋葱中加入适量的洗涤剂和食盐，进行充分的研磨，过滤后收集滤液；在沸水浴条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色。

4．下列有关DNA的粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是()

A．取材：鸡血细胞。原因：有细胞核，其他动物的血细胞都没有细胞核

B．粗提取：不同浓度的NaCl溶液。原因：DNA在其中的溶解度不同

C．提纯：95%的冷酒精。原因：DNA溶于酒精，蛋白质等杂质不溶于酒精

D．鉴定：二苯胺试剂。原因：DNA溶液加入二苯胺试剂即呈蓝色

解析：选B除了哺乳动物成熟的红细胞，其他动物的血细胞都有细胞核。DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，从而粗提取DNA。DNA不溶于酒精，蛋白质等杂质溶于酒精，进而提纯DNA。DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热才会呈蓝色。

5．在DNA粗提取与鉴定实验中，将获得的含有DNA的黏稠物分别按下表处理3次，则DNA主要集中在标号()

A.①③⑤

C．①④⑥D．②④⑥

解析：选B DNA在2 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度大，过滤后DNA存在于滤液中；DNA在0.14 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度低，搅拌过滤后存在于黏稠物中；DNA不溶于95%的冷酒精，搅拌过滤后存在于黏稠物中。

6．如图是“DNA粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述正确的是()

A．图1中溶液a是0.14 mol·L－1的NaCl溶液

B．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶

C．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显

D．图2试管1的作用是证明2 mol·L－1 NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色

解析：选C图1中是将丝状物溶解，溶液a是2 mol·L－1的NaCl溶液；加入冷却的酒精的目的是除杂，原理是DNA不溶于冷酒精，而杂质蛋白能溶于酒精；图2操作中的错误是试管2中未将DNA溶于2 mol·L－1的NaCl溶液中，可能导致试管2蓝色变化不明显；图2试管1的作用是证明2 mol·L－1NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色。

7．(2019·南通二模)下列是“肝脏细胞DNA粗提取”实验的两个关键操作步骤，相关叙述错误的是()

A．步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定

B．步骤1中，冰浴处理的主要原理是低温下DNA水解酶容易变性

C．步骤2中，异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀

D．步骤2中，离心后应取上清液，因为DNA在2mol·L－1NaCl溶液中溶解度比较大解析：选B步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定；步骤1中，冰浴处理的主要原理是降低DNA的溶解度，使DNA析出；步骤2中，异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀；DNA在2 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度最大，因此加固体NaCl使溶液浓度达到2 mol·L－1后再离心过滤取上清液。

8．(2019·淮阴、海门四校联考)关于DNA的实验，叙述正确的是()

A．DNA溶液与二苯胺试剂混合，沸水浴后生成蓝色产物

B．PCR的每个循环一般依次经过变性→延伸→复性三步

C．用兔的成熟红细胞可提取DNA

D．用甲基绿吡罗红将细胞染色，细胞质呈绿色，细胞核呈红色

解析：选A DNA溶液与二苯胺试剂混合，沸水浴后生成蓝色产物；PCR的每个循环一般依次经过变性→复性→延伸三步；兔的成熟红细胞中没有DNA；用甲基绿吡罗红试剂对人的口腔上皮细胞染色，细胞核呈绿色，细胞质呈红色。

9．如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列有关叙述正确的是()

A．DNA在常温下遇到二苯胺会被染成蓝色

B．图中加入蒸馏水的目的是稀释盐溶液使DNA析出

C．DNA在2 mol/L的盐溶液中溶解度比较小

D．加入酒精后需用玻璃棒快速来回搅拌

解析：选B DNA溶液加入二苯胺试剂，在沸水浴加热的条件下会变蓝；在DNA浓盐溶液中加入蒸馏水的目的是稀释盐溶液，降低DNA的溶解度，使DNA析出；DNA在2 mol/L

的盐溶液中溶解度比较大；加入酒精后需用玻璃棒搅拌，动作要轻缓，以免加剧DNA分子断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

10．若从植物细胞中提取DNA，发现实验效果不好，如看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定时不显示颜色反应等，其不可能的原因是()

A．植物细胞中DNA含量低B．研磨不充分

C．过滤不充分D．95%冷酒精的量过少

解析：选A研磨不充分、过滤不充分均会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少；若用于沉淀DNA的酒精量过少，也会导致DNA的沉淀量变少。

11．“DNA粗提取”实验中，应尽可能避免DNA断裂和降解。下列相关操作正确的是()

A．以菜花为材料进行研磨时，可以适当加热以促进DNA溶解

B．向DNA溶液中迅速加入蒸馏水，使DNA快速析出

C．将丝状物溶解到2 mol·L－1NaCl溶液中后，加水析出

D．向DNA溶液中加入冷却的酒精并沿同一方向缓慢搅拌

解析：选D以菜花为材料进行研磨时要加洗涤剂和食盐，不能加热，否则DNA水解酶活性会上升，会加速分解DNA；向DNA溶液中加蒸馏水要缓慢，使DNA充分析出；将丝状物溶解到2 mol·L－1 NaCl溶液中的目的是为了进行鉴定，应该加入二苯胺试剂，不是加水；向DNA溶液中加入冷酒精并沿同一方向缓慢搅拌析出DNA，防止DNA断裂。

12．(2019·盐城模拟)下列有关利用新鲜的菜花进行DNA粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是()

A．向菜花组织中加入蒸馏水并搅拌可释放核DNA

B．加入洗涤剂和食盐的作用分别是瓦解细胞膜和溶解DNA

C．利用DNA不溶于冷酒精的原理可进一步提纯DNA

D．含DNA的氯化钠溶液与二苯胺在常温下混合呈蓝色

解析：选BC菜花细胞为植物细胞，有细胞壁保护，因此加蒸馏水不会吸水涨破。加入洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，加入食盐的作用是溶解DNA。DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白质在冷酒精中的溶解度较高，因此可以利用DNA不溶于冷酒精的原理进一步提纯DNA。含DNA的氯化钠溶液与二苯胺在沸水浴下混合呈蓝色。

13．(多选)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验中的一些操作过程。相关叙述正确的是()

A．实验过程中正确的操作顺序是③→②→⑤→④→①

B．实验⑤步骤中加入蒸馏水直到溶液中有丝状物析出为止

C．若改用植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水涨破

D．将粗提取的DNA溶解在2 mol/L的NaCl中加入二苯胺试剂加热鉴定

解析：选AD分析题图，①表示用95%的酒精对DNA进行进一步纯化；③②表示破碎细胞，获取含DNA的滤液；④⑤表示去除滤液中的杂质，所以实验过程中正确的操作顺序是③→②→⑤→④→①；实验⑤步骤中加入蒸馏水直到析出的丝状物不再增加为止；若改用植物材料需研磨破坏细胞壁，同时加入洗涤剂瓦解细胞膜；可以将粗提取的DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，然后加入二苯胺试剂进行加热鉴定。

14．(多选)研究人员比较了不同贮藏条件对棉叶DNA纯度及提取率(提取率越高，获得的DNA越多)的影响，实验结果见下图。下列有关叙述正确是()

A．提纯DNA时可加入酒精去除不溶的蛋白质、酚类等物质

B．新鲜棉叶提取的DNA纯度最高，提取DNA的量也最多

C．木瓜蛋白酶和不同浓度的NaCl溶液均可用于提纯DNA

D．用二苯胺试剂鉴定，颜色最深的是冷冻3 d处理后提取的DNA

解析：选CD提纯DNA时可加入酒精去除可溶的蛋白质、酚类等物质；新鲜棉叶提取的DNA纯度最高，冷冻3 d时提取DNA的量最多，二苯胺试剂鉴定颜色最深；木瓜蛋白酶可以去除蛋白质，不同浓度的NaCl溶液可去除与DNA溶解度不同的杂质。

二、非选择题

15．(2019·无锡检测)血液作为一种常见的临床检测材料，如何从血液中快速、高效地

分离和提取基因组DNA，对于临床血液检验与分析非常重要，科研人员对比分析了超声波处理法(方法A)、高盐法(方法B)、改良高盐法(方法C)等三种快速提取大鼠全血基因组DNA 的方法，实验过程如图，请分析回答：

(1)多组实验数据发现，用大鼠全血为实验材料提取的DNA含量总是很少，原因是________________________________________________________________________。

(2)常规细胞破碎方法是_______________________________________________。

三种实验方法所需时间均较短，主要在样品处理和细胞破碎环节进行了优化，就三种方法而言，细胞破碎较理想的为______________。

(3)方法B得到的溶液中RNA含量高于DNA，分析原因是蛋白酶K的加入可能抑制了________的活性。

(4)步骤②中加入NaCl的目的是__________________________________________，

步骤③中加入异丙醇的作用是__________。

(5)得到含DNA的溶液后进行鉴定，需向其中加入____________，沸水浴加热，________后变蓝。

解析：(1)因哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，也就没有DNA，因此用大鼠全血为实验材料提取的DNA含量总是很少。(2)常规细胞破碎方法是加入蒸馏水，使细胞吸水涨破。与方法A、B相比，方法C破碎细胞的效率高、成本低，是细胞破碎较理想的方法。(3)方法B得到的溶液中RNA含量高于DNA，其原因可能是蛋白酶K的加入抑制了RNA酶的活性。(4)步骤②中加入NaCl的目的是溶解DNA，步骤③中加入异丙醇的作用是使DNA析出。(5)得到含DNA的溶液后进行鉴定，需向其中加入二苯胺，沸水浴加热，冷却后变蓝。

答案：(1)哺乳动物红细胞中无细胞核和线粒体(2)加入蒸馏水，使细胞吸水涨破方法C(3)RNA酶(4)溶解DNA使DNA析出(5)二苯胺冷却

16．(2019·南通考前卷)CTAB法和SDS法是提取DNA的常用方法，CTAB提取液含有

CTAB、EDTA等成分，SDS提取液含SDS、EDTA等成分。CTAB能破坏膜结构，使蛋白质变性，提高DNA在提取液中的溶解度；SDS能破坏膜结构，使蛋白质变性；EDTA能螯合Mg2＋、Mn2＋，抑制DNA酶的活性。某科研小组为了寻找提取腊梅DNA的优良方法，比较了两种提取DNA的方法，主要操作如下：

实验测定结果如下(表中OD260反映溶液中核酸的浓度，OD280反映溶液中蛋白质的浓度。理论上，纯DNA溶液的OD260/OD280为1.800，纯RNA溶液的OD260/OD280为2.000)。

(1)与常温下研磨相比，液氮中研磨的优点是________________________________；CTAB法和SDS法提取液中都加入EDTA的目的是______________________________。

(2)氯仿－异戊醇密度均大于水且不溶于水，DNA不溶于氯仿－异戊醇，蛋白质等杂质可溶于氯仿－异戊醇，实验过程中加入氯仿－异戊醇离心后，应取①________加异丙醇(异丙醇与水互溶)并离心进行纯化，利用异丙醇溶液纯化DNA的原理是_____________。

(3)两种方法中，________法提取的DNA较多，其可能原因是_____________________。

(4)两种方法中，________法提取的DNA纯度较低，其含有的主要杂质是________。

解析：(1)液氮温度低，在液氮中研磨，DNA酶活性低，可以降低DNA的分解，使研磨更充分；EDTA能螯合Mg2＋、Mn2＋，抑制DNA酶的活性，减少DNA水解，提高DNA 的完整性和总量。(2)氯仿—异戊醇密度均大于水且不溶于水，DNA不溶于氯仿—异戊醇，离心后，氯仿—异戊醇位于试管的底部，DNA溶于上清液中，所以离心后应取上清液；含DNA的上清液中加异丙醇离心后取的是沉淀物，说明DNA不溶于异丙醇，而杂质能溶于异丙醇。(3)从表中数据可知，CTAB法提取的DNA的OD260是0.033，而SDS法提取的DNA的OD260是0.006,0.033＞0.006，所以CTAB法提取的DNA较多，根据CTAB和SDS

两种试剂作用的区别，可知CTAB提高了DNA在提取液中的溶解度，从而可提取出更多的DNA。(4)从表中数据可知，CTAB法提取的DNA的OD260/OD280是1.833，而SDS法提取的DNA的OD260/OD280是1.200，与1.833相比，1.200偏离1.800更多，所以SDS法提取的DNA纯度较低，纯RNA溶液的OD260/OD280为2.000，比纯DNA溶液的OD260/OD280大，而1.200比1.800小，所以主要杂质不是RNA，而是蛋白质。

答案：(1)研磨充分，低温抑制酶活性，降低DNA的分解减少DNA水解，提高DNA 的完整性和总量(2)上清液DNA不溶于异丙醇，而杂质能溶于异丙醇(3)CTAB CTAB提高了DNA在提取液中的溶解度，从而能提取出更多的DNA(4)SDS蛋白质

《DNA的粗提取与鉴定》实验教学设计(可编辑修改word版)

《DNA 的粗提取与鉴定》实验教学设计

1)、DNA 在NaCl 溶液中的溶解度，是随着NaCl 的浓度的变化而改变的。当NaCl 的物质的量浓度为0.14 mol／L 时,DNA 的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl 溶液中的DNA 析出。 2)、DNA 不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 鉴定DNA 的原理： DNA 遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。 2、实验过程：师生共同学习 以鸡血为实验材料进行DNA 的粗提取 鸡血细胞做实验材料的原因 ①鸡血细胞核的DNA 含量丰富，材料易得 ②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长 ①柠檬酸钠作用及作用机理 防止血液凝固。 柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固 ②注意事项 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA 的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液 讨论：提取鸡血中的DNA 时，为什么除去血液中的上清液？ 答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆 3、过程（结合导学案边做边学） ①提取鸡血细胞的细胞核物质 ②溶解细胞核内的DNA 【合作释疑一】 （1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？ 答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破 （2）用玻璃棒搅拌有什么意义？ 答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA （3）滤去的是什么物质？得到的是什么？ 答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA

不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较学号

学校代码学号分类号密级 本科毕业论文 学院、系环境与资源学院 专业名称环境科学 年级2010级 学生姓名 指导教师 2014年5月

不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较 摘要 环境样品DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件，而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一，DNA的产量和纯度对后续的一系列的分子生物学技术操作如：多聚酶链反应(PCR)扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等，都会产生很大的影响，所以后续试验有效进行，必须要先获得一定纯度、数量、有较好代表性和适当片段长度的DNA。本文针对三种典型的土壤类型（壤土、粘土和沙土），对目前应用比较广泛的三种不同的DNA 提取方法和四种不同的DNA 纯化方法的效果进行了比较。经过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对从三种典型土壤中提取和纯化的DNA的浓度和纯度进行检测，结果表明：Power Soil? DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提，异丙醇沉淀纯化方法的结合能提供满足环境组学研究的宏基因组测序要求的DNA。关键词：土壤微生物,DNA,提取,纯化

Comparison of DNA extraction and purification methods from different soils Abstract The extraction and purification of DNA from environmental samples is not only a prerequisite for microbial research, and is one of the environmental metagenomics most critical technical issues, the yield and purity of DNA on the subsequent series of molecular biology techniques operate such as: polymerase chain reaction (PCR) amplification,restriction enzyme digestion, the nucleic acid hybridization, etc. will have a huge impact, if follow-up tests effectively, you must first obtain a certain purity, quantity, better DNA fragments representative and appropriate length. In this paper, we have compared several different methods of DNA extraction and purification for three different soil, loam, sandy clay . After a NanoDrop spectrophotometer and by agarose gel electrophoresis and purified from the extract of the soil of three DNA concentration and purity, and the results showed that: Power Soil ? DNA extraction kit and phenol-chloroform extraction and isopropanol precipitation purification methods' combined provides the right DNA for the study of environmental groups metagenomic sequencing. Keywords:Microbial soil, DNA , Extraction, Purification

DNA的粗提取与鉴定练习题

DNA的粗提取与鉴定 一、选择题共15小题。 1．有时候，由于实验材料用品所限而需要设法替代。下列各项中正确的是（） A. 做植物细胞有丝分裂实验时，可用蒜叶代替洋葱 B. 做植物细胞质壁分离和复原实验时，可用30%的食盐溶液代替30%的蔗糖溶液 C. 做叶绿体色素提取和分离实验时，可用乙醇代替丙酮 D. 做DNA粗提取与鉴定实验时，可用新鲜猪血代替鸡血 2．在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是 A．稀释血液，冲洗样品B．使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C．使血细胞破裂、增大DNA溶解量D．使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA 3、下列操作中，对DNA 的提取量影响较小的是 A ．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA 等核物质 B ．搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动 C ．在析出DNA 黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增加 D ．在用酒精沉淀DNA 时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却 4．在实验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原理是 ①DNA在NaCl的物质的量浓度为0.14 mol/L时溶解度最低②DNA在冷却的体积分数为95%的酒精中能沉淀析出 A．两次都是①B．两次都是② C．第一次是①，第二次是②D．第一次是②，第二次是① 5．向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是 A．加快溶解DNA的速度B．加快溶解杂质的速度 C．减少DNA的溶解度，加快DNA析出D．减少杂质的溶解度，加快杂质的析出6．对三次过滤的叙述中，不正确的是 A．第一次过滤后，核物质存在于滤出的固体物中 B．第二次过滤后，使用多层纱布，DNA存在于纱布上的黏稠物中 C．第三次过滤后，DNA存在于滤液中，可进一步除去非DNA物质 D．上述B、C均正确 9．在此实验中，具有和蛋白水解酶相似作用的物质是 A．蒸馏水B．NaCl溶液C．NaOH溶液D．盐酸10、在DNA提取实验中有三次过滤： （１）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液（２）过滤含粘稠物的0.14mol/LＮaCl溶液（３）过滤溶解有ＤＮＡ的２mol/LＮaCl溶液以上三次过滤分别为了获得 Ａ、含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含ＤＮＡ的滤液 Ｂ、含核物质的滤液、滤液中ＤＮＡ粘稠物、含ＤＮＡ的滤液 Ｃ、含核物质的滤液、滤液中ＤＮＡ粘稠物、纱布上的ＤＮＡ Ｄ、含较纯的ＤＮＡ滤液、纱布上的粘稠物、含ＤＮＡ的滤液 11 ．在“DNA 的粗提取实验”中，有两次DNA 的沉淀析出，其依据的原理是 ①DNA 在物质的量浓度为0 . 14mol / L 的氯化钠中的溶解度最低 ②DNA 在冷却的体积分数为95 ％的酒精中能沉淀析出 A ．两次都是① B ．第一次是①，第二次是② C．两次都是② D ．第一次是②，第二次是① 12. DNA 的粗提取和鉴定实验，与下列哪项原理无关 A . DNA 在0.14mol / L NaCl 溶液中的溶解度最低 B . DNA 易被龙胆紫染成紫色 C ．在DNA 溶液中加入二苯胺，加热后产生蓝色 D ．加入95 ％的冷酒精，DNA 会从溶液中析出

磁珠法土壤基因DNA提取试剂盒

磁珠法土壤基因组DNA提取试剂盒 MagBeads Soil DNA Extraction Kit ［目录号】SMDE-5005、SMDE-5010 【运输条件】2~25 C； 【保存条件】磁珠分散液2~8 C；蛋白酶K -20 C；其它组分室温保存; 【试剂盒组成】 【注意事项】 1. 磁珠悬浮液严禁反复冻融和离心，以免磁珠受到损害，使用前务必充分混匀； 2. 使用前请检查裂解液1和裂解液2是否出现沉淀，如有沉淀请将试剂瓶置于65 C水浴中温热至 液体澄清； 3. 蛋白酶K长期不使用，请置于-20 C保存，融化后4C保存，并尽快使用； 【产品简介】 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的干燥土壤中提取基因组DNA。试剂盒采用独特的缓冲液

体系，在裂解液环境中基因组DNA与磁珠高效结合，经过清洗和洗脱等步骤之后，可去除土壤中的杂质与腐植酸，获得高质量基因组DNA产物，OD260/OD280比值一般在1.7~1.9之间, 可直接用于酶切、PCR、电泳、Southern Blot、分子标记等下游分子生物学实验。 【试剂盒说明】 【自备仪器、耗材和试剂】 手动普通版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、EP管（2.0mL ）、EP管配套用磁力架、异丙醇、无水乙醇、RNase A 溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH值8.0）。 手动高通量版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、48孔尖底板、48孔板配套专用磁力架、超强 磁板架48孔板专用硅胶盖、异丙醇、无水乙醇、RNase A溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 值8.0 ）。 【手动普通版】 本操作方法在2.0mL EP管中进行操作。 1. 释放土壤微生物 称取100~500mg 土壤样本至2.0mL EP管中，依次加入1.0mL裂解液1和20卩蛋白酶K， 涡旋振荡1~3min，将土壤样本分散均匀，58 C温浴10min，期间每隔5min颠倒3次混匀内容物。 注：1）如需去除RNA，请额外加入5 RNase A溶液；2）干燥的土壤样本请研磨至均一细小颗粒，有助于微生物的高效释放。 2. 获得土壤基因组DNA粗液 室温、12000rpm将EP管离心5min，然后转移全部上清液至新的 2.0mL EP管中。加入 400卩裂解液2，颠倒混匀，再次室温、12000rpm将EP管离心5min。 3. 核酸结合 转移全部上清液至另一只2.0mLEP管，依次加入400卩屏丙醇和50卩磁珠悬浮液（提前摇晃均匀），涡旋振荡5min。 4. 磁性分离 将EP管置于磁力架上静置约20s至磁珠吸附完全，如EP管内盖有残留磁珠，可保持EP管

土壤DNA提取

1 试验材料 吉林省松江河镇人参栽培土壤。每份土壤样品经多点取样后充分混匀，用前过10 目筛，去除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。 1 . 2 仪器设备及药品 电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、 电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。 TENP 缓冲液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100mmol/L Na Cl，1% PVP，pH 10.0）、CTAB 提取缓冲液（100mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5mol/L Na Cl，1%CTAB，pH 8.0）、 SDS 提取缓冲液（100 mmol/LTris，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L Na Cl，pH8.0，灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L）、 异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓冲液、DNAMarker 等。 主要试剂有十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、异硫氰酸胍，均为分析纯级。 1 .3 试验方法 1.3.1 土壤微生物的洗涤取土壤样品2g，置于50m L 灭菌的离心管中；加入10m L TENP 缓冲液[3]悬浮土样，磁力搅拌器搅拌15 min；10000r/min 离心5min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本无色；最后将沉淀收集至1.5ml 离心管中。 1.3.2 DNA 的提取 1.3. 2.1 CTAB 法按照李钧敏[4]的方法略作改动。将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→65℃水浴2h→8000r/min，室温离心15 min，取上清→加入等体积氯仿：异戊醇（24∶1），12,000r/min 离心10 min，取上清→加入0.6 倍体积的异丙醇，4℃淀过夜→12000 r/min 4℃离心20min 收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100 μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。 1.3. 2.2 SDS 法按照焦晓丹[5]的方法略作改动。取沉淀，重悬于500μl SDS 提取缓冲液，轻轻混匀→向管中加入50μL 20%SDS 溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA 断裂→65℃保温2h，每隔20min 轻轻摇匀1 次→加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇（24∶1），混匀后12000r/min 离心10min，取上清→加入2 倍体积的无水乙醇，静止于室温下2h →以12000r/min 离心20min，收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。

土壤总DNA的几种提取方法

土壤总DNA的几种提取方法 SDS 高盐法(方案1) 具体步骤: 称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末; 将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl 蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r·min - 1振荡30 min ; 加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r·min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次; 用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r·min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中. 变性剂加SDS 高盐法(方案2) 具体步骤： 取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次; 转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r·min - 1 离心10 min ,取上清; 在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r·min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀. SDS-酚氯仿抽提法（方案3） 称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为 2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200Ul TE 溶解。 冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4） 取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻

实验——DNA的粗提取与鉴定

实验DNA的粗提取与鉴定 目的要求 1.了解实验原理。 2.学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。 3．通过本实验培养实验操作能力和观察能力。 实验原理 1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mOl／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 注意事项 1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。 2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。 实验用具 鸡血细胞液（5～10mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0．1g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol／L和0．015mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100mL，1个，50mL，500mL，各2个），漏斗，试管（20mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。 课时安排一课时 课前准备 制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。（也可以用离心机离心2 min（转速1000转/分）。用吸管吸去上清液。 板书（提前写好） DNA的粗提取与鉴定

湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术

微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1130?1137 Microbiology China ? 2010 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@https://www.wendangku.net/doc/b52901374.html, 基金项目：国家973计划前期研究专项项目(No. 2009CB125909) *通讯作者：Tel: 86-471-4991676; : ndzj@https://www.wendangku.net/doc/b52901374.html, 收稿日期：2010-01-25; 接受日期：2010-05-24 摘 要: DNA 分子生物学技术的广泛应用, 为全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA 的方法, 即氯化钙-SDS-酶法。在直接提取DNA 过程中采用氯化钙去除腐殖酸, DNA 提取缓冲液中不使用EDTA 螯合剂, 提取过程用时4 h 左右。与其他两种方法相比, 该方法高效去除湿地土壤腐殖酸, 纯度较高, 满足PCR 扩增, 为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA 提取和纯化技术。 关键词: 湿地土壤, DNA 提取, 腐殖酸, PCR 扩增, 氯化钙-SDS-酶法 DNA Extraction and Removing Humic Substance from Wetland Soil LI Jing-Yu 1 ZHAO Ji 2* BIAN Yu 2 WU Lin-Hui 2 YU Jing-Li 2 (1. College of Life Sciences , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) (2. College of Environment & Resources , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) Abstract: DNA-based molecular biology techniques have widely been used as a powerful tool to un-derstand the microbial community. In this paper, a new method to extract microbial genomic DNA from wetland soil was established, namely Calcium Chloride-SDS-Enzymatic. Calcium chloride rather than EDTA chelating agent was used to remove humic acids in the process of direct DNA extraction. The extracting time is less than 4 hours. In comparing with other two methods, this method is more efficient in removing humic acids from wetland soil, and the purity of extracted DNA is higher which can be ap-plied to PCR amplification. It provides an efficient technology to extract and purify microbial genome DNA from soil for microbial ecological studies. Keywords: Wetland soil, DNA extraction, Humic acid, PCR amplification, Calcium chloride- SDS-enzymatic 从土壤和沉积物样品中提取微生物总DNA 是研究微生物多样性的前提和基础, 方法大致可以分为直接提取和间接提取两大类[1]。直接提取法获得DNA 的量较大, 但腐殖酸的存在会影响到下游的分 析[2]。为了获得纯度较高的微生物总DNA, 需要对其进行纯化处理。纯化处理的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法[3]、PVPP 纯化法[4]、CTAB 法[5]、氯化铯密度梯度离心法[6]、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树

实验室土壤DNA提取方法

改良CTAB-SDS法 1、称取1 g土壤样品，加1ml DNA提取液（0.1 mol/L Tris-Hcl；0.1 mol/L EDTA； 0.1 mol/L 磷酸钠；1.5 mol/L Nacl；1％CTAB；pH 8.0,将各种试剂按配置的体积数称量混合即可。），在漩涡震荡仪上混匀。 2、加入100ul溶菌酶温和37℃裂解30min,液氮冷冻10 min，65℃水浴10 min，反复冻融3次。 3、加入20％ SDS缓冲液溶液100μl，65℃水浴2h，每20 min轻轻颠倒几次。8000 r/min离心10 min，取上清。 4、剩余残渣中再加500μl DNA提取液和100μl SDS 缓冲液，65℃水浴30 min，8000 r/min室温离心10 min，取上清，合并两次的上清液。 5、等体积的氛-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提2至3次(氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次)，静置10min，12000rpm，10min取上清。 6、加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的无水乙醇混匀，4℃沉淀过夜。 7、13000 r/min离心5 min，70%乙醇清洗2次，30μl ddH 2 O溶解。 8、提取粗DNA在0.6%（1%）的Agrose，70 V（100V）电压下电泳1.5 h（40min）。注意事项：这个千万不要4℃过夜啊，4℃过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。 提取土壤微生物总DNA的纯度和浓度检测 对提取的土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,同时采用紫外分光光度计分别测定提取土壤微生物总DNA稀释液在230 nm，260 nm，280 nm处的光 密度值。以OD 260/OD 280 （DNA/蛋白质），OD 260 /OD 230 （DNA/腐植酸）比值检测DNA纯 度。 DNA浓度=OD 260 值×50μg／ml×80×DNA 溶液体积／干土质量[68]

土壤基因组DNA提取试剂盒使用说明

土壤基因组DNA提取试剂盒使用说明 货号：D2600 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。 试剂盒内容：D2600-50T D2600-100T 溶液A25ml50ml 溶液B3ml6ml 溶液C5ml10ml 溶液D10ml20ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液10ml20ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 PCR增强剂500ul1ml 说明书1份1份 注：试剂盒开封后溶液A、B、C、D需在2-8℃保存。PCR增强剂-20℃保存。 产品简介: 本试剂盒适合于从褐土、淤泥、火山灰等各种极端土壤环境中提取微生物DNA。对土壤中各种细菌、真菌有很好裂解效果，最大限度的保留了微生

物DNA的多态性。 本试剂盒采用我公司特有的腐殖质吸附材料，可高效专一的去除各种腐殖质成分而丝毫不会影响DNA的产率，纯度较酚、氯仿抽提法提高数倍。使用本试剂盒提取的DNA产量大、完整性好，可直接用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。 操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、称取土壤样本0.1-0.5g，在液氮中充分研磨成细粉末，加入450ul溶液A震荡混匀。 *也可直接称取样本0.1-0.5g于离心管(建议使用2ml圆底管)，加入450ul溶液A剧烈震荡混匀1-2min至没有固体块。使用液氮研磨效果最佳。 2、加入50ul溶液B充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，65℃水浴6min，每2min充分颠倒混匀一次。 3、加入100ul溶液C充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，12000rpm离心10min。 4、将上清转移到新的离心管，12000rpm离心2min。 5、在吸附柱中加入200ul溶液D，将离心后的上清加入到带有溶液D 的吸附柱中，用移液器吹吸几次混匀，12000rpm离心1min。 6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱(必须)，12000rpm离心1min。

课题5DNA的粗提取与鉴定-温州第二高级中学

【课题】：课题5 DNA的粗提取与鉴定【主备人】：苗贤举 【备课时间】： 3月10日【审核人】：宋利刚 【复习目标】 本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。 【复习重点与难点】 复习重点：DNA的粗提取和鉴定方法。 复习难点：DNA的粗提取和鉴定方法。 【知识回顾】一、实验原理 1、提取DNA的方法 提取生物大分子的基本思路是。对于DNA的粗提取而言，就是要利用、等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 1）DNA的溶解性 思考题1：DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点？对此有什么应用？ 思考题2：利用什么原理来将DNA与蛋白质分离开？ 2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解，但是对没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80o C的高温，而DNA在以上才会变性。洗涤剂能够瓦解，但对DNA没有影响。 3）DNA的鉴定 思考题3：依据什么原理来鉴定DNA？ 在条件下，DNA遇会被染成色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。 二、实验设计 1、实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑，但是使用的生物组织，成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料： 鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌 2、破碎细胞，获取含DNA的滤液 1）制备和提取细胞核物质：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例。 在鸡血细胞液中加入一定量的，同时用搅拌，得到鸡血细胞液。过滤后收集研磨液； 如果实验材料是植物细胞，需要先用溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的和，进行充分的搅拌和研磨。过滤后收集研磨液。 思考：①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ ②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ ③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响? ④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 2）溶解细胞核的DNA： 向收集的滤液中加入的溶液，搅拌使DNA呈溶解状态。 3、去除滤液中的杂质 方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。 思考： ①为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？ ②方案二与方案三的原理有什么不同？

PowerSoil 试剂盒提取土壤DNA

PowerSoil 试剂盒提取土壤DNA 1、加入0.25g 土壤样品到一个PowerBead Tubes中。 2、轻轻涡旋混匀。 3、检测Solution C1。若出现沉淀，60℃水浴至全溶解。 4、加入60μl Solution C1，上下颠倒数次混匀。 5、把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速（3200rpm，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5~10min）涡旋连续振荡10min。 6、室温10000g离心30s。 7、转移上清至一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。 8、加入250μl Solution C2到上清中，涡旋混匀5s。4℃孵育5min。 9、室温10000g离心1min。 10、避开沉淀小珠，转移上清≤600μl 到一个新的收集管（2ml Collection Tube）中。 11、加入200μl Solution C3到上清中，涡旋混匀。4℃孵育5min。 12、室温10000g离心1min。 13、避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中。 14、Solution C4 使用前先摇匀。加入1200μl Solution C4到上清中，涡旋混匀5s。 15、加载约675μl 上清到Spin Filter 中，室温10000g离心1min。弃去滤液，继续加载675μl 上清，室温10000g离心1min。重复直至过滤完所有上清。（每个样品共需加载3 次。） 16、加500μl Solution C5到Spin Filter 中，室温10000g离心30s。 17、弃去上清 18、室温10000g 离心1min。 19、小心转移Spin filter 到2ml Collection Tube 中，尽量避免Solution C5 污染。 20、加入100μl Solution C6到白色滤膜中心。 21、室温10000g 离心30s。 22、弃去Spin Filter。此时收集管中的DNA 可直接用于下游实验，无需进一步纯化。DNA 冷冻保存（-20℃~-80℃）。

土壤DNA提取的解决专家

土壤DNA提取的解决专家简介 土壤样品含有大量的微生物，其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。从土壤样品中提取DNA是研究土壤微生物最为有效的方法。目前从土壤样品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和间接法。直接法是指把土壤样品放在裂解液中，经过有效的破壁方法使微生物的DNA全部释放到裂解液中，然后再进行分离提取，如Zhou的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中，如Buffer PBS等，把微生物从土壤中分离出来，然后再进行DNA的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金属盐对DNA 提取带来的影响，但是这种方法会丢失许多微生物，得到的DNA 并非土壤样品中的全基因组(宏基因组)，目前已经很少研究者会采用这种方法。从土壤样品中直接提取DNA可最大可能性地获得全基因组，但是这种方法却面临以下几个问题： 1.腐殖酸的污染。土壤中，特别是森林，草地土壤含有非常丰 富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有机物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常类似，在纯化过程中非常难于去除。微量的腐殖酸污染都会导致下游应用，如PCR，酶切的失败。 2.裂解方法。土壤样品中含有各种微生物，如细菌和真菌等。 革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁，让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组DNA的关键。由于土壤样品的复杂性，使用酶法(如溶菌酶，破壁酶，蜗牛酶)或液氮研磨都不可行，因为土壤中含有各种金属离子或抑制因子导致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。 3.DNA得率难于控制。土壤样品或因肥沃，或因贫瘠，或因含 水量丰富，或因干枯，或因取样的深浅度，都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品DNA含量往往会差别成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化学成分，如重金属盐，粘土物质都会造成DNA得率降低。 Magen公司的HiPure Soil DNA Kit采用硅胶柱纯化技术，是专门为土壤DNA提取为设计的。该试剂盒采用玻璃珠研磨法和热激化学破壁法，可不需特殊的珠磨仪，在涡旋仪就可进行，适合于广大的研究室。试剂盒中Absorber Reagent是Magen公司独家开发的腐殖酸吸附剂，能高效去除各种腐殖酸的污染。此外还采用无醇的硅胶柱纯化方式，可高效去除土壤中各种可溶性金属盐，以及其它可溶性的抑制因子。该试剂盒已经成功地提取如下土壤(部分是客户反馈)：自然保护区森林的土壤(长达30-40年森林土壤，表层有30-50cm落叶层)，红树林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，矿石区泥土，有机物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空调管道堆积物等。实验方法 为表明该试剂盒的优势性，我们选择以下不同组织样品进行DNA 提取实验，每个样品重复3次。 ●森林类样品：自然保护区森林土壤(广东黑石顶自然保护区) 和海南岛红树林保护区 ●矿石区样品：矿石区水底土壤(湿)和矿石区地表土壤(干) ●耕地样品：稻田土壤，菜地土壤 ●有机物污染地表样品：污水沟衍泥和生活垃圾堆放区 操作方法（按HiPure Soil DNA Kit试剂盒进行）简单描述以下：1.取0.5g土壤到2ml匀浆管中。加入0.9ml Buffer SOL/SDS， 高速涡旋5-10分钟裂解细菌或真菌。 2.70o C水浴10分钟进一步裂解细菌。 3.加入0.3ml Buffer PS涡旋混匀； 4.加入0.3ml Absorber Solution，涡旋混匀。 5.13,000xg离心5分钟。 6.取上清。加入结合液混匀后上柱。 7.洗涤柱子三次。 8.加入适当量的Elution Buffer洗脱即可。 实验结果 1.DNA电泳结果 取10 ul 纯化的基因组DNA上样于0.8%琼脂糖凝胶，80V电泳30分钟，结果如下。 0.5g森林类土壤样品 (前两个自然保护区森林土壤，后两个为红树林土壤) 0.5g耕地类土壤样品 A: 水稻田土壤 , B: 玉米土壤 A: 生活垃圾堆放地 , B: 污水沟底泥

高中生物必修二实验十一 DNA的粗提取与鉴定

实验十一 DNA 的粗提取与鉴定 教学目的 1． 初步掌握DNA 粗提取和鉴定的方法。 2． 观察提取出来的DNA 物质。 实验原理 1． DNA 在NaCl 溶液中的溶解度是随NaCl 的浓度变化而改变的。DNA 在0．14mol/L 的NaCl 溶液中的溶解度最低，据此可使溶解于NaCl 溶液中的DNA 析出。 2． DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA 。 3． DNA ＋二苯胺??→?沸水浴蓝色（用于DNA 的鉴定） 实验步骤 1．材料制备 0.1G/ml 柠檬酸钠100ml 500ml 烧杯→玻璃棒搅拌→1000r/min 离心2min →吸去上清液→ 活鸡血180ml 即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡血细胞自行沉淀） 2．方法步骤 取血细胞液5-10ml ＋20ml 蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌 （1）提取血细胞核物质 纱布过滤，滤液中含DNA 和其他核物质，如蛋白质 原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂 （2）溶解核内DNA ：滤液＋2mol/L NaCl 溶液40ml ，玻璃棒沿一个方向搅拌 （3）析出含DNA 的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl 溶液相当于稀释到0．14mol/L ） （4）滤取含DNA 的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA 的粘稠物留在纱布上 （5）（纱布上的）DNA 粘稠物再溶解： 20ml2mol/L NaCl 溶液 50ml 烧杯， 上述粘稠物 缓慢搅拌3 min （6）过滤含DNA 的2mol/L NaCl 溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA （7）提取含杂质较少的DNA ：上述溶液＋95%酒精，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝装物卷起。 （8）DNA 鉴定： 实验关键： 本实验成功的关键是获取较纯净的DNA ，因此应注意： 1．充分搅拌鸡血细胞液。DNA 存在于鸡血细胞核中。将鸡血细胞与蒸馏水混合以后，应用 玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，并释放出DNA 2．沉淀DNA 必须用冷酒精。实验前必须准备好大量95%的酒精，并在冰箱中（5℃以下）至少存放24小时。 3．正确搅拌含有悬浮物的溶液。在第（3）、（5）步骤，玻璃棒不要直插烧杯底部，且搅拌

一种土壤微生物总DNA的高效提取方法

土　壤 (Soils), 2004, 36 (6): 662~666 　 一种土壤微生物总DNA的高效提取方法① 黄婷婷１ 曹 慧１ 王兴祥２ 崔中利１，　２＊　 （1 南京农业大学农业部环境微生物工程重点开放实验室南京210095； 2 中国科学院南京土壤研究所南京210008） 摘 要 获得高浓度、大片段、多样性程度高的土壤微生物总DNA 是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。本文采用间接法(菌体细胞回收法)提取红壤地区两种土壤类型的土壤微生物总DNA，定量计算其回收率，并与直接法(细胞原位裂解法)比较了提取效率和纯度。结果表明：红壤地区2种土壤每克干土的总DNA 提取量，间接法约为0.34和0.53μg/g干土，直接法约为13.62和24.32μg/g干土；间接法的提取效率低于直接法，但所得DNA片段较大，且Sau 3AⅠ酶切和16 S rDNA通用引物PCR扩增结果显示，间接法比直接法更能有效地去除土壤中的某些抑制剂，所得总DNA的纯度更高，有利于后续操作。 关键词土壤微生物；总DNA提取；细胞回收；粗DNA纯化 中图分类号 S154 土壤微生物生态系统极为复杂，在很大程度上还是未知的。土壤微生物不仅是土壤中物质循环的驱动力，其代谢物也是植物的营养成分，其活动能直接影响到土壤的物理、化学性质[1, 2]。可以说，土壤微生物生态系统是一个巨大的、潜在的科研和经济价值远未得到开发的微生物资源库。目前可在实验室培养的微生物还不到自然界中微生物总数的1%，还有相当多的菌种因为无法人工培养而未被人类所认识[3]。随着分子生物学技术的发展，PCR的指纹技术、DNA文库、FISH、Microarray等技术被广泛应用于土壤微生物群落结构以及基因资源的开发利用，丰富拓展了人们对土壤中不可培养微生物的认识[4, 5]。 分子生物学技术研究土壤微生物群落结构的实质是用土壤微生物DNA的不均一性来反映土壤微生物的种群结构特征。因此，获得高浓度、大片段、多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA 是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。由于土壤样品中含有较多的腐质酸和粘粒等抑制物质，这些物质可对内切酶消化、PCR扩增、杂交等后续操作产生强烈的影响[6, 7]，因而提取与纯化土壤微生物总DNA在研究中尤为重要[8, 9]。 已报道的从土壤样品中提取DNA的方法有很多种，主要可分为直接法和间接法两类。直接法是直接对样品进行裂解，然后从裂解物中获得DNA；而间接法则是先从土壤中回收细胞再提取DNA。和直接法相比，间接法获得的DNA分子量更大，纯度更高，但不可避免的，该法得到的DNA产率有所降低。由于人们普遍认为较高的DNA得率更能代表大部分的土著微生物种群和遗传多样性[10]，目前进行基因文库构建时大多仍采用直接法提取土壤总DNA。但最近研究显示，直接法包含的高DNA 得率并不一定代表了种群的丰富度，并且序列的代表性也受到所采取的不同提取方法的影响，且有研究发现由直接法建立的基因文库中还包含了大量真核生物的基因片段。由于真核生物基因增加基因文库的大小但其遗传信息并不能在原核宿主载体中表达，因此间接法为构建更高质量的基因文库提供了条件[11]。本文采用间接提取法对两种植被条件下红壤的总DNA进行提取，并与直接提取法比较了提取和纯化的效率，为红壤地区微生物群落结构多样性分析以及功能性基因的获得奠定了基础。 １ 材料与方法　 １．１ 研究区域概况与土壤样品采集　 研究区域位于江西省鹰潭市余江县。该区域具有中亚热带温暖湿润的季风气候，年均温为17.8℃，年均降雨量为1785 mm，且主要集中在4~6月；地 ①国家自然科学基金项目（40371069），中国博士后科学基金项目（2003033495）和中国科学院创新项目( KZCX3-SW-417)资助。*通讯作者(czl@https://www.wendangku.net/doc/b52901374.html,)