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超高效液相色谱_串联四极杆飞行时_省略_代谢产物野黑樱苷的定性和定量分析_高萌

２０１４年６

月Ｖｏｌ．３２　

Ｎｏ．６Ｊ

ｕｎｅ　２０１４　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

５９１～５９９

研究论文

ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ

．１１２３．２０１４．０１０２１＊通讯联系人．Ｔｅｌ：（０７９１）８７１１９６０９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｒａｏｙ

ｉ９９＠１２６．ｃｏｍ．基金项目：国家重点基础研究发展计划（“９７３”计划）项目（２０１０ＣＢ５３０６０２）．收稿日期：２０１４－０１－

１３超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱和超高效液相

色谱－串联三重四极杆质谱用于血浆中苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷的定性和定量分析

高　萌１，　王跃生３，　魏惠珍１，　欧阳辉２，　何明珍２，　

曾恋情１，　申峰云１，　郭　强１，　饶　毅１＊

（１．江西中医药大学，江西南昌３３０００４；２．中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，

江西南昌３３０００６；３．中国中医科学院中药研究所，北京１００７００

）摘要：建立了大鼠灌胃麻杏石甘汤后血浆中苦杏仁苷、野黑樱苷的定性及定量方法。样品经液液萃取净化处理，定性采用超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱仪（ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳ），经Ｓｈｉｍ－ｐ

ａｃｋ　ＸＲ－ＯＤＳⅢ色谱柱（７５ｍｍ×２．０　ｍｍ，１．６μｍ）分离，定量采用超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪（ＵＰＬＣ－Ｑ－ＴＲＡＰ－ＭＳ），经ＡｇｉｌｅｎｔＣ１８色谱柱（

５０　ｍｍ×２．１　ｍｍ，１．７μｍ）分离，电喷雾负离子化（ＥＳＩ）及ＭＲＭ模式测定，流动相均为乙腈－０．１％（ｖ／ｖ

）甲酸水溶液。结果显示苦杏仁苷、野黑樱苷在相应浓度范围内线性关系良好（相关系数分别为０．９９９　０、０．９９７　０），精密度（ＲＳＤ）小于９．２０％，回收率为８２．３３％～９５．２５％，检出限（ＬＯＤ）约为０．５０　ｎｇ

／ｍＬ。本方法快速简便，

为血浆样品中苦杏仁苷、野黑樱苷的定性和定量分析提供良好参考。关键词：超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱；超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱；苦杏仁苷；野黑樱苷；大鼠血浆

中图分类号：Ｏ６５８文献标识码：Ａ文章编号：１０００－８７１３（２０１４）０６－０５９１－

０９Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｉｎ　ｐｌａｓｍａ　ｂｙｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｆｌｉｇ

ｈｔｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎｄ　ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑ

ｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ　ｔｒｉｐｌｅ　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ

ＧＡＯ　Ｍｅｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｙｕｅｓｈｅｎｇ３，ＷＥＩ　Ｈｕｉｚｈｅｎ１，ＯＵＹＡＮＧ　Ｈｕｉ　２，ＨＥ　Ｍｉｎｇ

ｚｈｅｎ２

，ＺＥＮＧ　Ｌｉａｎｑｉｎｇ１，ＳＨＥＮ　Ｆｅｎｇｙｕｎ１，ＧＵＯ　Ｑｉａｎｇ１，

ＲＡＯ　Ｙｉ　１＊（１．Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　

３３０００４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈｅｒｂａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　

３３０００６，Ｃｈｉｎａ；３．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍａｔｅｒｉａ　Ｍｅｄｉｃａ，Ｃｈｉｎａ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　

１００７００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｐｒｕｎａｓｉｎｉｎ　ｒａｔ　ｐｌａｓｍａ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｘｉｎｇ　

ｓｈｉｇａｎ　ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉ－ｆｉｅｄ　ｂｙ　ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃ－ｔｒｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　

ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍｔｒｉｐｌｅ　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｆｔｅｒ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｌｉｑｕｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　ａ－ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍａ　ｓａｍｐｌｅ　ｗａｓ　ｐ

ｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｏｎ　ａ　Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＸＲ－ＯＤＳⅢＨＰＬＣ　ｃｏｌｕｍｎ（７５　ｍｍ×２．０　ｍｍ，１．６μｍ），ｕｓｉｎｇ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｓｏ－ｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｏｎ　ａ　Ｔｒｉｐｌｅ　ＴＯＦ　５６００　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃ－ｔｒｏｍｅｔｅｒ．Ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍａ　ｓａｍｐｌｅ　ｗａｓ　ｐ

ｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ａｎ　Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｃ１８ＨＰＬＣ　ｃｏｌｕｍｎ（５０　ｍｍ×２．１　ｍｍ，１．７μｍ），ｕｓｉｎｇ　

ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－

色谱第３２卷

０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｏｎ　ａｎ　ＡＢ　Ｑ－ＴＲＡＰ　４５００ｔｒｉｐｌｅ　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｏｐｅｒａｔｅｄ　ｉｎｎｅｇａｔｉｖｅ　ｉｏｎ　ｍｏｄｅ　ａｎｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）ｍｏｄｅ．Ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍａ　ｓａｍｐｌｅ．Ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉ－ｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ｗａｓ　１．０５－４　２００　ｎｇ／ｍＬ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　０．９９９　０　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｗａｓ　１．２５－２　４９０　ｎｇ／ｍＬ　ｗｉｔｈｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　０．９９７　０．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ（ＲＳＤｓ）ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　９．２０％ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｖｅｒａｌｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｖａｒｉｅｄ　ｆｒｏｍ８２．３３％ｔｏ　９５．２５％．Ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔｓ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤｓ）ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｗｅｒｅ　０．５０　ｎｇ／ｍＬ．Ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｒｅｐｒｏ－ｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ，ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｔｈｅ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｉｎ　ｐｌａｓｍａ　ｓａｍｐｌｅ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ　ｂｙ　Ｍａｘｉｎｇ　ｓｈｉｇａｎ　ｄｅ－ｃｏｃｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳ）；ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ　ｔｒｉ－ｐｌｅ　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＵＰＬＣ－Ｑ－ＴＲＡＰ－ＭＳ）；ａｍｙｇｄａｌｉｎ；ｐｒｕｎａｓｉｎ；ｒａｔ　ｐｌａｓｍａ

麻杏石甘汤最早见于汉代张仲景所著《伤寒论》一书，由麻黄、苦杏仁、石膏、甘草４味药材组成。具有辛凉宣泄，清肺平喘功效。其中苦杏仁为常用止咳平喘药，有小毒，归肺、大肠经［１］。苦杏仁中的有效成分是苦杏仁苷（ａｍｙｇｄａｌｉｎ，结构式见图１）。苦杏仁苷为医药上常用的祛痰止咳剂、辅助性抗癌药［２］，苦杏仁含有苦杏仁苷约２．４％，苦杏仁苷受杏仁中的苦杏仁酶及樱叶酶等水解，依次生成野黑樱苷（ｐｒｕｎａｓｉｎ，结构式见图１）和扁桃腈，再分解生成苯甲酸和氢氰酸［３］。

近年来对于复杂成分的定性和定量分析，尤其是人或动物体液中微量成分的测定方面，液相色谱－质谱联用作为一种高效互补的分离鉴定技术，具有灵敏度高、结果准确等特点而得到广泛应用［４－６］。根据文献报道［７－１１］，目前采用液相色谱－质谱联用技术对大鼠体内苦杏仁苷的研究存在定量限较高，样品处理复杂，且在口服药物后未能检测到苦杏仁苷原型的问题，而对苦杏仁苷代谢产物仅有定性分析。另据报道，对大鼠进行苦杏仁生品水煎液灌胃给药和苦杏仁苷注射给药，结果显示苦杏仁苷注射给药后在血浆样品中可检测到苦杏仁苷原型，而灌胃给药后则未检测到原型，只能检测到其代谢产物野黑樱苷［１２－１４］。本研究首先采用液相色谱－四极杆飞行时间质谱（ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳ）联用技术，根据精确质量数测定及ＭＳ／ＭＳ分析大鼠灌胃麻杏石甘汤后的血浆样品，检测到了代谢产物野黑樱苷及苦杏仁苷原型，同时使用液相色谱－三重四极杆质谱联用仪（ＵＰＬＣ－Ｑ－ＴＲＡＰ－ＭＳ）对待测物进行定量分析，为探讨麻杏石甘汤中苦杏仁活性成分的体内变化过

程提供科学参考

。

图１　苦杏仁苷和野黑樱苷的结构式

Ｆｉｇ．１　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｕｎａｓｉｎ

１　实验部分

１．１　仪器、试剂与材料

仪器：岛津ＬＣ－３０Ａ液相色谱－ＡＢ　Ｔｒｉｐｌｅ　ＴＯＦ５６００四极杆飞行时间质谱联用仪（数据采集Ａｎａ－ｌｙｓｔ　ＴＦ　１．６　ＡＢｓｃｉｅｘ；数据分析Ｐｅａｋ　Ｖｉｅｗ　ｓｏｆｔｗａｒｅＶｅｒｓｉｏｎ　１．２．０．３）；岛津ＬＣ－３０Ａ液相色谱－ＡＢ　Ｑ－ＴＲＡＰ４５００三重四极杆质谱联用仪（数据采集Ａｎａ－ｌｙｓｔ　１．６．１　ＡＢｓｃｉｅｘ）；万分之一天平（ＡＢ１０４－Ｎ，梅特勒－托利多）；十万分之一天平（岛津ＡＵＷ２２００电子分析天平）；超声波清洗仪（ＫＱ－２５０ＤＢ，昆山市超声仪器有限公司）；Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超纯水仪（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）；台式离心机：ＴＧＬ－１６Ｃ（上海安亭科学仪器厂）；涡旋仪：ＩＫＡ　Ｖｏｒｔｅｘ　Ｇｅｎｉｕｓ　３；低温保存箱：ＤＷ－４０Ｌ２６２（青岛海尔特种电器有限责任公司）。

对照品：苦杏仁苷对照品购自中国药品生物制品检定所（批号１１０８２０－２０１００４）；野黑樱苷对照品购自碧伊（上海）化学科技有限公司（批号

２

９

５

第６期高　萌，等：超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱和超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱用于血浆中苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷的定性和定量分析

ＢＢＰ０２１７８）；氯霉素（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ，内标）对照品购自中国药品生物制品检定所（批号１３０３０３－２００６１４）。

试剂：甲酸、甲酸铵（Ｓｉｇｍａ公司）；乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷（分析纯，上海实验试剂有限公司）；水：娃哈哈纯净水，经Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ超纯水仪过滤；ＨＰＬＣ级甲醇、乙腈（Ｆｉｓｈｅｒ公司）。

饮片：生麻黄（北京市双桥燕京中药饮片厂，批号８１２０１８）、炙甘草（北京市双桥燕京中药饮片厂，批号１００３０３５）、制苦杏仁（江中（武宁）中药饮片有限公司，批号１２０１３０）、生石膏（北京市双桥燕京中药饮片厂，批号９０８０８９）。

动物：清洁级ＳＤ大鼠，雄性，体重为（２２０±２０）ｇ，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号ＳＣＸＫ（湘）２０１１－０００３。

１．２　实验步骤

１．２．１　标准储备溶液和工作溶液的配制

精密称取苦杏仁苷、野黑樱苷和氯霉素对照品适量置于２５　ｍＬ容量瓶中，用甲醇配制成质量浓度分别为８４．０、９９．６和１２．４　ｍｇ／Ｌ的标准储备液，４℃冷藏，备用。

分别吸取不同体积的苦杏仁苷标准储备液，用甲醇逐级稀释成质量浓度为４　２００、２　１００、１　０５０、５２５．００、１０５．００、５２．５０、１０．５０、５．２５、１．０５和０．５３ｎｇ／ｍＬ的系列标准溶液；分别吸取不同体积的野黑樱苷标准储备液，用甲醇逐级稀释成质量浓度为２　４９０、１　２４５、６２２．５０、２４９．００、１２４．５０、２４．９０、１２．４５、６．２３、１．２５和０．６２　ｎｇ／ｍＬ的系列标准溶液。

分别吸取苦杏仁苷和野黑樱苷标准储备液各１０　ｍＬ置于２０　ｍＬ容量瓶中混合，用甲醇逐级稀释成系列混合标准溶液，其中苦杏仁苷质量浓度分别为４　２００、２　１００、１　０５０、５２５．００、１０５．００、５２．５０、１０．５０、５．２５、１．０５和０．５３　ｎｇ／ｍＬ；野黑樱苷质量浓度分别为２　４９０、１　２４５、６２２．５０、２４９．００、１２４．５０、１２．４５、６．２３、１．２５和０．６２　ｎｇ／ｍＬ。

１．２．２　麻杏石甘汤药液的煎煮

按麻杏石甘汤处方比例（麻黄、杏仁、石膏和甘草质量比为６∶６∶２４∶６）取各味饮片，先称取麻黄药材、石膏药材，加入方药总质量的８倍水，称重，计算煎煮前的总重。加热至沸腾，然后改用小火煎煮３０ｍｉｎ，再加入甘草、苦杏仁煎煮４０　ｍｉｎ，补重，趁热过滤，即得麻杏石甘汤汤剂，于８０℃旋转浓缩至１ｇ／ｍＬ药液。密封后－２０℃储存，备用。１．２．３　给药与样品采集健康ＳＤ大鼠，雌雄各半，实验前１２　ｈ禁食不禁水，灌胃１．２．２项下制得的麻杏石甘汤药液，连续７天，在末次给药１　ｈ后，大鼠心脏取血至含肝素钠的ＥＰ离心管中，立即离心３　０００　ｒ／ｍｉｎ×１０　ｍｉｎ后取上层血浆分装，置于－４０℃冰箱中冰冻待测。１．２．４　血浆样品处理

精密吸取１００μＬ血浆，加入３０μＬ内标溶液，加入１　ｍＬ的乙酸乙酯，涡旋混合提取５　ｍｉｎ，离心５　０００　ｒ／ｍｉｎ×５　ｍｉｎ，将有机层转移至另一离心管中，再加入１　ｍＬ的乙酸乙酯与水层涡旋混合提取５ｍｉｎ，离心５　０００　ｒ／ｍｉｎ×５　ｍｉｎ，合并两次乙酸乙酯液，合并液用Ｎ２在４０℃下吹干，残渣用１００μＬ甲醇溶解，涡旋５　ｍｉｎ，离心１５　０００　ｒ／ｍｉｎ×５　ｍｉｎ，取上清液，待测。

１．３　仪器分析条件

１．３．１　色谱条件

定性色谱条件：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＸＲ－ＯＤＳⅢ（７５　ｍｍ×２．０　ｍｍ，１．６μｍ）；柱温４０℃；进样量５μＬ；流速０．２５　ｍＬ／ｍｉｎ；流动相Ａ为０．１％（ｖ／ｖ）甲酸水溶液，流动相Ｂ为乙腈，梯度洗脱程序：０～１．５　ｍｉｎ，１％Ｂ；１．５～７．０　ｍｉｎ，１％Ｂ～１０％Ｂ；７．０～１０．０ｍｉｎ，１０％Ｂ～２０％Ｂ；１０．０～１５．０　ｍｉｎ，２０％Ｂ～９０％Ｂ；１５．０～１７．０　ｍｉｎ，９０％Ｂ；１７．１～２０．０　ｍｉｎ，１％Ｂ。

定量色谱条件：Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｃ１８（５０　ｍｍ×２．１　ｍｍ，１．７μｍ）；柱温４０℃；进样量２μＬ；流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ；流动相Ａ为０．１％（ｖ／ｖ）甲酸水溶液，流动相Ｂ为乙腈。梯度洗脱程序：０～０．０５　ｍｉｎ，１％Ｂ；０．０５～１．７０　ｍｉｎ，１％Ｂ～６３％Ｂ；１．７０～２．００ｍｉｎ，６３％Ｂ～９０％Ｂ；２．００～３．００　ｍｉｎ，９０％Ｂ；３．０１～４．００　ｍｉｎ，１％Ｂ。

１．３．２　质谱条件

定性条件：ＡＢ　Ｔｒｉｐｌｅ　ＴＯＦ　５６００四极杆飞行时间质谱仪采用电喷雾离子化（ＥＳＩ）源，喷雾电压（ＩＳ）：－４　５００　Ｖ，离子化温度（ＴＥＭ）：６００℃；雾化气（ＧＳ１）：４１３　６８５　Ｐａ；辅助加热气（ＧＳ２）：４８２　６３３Ｐａ；气帘气（ＣＵＲ）：２０６　８４３　Ｐａ；碰撞气（ＣＡＤ）：Ｍｅｄｉｕｍ；扫描模式：Ｎｅｇａｔｉｖｅ。一级质谱采集范围为ｍ／ｚ　１００～８００，累积时间２００　ｍｓ，二级质谱采集范围为ｍ／ｚ　９０～８００，累积时间１００　ｍｓ，碰撞能量（ＣＥ）４０　ｅＶ；碰撞能量叠加（ＣＥＳ）１５。

定量条件：ＡＢ　Ｑ－ＴＲＡＰ　４５００三重四极杆质谱仪采用ＥＳＩ源，多反应监测（ＭＲＭ）模式测定；喷雾电压（ＩＳ）：－４　５００　Ｖ，离子化温度（ＴＥＭ）：６００℃；雾化气（ＧＳ１）：４１３　６８５　Ｐａ；辅助加热气（ＧＳ２）：

３

９

５

色谱第３２卷

４８２　６３３　Ｐａ；气帘气（ＣＵＲ）：２０６　８４３　Ｐａ；碰撞气（ＣＡＤ）：Ｍｅｄｉｕｍ；优化的各离子对质谱参数值见表１。

图２　苦杏仁苷在正离子条件下的（ａ１）一级谱图、（ａ２）二级谱图及野黑樱苷在正离子条件下的（ｂ１）一级谱图、（ｂ２

）二级谱图Ｆｉｇ．２　（ａ１）ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ａｎｄ（ａ２）ＭＳ／ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ（ｂ１）ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ａｎｄ（ｂ２）ＭＳ／ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｉｎ　ｐ

ｏｓｉｔｉｖｅ　ｉｏｎ　ｍｏｄｅ表１　ＭＳ

／ＭＳ定量分析参数Ｔａｂｌｅ　１　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｆｏｒ　ＭＳ／ＭＳ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓＣｏｍｐｏｕｎｄＲｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ／ｍｉｎＰｒｅｃｕｒｓｏｒｉｏｎ（ｍ／ｚ）Ｐｒｏｄｕｃｔ

ｉｏｎ

（ｍ／ｚ）ＤＰ

／Ｖ

ＣＥ

／ＶＡｍｙｇｄａｌｉｎ　１．７５　５０２．１　３２３．０　４０　１９Ｐｒｕｎａｓｉｎ　１．８４　３４０．１　１６１．０　

９８　

２４Ｃｈｌｏｒａｍｐ

ｈｅｎｉｃｏｌ　２．１５　

３２２．０　

１５２．０　１０３　

２３

　ＤＰ：ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　

ｐｏｔｅｎｔｉａｌ；ＣＥ：ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ．２　结果与讨论

２．１　定性方法的建立与优化

野黑樱苷（分子式为Ｃ１４Ｈ１７ＮＯ６）为苦杏仁苷（分子式为Ｃ２０Ｈ２７ＮＯ１１）脱去一分子糖而得，均含有Ｎ原子，

因此首先对其选择正离子扫描进行分析。在前期实验中，采用超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪在正离子模式下对待测物分析，未发现野

黑樱苷［Ｍ＋Ｈ］＋

峰。在ｍ／ｚ　

３１８附近有一未知物，初步推断可能为野黑樱苷［Ｍ＋Ｎａ

］＋峰，但进一步分析该化合物发现其二级质谱与野黑樱苷无相关性，可能为一未知干扰物。为验证结果，使用了超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱仪对未知物

和野黑樱苷及苦杏仁苷进行分析，通过提取精确相对分子质量，拟合元素组成，偏差小于５　ｐｐ

ｍ，苦杏仁苷一级质谱图中显示ｍ／ｚ为４８０．１４６　

７（图２ａ１），推测为［Ｍ＋Ｎａ

］＋

分子离子峰，二级质谱图中信号最强的ｍ／ｚ为３４７．０９５　３（图２　ａ２），推测为母离子脱去中性碎片扁桃腈（Ｃ８Ｈ７ＮＯ），野黑樱苷一级质谱图（图２　ｂ１）中显示ｍ／ｚ为３１８．０９４　

０，推测为［Ｍ＋Ｎａ

］＋

分子离子峰，同时图中存在一个与野黑樱苷母离子精确质量数（ｍ／ｚ　３１８．０９４　

０）相近的质量数（ｍ／ｚ　３１８．３０７　６）。这两个精确质量数在四极杆飞行时间质谱中可以分辨，但是在分辨率低的三重四极杆质谱中难以区分，

因此对此未知干扰物进行了二级质谱确证，图２　ｂ２为野黑樱苷和未知干扰物的二级质谱碎片信息。野黑樱苷母离子（ｍ／ｚ３１８．０９５　４）和干扰物母离子（ｍ／ｚ　３１８．３０１　

５）的子离子为ｍ／ｚ　２５６．２６３　９、１８５．０４２　７、８８．０７６　５。通过对子离子拟合分子式，

得知子离子不是野黑樱苷的子离子，可能为未知物的子离子，并对野黑樱苷产生干扰；改变碰撞能量，干扰离子一直存在，对大鼠灌胃麻杏石甘汤后的血浆样品处理并进行质谱分析，

同样存在未知物干扰，且信号强度远大于待测物，干扰仪器测定。通过对对照品及血浆样品在该模式下进行质谱分析，结果均存在未知物干扰，因此

·４９５·

第６期

高　萌，等：超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱和超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱用于血浆中苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷的定性和定量分析

在采用三重四极杆质谱仪定量分析时要避免采用未知物的子离子为定量离子对。

苦杏仁苷在液相色谱电喷雾电离质谱联用技术

的正负离子模式下有良好的信号响应［

１５］

。选择负离子模式进行监测，

通过母离子扫描获得一级质谱图，均找到［Ｍ＋ＨＣＯＯ］

－

分子离子峰，苦杏仁苷和野黑樱苷的母离子分别是ｍ／ｚ　５０２．１５７　

１和ｍ／ｚ３４０．１０４　３。在负离子条件下，野黑樱苷响应值较高，

母离子精确质量数周围未发现干扰离子，有利于其检测。在选定母离子后，进行子离子扫描获得二

级质谱图，苦杏仁苷的主要特征碎片离子为ｍ／ｚ

３２３．０９７　７，野黑樱苷的主要特征碎片离子为ｍ／ｚ１６１．０４４　

４，通过对特征碎片离子拟合元素组成，偏差小于５　ｐｐｍ，分析为母离子脱去Ｃ８Ｈ８ＮＯ－碎片离子产生，

结果见图３。使用超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱仪在负离子模式对大鼠灌胃麻杏石甘汤后的血浆样品定性分析，

确认苦杏仁苷原型和代谢产物野黑樱苷的存在，并且无干扰物影响野黑樱苷的测定

。

图３　苦杏仁苷在负离子条件下的（ａ１）一级谱图、（ａ２）二级谱图及野黑樱苷在负离子条件下的（ｂ１）一级谱图、（ｂ２

）二级谱图Ｆｉｇ．３　（ａ１）ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ａｎｄ（ａ２）ＭＳ／ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ（ｂ１）ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ａｎｄ（ｂ２）ＭＳ／ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｉｎ　ｎｅｇ

ａｔｉｖｅ　ｉｏｎ　ｍｏｄｅ２．２　定量方法的建立与优化

质谱监测采用ＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ

／ＭＳ定性分析时负离子模式下的离子对。在优化色谱条件时考察了不同流动相体系（乙腈－甲酸水溶液和乙腈－水溶液）下待测物质的响应，结果显示在水相中添加适量甲酸有助于待测物质电离，信号强度明显提高。因此，本实验采用乙腈－０．１％（ｖ／ｖ）甲酸水溶液作为流动相，获得了最佳质谱灵敏度。２．３　样品前处理方法的选择与优化

血浆样品基质较为复杂，

用有机溶剂（甲醇、乙腈）沉淀蛋白法处理样品，内源性物质干扰较大，提取回收率低于液－液萃取法。本研究采用液－液萃取法对样品进行处理。考察了不同萃取溶剂（乙酸乙酯、乙酸乙酯－乙醚、二氯甲烷）、萃取次数及不同体积萃取溶剂等因素对回收率的影响。结果见表２，以乙酸乙酯作为萃取溶剂时，２　ｍＬ萃取溶剂分两次萃取，可获得较高的灵敏度和回收率，适用于体内微量成分的定量。

表２　采用不同方式、不同溶剂处理大鼠血浆样品时苦杏仁苷及野黑樱苷的回收率

Ｔａｂｌｅ　２　Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｉｎ　ｒａｔ　ｐ

ｌａｓｍａ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｌｖｅｎｔｓＣｏｍｐｏｕｎｄＰｒｅｃｉｐ

ｉｔａｔｉｏｎ／％Ｍｅｔｈａｎｏｌ　ＡｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ／％Ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ　Ｅｔｈｙ

ｌａｃｅｔａｔｅ－ｅｔｈｅｒ　Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ

Ａｍｙｇｄａｌｉｎ　８３．９３　８４．２０　８６．１５　６０．５４　６３．２７Ｐｒｕｎａｓｉｎ　

７４．０１　

７８．３２　

９１．００　

９０．２８　

７６．２１

５９５·

色谱第３２卷

２．４　定量方法的验证２．４．１　方法专属性

分别取大鼠空白血浆６份，

加入苦杏仁苷和野黑樱苷的混合对照品溶液及灌胃麻杏石甘汤后的含药血浆，按１．２．４项下方法处理，分别进样测定。色谱图见图４，在上述定量色谱及质谱条件下，４　ｍｉｎ内可测得大鼠血浆中苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷，血浆中内源性成分不干扰目标组分的测定。本方法分析速度快、

专属性高。２．４．２　定量限、

检出限和方法的线性范围取１

．２．１项下用甲醇配制好的１０个不同浓度的混合对照品溶液各１００μＬ，分别加入至空白血浆中并按１．２．４项下方法处理，分别进样２μＬ，以血浆中各成分的质量浓度Ｘ为横坐标，以待测物与内标物的峰面积比值Ｙ为纵坐标，用加权（Ｗ＝１

／Ｘ２）

最小二乘法进行回归，得各化合物在相应浓度范围内的线性方程、线性相关系数（ｒ）、定量限（ＬＯＱ，Ｓ／Ｎ≥１０）和检出限（ＬＯＤ，Ｓ／Ｎ＝３），结果见表３

。

图４　（ａ）空白大鼠血浆、（ｂ）空白大鼠血浆添加苦杏仁苷、野黑樱苷、氯霉素和（ｃ

）大鼠灌胃麻杏石甘汤后血浆样品的提取离子色谱图Ｆｉｇ．４　Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ，ｐｒｕｎａｓｉｎ　ａｎｄ　ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ｉｎ（ａ）ｂｌａｎｋ　ｒａｔ　ｐ

ｌａｓｍａ，（ｂ）ｂｌａｎｋ　ｐｌａｓｍａ　ｓｐｉｋｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｍｙｇ

ｄａｌｉｎ，ｐｒｕｎａｓｉｎ　ａｎｄ　ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ，（ｃ）ｐｌａｓｍａ　ｓａｍｐｌｅｏｂｔａｉｎｅｄ６０　ｍｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ（ｉｇ）ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｘｉｎｇ　

ｓｈｉｇａｎ　ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ表３　苦杏仁苷和野黑樱苷的线性范围、线性方程、相关系数、定量限和检出限

Ｔａｂｌｅ　３　Ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅｓ，ｌｉｎｅａｒ　ｅｑｕａｔｉｏｎｓ，ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ（ｒ），ＬＯＱｓ，ＬＯＤｓ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐ

ｒｕｎａｓｉｎＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅ／（ｎｇ

／ｍＬ）Ｌｉｎｅａｒ　ｅｑ

ｕａｔｉｏｎ　ｒ　

ＬＯＱ／（ｎｇ

／ｍＬ）ＬＯＤ／（ｎｇ

／ｍＬ）Ａｍｙｇｄａｌｉｎ　１．０５－４２００Ｙ＝０．０００３７５　Ｘ＋０．０００４８９０．９９９０　１．０５　０．５３Ｐｒｕｎａｓｉｎ　

１．２５－２４９０　

Ｙ＝０．００１１１　Ｘ＋０．０１２８　

０．９９７０　

１．２５　

０．６２

　Ｙ：ｐｅａｋ　ａｒｅａ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ａｎａｌｙｔｅ　ｔｏ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ；Ｘ：ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｎｇ

／ｍＬ．·

６９５·

２．４．３　精密度、回收率和基质效应

在空白血浆中分别添加高、中、低３个水平的对照品溶液，每个水平５份，按１．２．４项下方法处理，苦杏仁苷和野黑樱苷的平均回收率为８２．３３％～９５．２５％，日内ＲＳＤ和日间ＲＳＤ分别为３．２２％～７．８９％和５．７３％～９．１９％。按１．２．４项下方法处理６种不同来源空白血浆各１００μＬ，在处理后的空白样本中加入高、中、低３个浓度混合对照品溶液与内标溶液，进样分析，比较其与同浓度的对照品溶液响应值，计算基质效应。结果见表４。

表４　苦杏仁苷和野黑樱苷在不同添加浓度下的回收率、精密度和基质效应

Ｔａｂｌｅ　４　Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍａｔｒｉｘ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｐｉｋｅｄ　ｌｅｖｅｌｓ

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｓｐｉｋｅｄ／（ｎｇ／ｍＬ）Ｒｅｃｏｖｅｒｙ／％

（ｎ＝５）

ＲＳＤｓ／％（ｎ＝５）

Ｉｎｔｒａ－ｄａｙ　Ｉｎｔｅｒ－ｄａｙ

Ｍａｔｒｉｘ　ｅｆｆｅｃｔ／％

（ｎ＝６）

Ａｍｙｇｄａｌｉｎ　５．２５　９２．６０±３．１３　６．７３　７．３１　９８．３２±７．６０１０５．００　８６．１５±７．８２　３．２２　５．７３　１０２．８９±７．２３

１０５０　９０．３７±７．２０　５．５６　７．３８　１０４．１５±６．５４Ｐｒｕｎａｓｉｎ　６．２３　９５．２５±１３．３３　７．８９　８．４０　１００．５０±５．８１１２４．５０　９１．００±１１．４７　６．６２　７．３１　１０５．０５±６．９３

１２４５　８２．３３±７．１３　６．６６　９．１９　１０４．９５±７．１１

２．４．４　稳定性试验

配制标准血浆样品并测定，考察待测物在各种实验条件下的稳定性。在空白血浆中分别添加高、中、低３个水平的待测物标准溶液，按１．２．４项下方法处理，处理后在２３℃下２　ｈ内重复进样；４℃下２４　ｈ内重复进样；标准血浆样品经－４０℃反复冻融３次后测定；标准血浆样品经－４０℃条件下贮存３０天，考察样品的长期稳定性。结果见表５，含苦杏仁苷、野黑樱苷的血浆样品在２３℃条件下放置２　ｈ，４℃条件下放置２４　ｈ，－４０℃反复冻融３次及－４０℃冰冻条件下放置３０天条件下各成分的稳定性均良好，能满足测定要求。

表５　苦杏仁苷和野黑樱苷在不同添加浓度下的稳定性

Ｔａｂｌｅ　５　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｐｉｋｅｄ　ｌｅｖｅｌｓ

ＣｏｍｐｏｕｎｄＳｐｉｋｅｄ／

（ｎｇ／ｍＬ）

ＲＳＤｓ／％（ｎ＝５）

Ｂｅｎｃｈ－ｔｏｐ

（２３℃ｆｏｒ　２　ｈ）

Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ　ｒａｃｋ　ａｔ　４℃

ｆｏｒ　２４　ｈ

Ｔｈｒｅｅ　ｆｒｅｅｚｅ／ｔｈａｗ　ｃｙｃｌｅｓ

（－４０℃ｔｏ　２３℃）

Ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ａｔ－４０℃

ｆｏｒ　３０　ｄ

Ａｍｙｇｄａｌｉｎ　５．２５　５．５３　６．７９　３．２３　４．５１１０５．００　１．１０　４．４０　７．６８　３．１２

１０５０　０．０７　５．１１　７．３２　０．５７Ｐｒｕｎａｓｉｎ　６．２３　６．６７　９．２５　１０．６７　５．０７１２４．５０　１．３２　２．８０　９．９８　９．７３

１２４５　０．２３　９．２７　９．０２　１２．０４

２．５　血浆中苦杏仁苷及野黑樱苷的含量测定与分析研究证实，麻杏石甘汤具有提高动物免疫能力、抗菌、抗过敏［１６，１７］等作用，能有效抑制咳嗽的产生。“随证施量”是中医临床应用中主要的诊疗模式，随证施量是依据临床症状，改变药物用量，以达到增强疗效的作用。麻杏石甘汤在用于治疗咳嗽等病症时，主要通过改变苦杏仁用量来调整疗效。

实验建立了枸橼酸所致大鼠咳嗽模型，研究在此模型下麻杏石甘汤治疗咳嗽的作用效果，通过改变麻杏石甘汤中苦杏仁剂量，探索苦杏仁剂量与苦杏仁中活性成分在体内血药浓度的量效关系。为后期研究苦杏仁剂量与苦杏仁中活性成分在体内血药浓度及治疗效应间的量效关系提供数据参考。实验在原方的基础上，苦杏仁剂量逐渐递减、逐渐递增１．５倍７个剂量组，其他药材剂量不变，另设模型组、阳性组（可待因组）、空白组（见表６），按１．２．２项下方法煎煮，按文献［１８］换算成相应的大鼠灌胃剂量，每组灌胃８只大鼠，按１．２．３项下方法给药后取血浆，按１．２．４项下方法处理并测定。血浆中待测成分的血药浓度随麻杏石甘汤中苦杏仁剂量变化趋势见图５，大鼠灌胃麻杏石甘汤，血浆样品中可同时测到苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷，随着给药剂量逐级增加，体内苦杏仁苷及野黑樱苷含量呈增加趋势，麻杏石甘汤中苦杏仁剂量在１．１９～１３．５０　ｇ的变化范围内，苦杏仁剂量与苦杏仁苷、野黑樱苷血药浓度存在正相关性。

７

９

５

色谱第３２卷

表６　麻杏石甘汤中苦杏仁剂量的改变致大鼠血浆中苦杏仁苷、野黑樱苷浓度的变化（ｎ＝８

）Ｔａｂｌｅ　６　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓａｇｅｓ　ｏｆ　ａｌｍｏｎｄ　ｉｎ　Ｍａｘｉｎｇ　

ｓｈｉｇａｎ　ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｌｅａｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ａｎｄ　ｐ

ｒｕｎａｓｉｎ　ｉｎ　ｒａｔ（ｎ＝８）Ｇｒｏｕｐ　Ａｌｍｏｎｄ　ｄｏｓｅ／ｇ　

Ｒａｔ　ｉｇ　

ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｄｏｓｅ／（ｇ／ｋｇ）Ｐｌａｓｍａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｎｇ／ｍＬ）Ａｍｙｇｄａｌｉｎ　ＰｒｕｎａｓｉｎＵｎｔｒｅａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ－－０．００±０．０００．００±０．００Ｂｌａｎｋ　ｇｒｏｕｐ－－０．００±０．０００．００±０．００Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｇｒｏｕｐ　０００．００±０．０００．００±０．００１　１．１９　０．０９　０．４１±０．３９　０．５８±０．７９２　１．７８　０．１４　０．５３±０．４８　０．７６±１．２５３　２．６７　０．２１　０．１６±０．１８　１．４２±２．０１４　４．０００．３１　２．７１±０．４５　８．９６±１．６８５　６．０００．４６　１３．４７±２．５７　２１．７４±１３．２９６　９．０００．６９　４．７７±０．３８　２５．３８±１７．５０７　

１３．５０　

１．０４　

４１．５２±６．９８　

５０．９６±１８．５

４

图５　血浆中苦杏仁苷和野黑樱苷血药浓度随麻杏

石甘汤中苦杏仁剂量变化趋势图Ｆｉｇ．５　Ｃｈａｎｇｅ　ｔｒｅｎｄ　ｏｆ　ｐｌａｓｍａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｙｇ

ｄａｌｉｎａｎｄ　ｐｒｕｎａｓｉｎ　ｉｎ　ｒａｔ　ａｓ　ｄｏｓｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ａｌｍｏｎｄｉｎ　Ｍａｘｉｎｇ　

ｓｈｉｇａｎ　ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ３　结论

本研究通过超高效液相色谱－串联四极杆飞行

时间质谱仪测定精确相对分子质量，快速准确定性苦杏仁苷和野黑樱苷，排除未知物干扰，避免假阳性结果。同时使用超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪对待测物定量分析，

仪器灵敏度高，方法前处理简单，定量限约为１　ｎｇ／ｍＬ，分析过程时间短，仅需４　ｍｉｎ，有利于血浆样品中待测成分的测定，为研究血浆中苦杏仁苷、

野黑樱苷浓度与麻杏石甘汤中苦杏仁剂量的相关性研究提供技术支持。结果显示在枸橼酸所致大鼠咳嗽模型中，大鼠灌胃麻杏石甘汤，汤剂中苦杏仁剂量从１．１９　ｇ增加到１３．５０　ｇ时，血浆样品中可同时测到苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷，且随着给药剂量逐级增加，大鼠体内苦杏仁苷及野黑樱苷含量呈增加趋势，苦杏仁剂量与苦杏仁苷、

野黑樱苷血药浓度存在正相关性，为研究苦杏仁剂量与苦杏仁中活性成分在体内血药浓度及治疗效应间的量效关系提供数据参考。此外，本方法利用超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱仪可快速准确定性待测成分的离子对，排除未知物对待测成分的干扰，

使待测成分在低分辨率的超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪上能够准确测定，可为生物样品中其他待测成分的鉴别和定量提供参考。参考文献：

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９

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安捷伦高效液相色谱仪的规范操作

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的：明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作，确保数据的准确性。 2. 范围：适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责：检验人员对此负责。 4.操作规程：系统组成本系统由1个溶剂二元输送泵（分主/A泵和副/B泵）、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的μm滤膜过滤，超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常将待测样品按要求前处理，准备HPLC 所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。开机： 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后，双击[Instrument 1 Online]图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏]，[ 显示状态工具栏]，[系统视图],[样品视图]，使其命令前有[√]标志，来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。

4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标，点击[设置泵…]选项，进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速：5ml/min，点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[启动]，点击[确定] ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[关闭]，点击[确定]关泵，关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标，点击[设置泵…选项]，设流速：min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击[确定]。数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法：从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项，如下图所示选中除[数据分析]外的三项，点击[确定]，进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息（如：测试方法）。 4.4.2.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min，在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同]，使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省

液相色谱-串联质谱法

消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星测定?液相色谱-串联质谱法 Determination of clobetasol propionate and levofloxacin hydrochloride in disinfection product - LC-MS-MS method 1 范围本方法规定了膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量的测定。取样量为0.1g时，本方法对丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限见表1。表1 丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限、保留时间和特征离子中文名称英文名称检出限（μg/g）保留时间（min）特征离子(m/z) 丙酸氯倍他索Clobetasol propionate 0.009 7.83 467.0/355.2/373.4 盐酸左氧氟沙星Levofloxacin hydrochloride 0.06 1.11 362.0/260.9/318.2 2 规范性引用文件 3 原理试样中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星用甲醇提取，提取液经0.45μm滤膜过滤，用C18柱分离后，用液相色谱-串联质谱仪测定，正离子扫描，离子对定性，峰面积定量。 4 试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为不含有机物的纯水，纯水中干扰物的浓度需低于方法中待测物的检出限。 4.1甲醇：农药残留级。 4.2乙腈：农药残留级。 4.3甲酸：分析纯。

4.4标准品：丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星均购自中国药品生物制品检定所，纯度≥99.8%。 4.5标准溶液：准确称取丙酸氯倍他索适量，用乙腈－水（1：1）配制成100μg/mL 的标准贮备液。准确称取盐酸左氧氟沙星适量，用纯水配制成100μg/mL的标准贮备液。准确量取上述标准贮备溶液适量，用乙腈稀释配制成浓度为10.0μg/mL 的混合标准中间溶液，将标准中间溶液转移到安瓿瓶中于4 C保存。临用前，再根据需要用甲醇配制成不同浓度的标准使用溶液。 4.6甲酸溶液(0.2%，v/v)：量取2mL甲酸，用纯水定容至1000mL。 4.7 0.45μm滤膜。 5 仪器 5.1 液相色谱-串联质谱联用仪：HP1100高效液相色谱仪(Agilent) - API 4000质谱仪(Applied Biosystems) ，电喷雾离子化源(ESIMS，NI/PI模式)。 5.2 分析天平：感量0.1mg和0.001g。 5.3实验室纯水机：Barnstead纯水机。 5.4涡旋振荡器：Scientific Industries 涡旋振荡器。 5.5 具塞试管：10mL。 6 试样的制备与保存 6.1 试样的制备取有代表性样品5g，搅拌均匀，制成实验室样品。 6.2 试样保存制备好的试样置于室温保存。 7 测定步骤 7.1样品前处理称取0.1g~0.2g样品(精确到0.001 g) ，置于10mL试管中，加入3.00mL甲醇溶液，涡旋振摇使样品分散后，超声振荡10min。静置，吸取上清液经滤膜（4.7）过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

Waters_2695_型高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动，当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（ 1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（ 4 ）页输入后按【Exit 】；在第（6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

高效液相色谱-串联质谱法

附件面膜类化妆品中氟轻松检测方法（高效液相色谱-串联质谱法） 1范围本方法规定了面膜类化妆品中氟轻松的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于面膜类化妆品中氟轻松的定性定量测定。 2方法提要面膜类化妆品用饱和氯化钠溶液分散，用乙腈从分散液中提取氟轻松，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀提取液中大分子基质，经固相萃取小柱净化，用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，采用保留时间和特征离子对丰度比定性，以待测物质相对应离子峰面积定量，以标准曲线法计算含量。本方法的检出限为0.03 μg/g，定量限为0.05 μg/g。 3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为纯化水。 3.1甲醇：色谱纯。 3.2乙腈：色谱纯。 3.3冰醋酸：优级纯。 3.4饱和氯化钠溶液。 3.5 10%亚铁氰化钾溶液：称取115 g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6·3H2O固体，

用水溶解定容至1000 mL。 3.6 20%乙酸锌溶液：称取239 g乙酸锌C4H6O4Zn·2H2O固体，用水溶解定容至1000 mL。 3.7Oasis HLB固相萃取小柱或相当者：60 mg，3 mL。 3.8 标准物质：氟轻松，纯度不小于99.0%；标准物质的分子式、相对分子质量、CAS登录号、化学结构图参见附录A。 3.9 标准储备液（ρ=1g/L）：准确称取氟轻松标准物质（3.8）10mg，精确到0.01 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，于－18℃下冷冻保存。 3.10 标准工作溶液：临用时，取标准储备液（3.9）适量，用乙腈稀释成0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL系列浓度的标准工作溶液。 4仪器和设备 4.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（ESI源）。 4.2 分析天平：感量0.0001g；0.00001g。 4.3 涡旋混合器。 4.4离心机：转速5000r/min，容量10mL；50mL。 4.5 固相萃取装置。 5分析步骤 5.1样品处理 5.1.1提取称取样品（带有载体的面膜，去除载体后取样）0.2 g，精确至0.0001 g，置15 mL具塞离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液（3.4），于涡旋混合器上混合使样品分散，准确加入2 mL乙腈，充分涡旋提取2 min，以

高效液相色谱仪操作三要点

高效液相色谱仪操作三要点高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC 也已成为不可或缺的分析仪器。和其它分析仪器一样，你若想让HPLC 很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。但要是总结归纳一下，最重要的有三点：脱气、过滤和冲洗。本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC 分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮助。更欢迎有经验的专家介绍使用经验，提出好建议。一、脱气流动相脱气对于避免HPLC 系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。HPLC 系统内是不希望有气泡存在的。HPLC 泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS 不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外，气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。所以，必须注意消除流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如PTFE 管）渗透进流动相中。如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免，或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种： 1. 吹氦脱气法。利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在0.1MPa 压力下，以约60 mL/min 流速通入流动相储液容器中10～15min，可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80%的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L 氦气通过1L 流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好，但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法。 2. 加热回流法。此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。 3. 抽真空脱气法。此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa 即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。4. 超声波脱气法。

液相色谱串联质谱联用技术-实验指导(许煊炜)

液相色谱串联质谱联用仪检测技术实验指导（2014、2015级）课程内容（一个实验8学时）：（1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。（2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。吉林农业大学农业部参茸质检中心 2017.03

实验一AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用一.实验目的和意义通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。（一）检测仪器 1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。 2、仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。 3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量范围：（5 ~ 1700）amu 分辨率：> 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N > 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度：< 0.01%（全质量数范围） 4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。4500QTRAP 的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。

高效液相色谱法的标准操作规程

高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

通则0512高效液相色谱法

高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外－可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。（3）流动相

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项一、操作步骤： 1.开机前先将流动相过滤和超声：水流动相用混合滤膜（0.2μm）过滤,有机流动相用有机滤膜过滤，之后超声脱气15-20分钟。（过滤的目的是除去流动相里的杂质，以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱；超声的目的是排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响柱效能）注：试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜，第一次使用时感觉效果不好，于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。 2.超声结束后，将流动相放置到规定位置（1号泵接水流动相，2号泵接有机流动相），开机逐个排气（先启动泵，排气结束后再打开检测器）。 3.排气结束后，关闭所有排气阀。先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，基线走稳之后，再打开水流动相（注意：水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min），继续走基线，直到基线平稳。注意：实验结束后，再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，冲出色谱柱内残留的样品物质，预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内，导致下次使用难以冲出，色谱柱柱压偏高，基线不稳，出现大量鬼峰。（不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同） 4.走基线时，应将进样阀处于Load状态，用注射器进样时应快速进样，进样后将进样阀立即扳回到Inject状态，此时液相系统开始进入采样状态。采样结束后，可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑，也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。二、使用中常见的问题及注意事项 1.过滤时有时会出现流动相漏液。可能的原因是滤膜放置不正确（有点偏）和接头有点错位，导致流动相从缝隙中漏出。注意：操作时，应先向滤瓶内倒入少量流动相，观察是否漏液并开始过滤，若未漏液，再向滤瓶中添加流动相。 2.超声时，瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面，否则流动相内的气体可能无法排出液体，气体仍然残留在流动相内，以致开机排气时无气泡排出。

固相萃取-高效液相色谱串联质谱法

固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料奶中5种环境雌激素残留量的研究李雪1,2，牟光庆1，陈历俊1,2,*，姜铁民2 （1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034； 2.北京三元食品股份有限公司，北京100076）摘要：建立固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A）的方法。原料乳用NH2-SPE固相萃取小柱进行富集，旋转蒸发浓缩后，采用高效液相色谱串联质谱法测定。实验结果表明：各待测物在0.01 ~0.5μg/mL 范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.9978，加标回收率为68.5%~105.6%，RSD 为2.56%~7.59%，最低检出限为0.22 ~0.56μg/L（S/N=3）。本方法操作简便，快速灵敏，适合于牛奶中痕量环境雌激素的残留分析检测。关键词：高效液相色谱串联质谱，固相萃取，环境雌激素，原料奶，残留检测Research of the determination of 5 kinds of environmental estrogens residues in raw milk by solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry LI Xue1,2,MU Guang-qing1,CHEN Li-jun1,2,*,JIANG Tie-min2 （1.College of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University , Dalian 116034,China; 2.Beijing Sanyuan Foods Co., Ltd, Beijing 100076,China） Abstract: A solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of environmental estrogens including estrone,estradiol,estriol,diethylstilbestrol and bisphenol A in raw milk was established. 5 kinds of environmental estrogens were extracted from the raw milk sample by a NH2-SPE column, and concentrated with a rotary evaporator. The extract was analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric.Results showed that:a good linear range from 0.01~0.5μg/mL with correlation coefficient of above 0.9978 was obtained.The extraction recovery were 68.5%~105.6% and the relative standard deviation were 2.56%~7.59%.The limit of detection was 0.22~0.56μg/L(S/N=3).The descri bed method was simple,sensitive and accurate. *通讯作者：陈历俊，chlj@https://www.wendangku.net/doc/bb3313329.html,。作者简介：李雪(1986-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全。基金资助：奶牛产业技术体系北京市创新团队建设项目；国家科技部“863”计划(2011AA100903) 。

浅谈液相色谱串联质谱

浅谈液相色谱质谱联用技术刘谦保定出入境检验检疫局，保定 071000 摘要：液相色谱-质谱联用技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点，在药物分析，食品检测等领域有广泛的应用。关键词：液相色谱质谱食品检测高效液相色谱是一种准确度高，分离范围广的快速分离方法，它对化合物的结构破坏性小，适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度，对于未知化合物的结构分析定性十分准确，对相应的标准样品要求也比较低。质谱可以和气相联用如GC/MS,也可以和高效液相色谱联用如HPLC/MS。由于色谱和质谱灵敏度相当，再加上分离效果很好的色谱可以作为质谱的进样系统，质谱作为色谱的鉴定仪速度快，分离好，应用广。色谱-质谱联用成为最好的用于分析微量有机混合物的仪器。在1970年后，质谱-质谱法（mass separetion-mass spectra Characterization）迅猛发展起来。这种方法让母离子进一步裂解，从而获得裂解过程和分子结构的信息，通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等。我们知道，质谱的分析建立在物质离子化的基础上，按照荷质比分离离子，通过测量离子谱峰的强度实现分析目的。通过色谱纯化后的样品气化离子化形成的离子在电场和磁场的综合作用下，按照质量数和电荷数的比值大小依次排列成谱被记录下来。常见的质谱图的纵坐标是离子信号强度，横坐标就是离子核质比。在液相色谱质谱中通常所用的离子源有ESI 和APCI，我们常用的是ESI。ESI 是比APCI软电离程度较小的电离方式，应用范围较APCI 的大，只有少部分有机分子ESI 做不出，可以用APCI 辅助解决问题。一般用ESI 和 APCI 搭配使用比 ESI 和APCI 的应用范围更广一些。下面说一说ESI和API源的异同点。 ESI 和APCI通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子，源参数调整简单，容易使用，仪器灵敏度高。对APCI源来说，不足就是给出的结构信息有限，样品易发生热裂解，低质量时基线噪声大。ESI通常只产生分子离子峰，可以直接测定混合物，并可以测定热不稳定的极性

高效液相色谱操作手册

转 HP1100高效液相色谱使用说明书注意事项: 1使用前，应申明样品名称和特性以及使用的流动相。 2更换色谱柱应由中级仪器实验室完成。 3溶剂必须经微孔滤膜过滤，所有废弃物(溶液等)请带走自行处理。 4不得在计算机上进行与实验无关的操作。 5注意适时更换废液收集瓶，防止废液溢出。 6认真登记实验记录。 7相关论文发表后，应送一份复印件给中级仪器实验室。北京大学化学学院中级仪器实验室一、概述 HPLC1100系统构成如下： 1 流动相A B C D 2 真空脱气装置3、6、9、11 电缆 4 输液泵 5 自动进样器（无）7 柱温箱8 检测器（DAD） 10 数据接收处理控制系统（计算机）12 打印机13 手动进样器 1．指示灯状态每个部件接通电源后，LED灯显示绿色；黄色Not Ready 绿色Run 红色Error 2．四元泵系统的工作原理图

3．柱温箱的特征 ●可以在低于室温10℃至80℃间恒温 ●空间大，可以容纳三根30cm长的柱子 ●安装柱识别可以记录进样次数 ●两个单独的加热区 ●可以程序升温 4．检测器 HP1100高效液相色谱仪配置的单光路二极管阵列检测器的光路如下所示：光源发出的复合光经消除色差透镜系统聚焦后，照射到流通池上，透射光经全息凹面衍射光栅色散后，投射到一个由1024个二极管组成的二极管阵列上而被检测。此光路系统中光闸是唯一的运动部件，它有三个动作位置：（1）光闸将入射光束全部遮挡，以进行暗电流补偿；（2）将氧化钬滤光片插入光路，对衍射后的波长进行精确校正；（3）打开光闸使入射光通过样品流通池照在光栅上。

HP1100系统所有控制和操作基本在计算机上完成，熟悉软件十分重要。本系统操作是基于Windows NT的多窗口多任务操作系统，要注意窗口之间可能覆盖。根据所选色谱柱的性能，本系统可用于分子量小于2000的各种化合物的分离分析。目前中级仪器实验室仅备有ODS反相柱（可用于弱极性化合物及弱离子型化合物的分析）。一般要求自备色谱柱。自备色谱柱应使用HP系列接口，大连化物所及天津Autoscience公司可提供，一般分析柱的价格在1600－2000元之间，HP进口柱价格在4000元人民币左右。本系统可提供多达四元体系的各种梯度淋洗，但在选择溶剂时须十分小心。流动相选择对分离分析有着重要的影响。二、开机打开各部分电源，脱气装置、输液泵、柱温控制、检测器的指示灯变黄。开启计算机，若有选项，选择开启Windows NT4.0。点START－PROGRAM－HPChemStation－Instl online，计算机开始与仪器联接，并打开各控制界面，此时，各单元指示灯变绿，在工具条的View中选择界面为Runcontrol。在第一个小窗口中利用下拉菜单，选择显示界面为Method and Run Control；在第二个小窗口中选择已设定的使用方法（若是旧用户则有记录），新用户先编辑实验方法，然后选工具栏中Method－Save Method As（具体见后）。第三个小窗口中显示LC操作条件。三、样品分析 1．溶剂的处理和设置不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器，降低泵的性能。遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器的寿命： ●使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌 ●用滤膜过滤溶剂去除微生物 ●每二天更换或过滤溶剂 ●避免溶剂瓶直接日照各洗脱液应分别过滤，注意有机相和水相应使用不同的滤膜。避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂： ●卤化物碱金属溶液和相应的酸溶剂 ●高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸 ●能够形成卤素自由基或酸的卤化物试剂及其混合物 ●含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂过滤吸收氧化物 ●在有机溶剂中的有机酸溶剂 ●含有强络合剂的溶液 ●四氯化碳和异丙醇或THF混合物溶剂的设置：在输液泵图标上按鼠标左键，在出现的小菜单中选Setup Pump，在Solvents栏中输入A、B、C、D溶剂名称；点溶剂瓶图标，在Solvent Bottles Filling中输入A、B、 C、D各溶剂的实际体积数。点OK确定并退出。 2．设置泵的参数点输液泵图标，选Setup Pump，出现流速控制界面。设定流速flow rate（一般ODS

高效液相色谱使用方法

高效液相色谱使用方法一、开机 1、开机前准备：流动相使用前必须过0.45um的滤膜（有机相的流动相必须为色谱纯；水相必须用新鲜注射用水，不能使用超过3天的注射用水，以防止长菌或长藻类）；把流动相放入溶剂瓶中。A瓶：为水相B瓶：为有机相。 2、打开电脑，选Win 2000，进入Win 2000界面。 3、双击CAG Boodp server图标，放大CAG Boodp server小图标，出现窗口，5min内打开液相各部件电源开关，等待1100广播信息后，表示通讯成功连接，关闭CAG Boodp serve窗口。 4、双击online图标，仪器自检，进入工作站。该页面主要由以下几部分组成： ——最上方为命令栏，依次为File，Run Control，Instrumen…等； ——命令栏下方为快捷操作图标，如多个样品连续进行分析、单个样品进样分析、调用文件保存文件……等； ——中部为工作站各部件的工作流程示意图；依次为进样器-输液泵-柱温箱-检测器-数据处理-报告； ——中下部为动态监测信号； ——右下部为色谱工作参数：进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。 4、从“View”菜单中选择“Method and control”画面。二、编辑参数及方法 1、开始编辑完整方法：从“Method”菜单中选择“New method”，出现DEF-LC.M，从“Method”菜单中选择“Edit entire method”，选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项，单击OK，进入下一画面。 2、方法信息：在“Method Comments”中加入方法的信息，如方法的用途等。单击OK，进入下一画面。 3、泵参数设定：

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