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双水相萃取法分离纯化月季花色素_信璨

双水相萃取法分离纯化月季花色素_信璨
双水相萃取法分离纯化月季花色素_信璨

第34卷第2期

河北联合大学学报(自然科学版)Vol.34No.22012年4月Journal of Hebei United University (Natural Science Edition )Apr.2012

收稿日期:2011-

08-23基金项目:河北省科技攻关项目(06240223D -4)文章编号:2095-

2716(2012)02-0056-05双水相萃取法分离纯化月季花色素

信璨,常丽新,贾长虹

(河北联合大学化学工程学院,河北唐山063009)

关键词:双水相;月季花色素;分离纯化

摘要:采用PEG400/Na 2SO 4双水相体系分离纯化月季花色素,确定了月季花色素的双水相

体系组成为25%PEG 400与18%Na 2SO 4,

并通过实验探讨了温度、色素粗提液体积、pH 值对萃取效果的影响。结果表明,色素粗提液体积对萃取效果影响最大,其次为pH 值和温度。最

佳萃取条件为:pH 2.0;粗提液体积1mL ;温度30?。在此条件下,月季花色素的萃取率为98.

45%。双水相萃取法是分离纯化植物色素的有效方法。

中图分类号:TQ314.1文献标志码:A

月季,别名四季花、月季红,属蔷薇科植物。月季花的主要活性成分为黄酮和酚酸类化合物,另外还有芳

香油、

鞣质、色素等[1]。月季花气味清香,味淡,微苦,有活血调经的功能[2]。月季花色素属花青苷类色素[3],是一种有效的自由基清除剂,对超氧阴离子自由基、羟自由基有一定的清除效果[4]。双水相萃取法

快速、操作简便、可回收利用、投资少、能够保持物质的生物活性[5],被广泛应用于生物化学、生物化工、细胞

生物学等领域[6]。本文采用聚乙二醇/硫酸纳双水相体系[7]分离纯化月季花色素,为双水相萃取法分离纯化植物色素提供依据。

1

实验材料和仪器1.1实验材料

红色月季花瓣于2010年8月采自河北联合大学校园内。将采集的新鲜红色月季花瓣用自来水快速冲洗干净,再用去离子水漂洗,于40 50?下烘干,粉粹,过60目筛后待用。

1.2实验试剂

聚乙二醇(PEG 400,600,1000,2000)购于拜尔迪生物技术有限公司,分析纯;无水乙醇、无水硫酸钠、浓

盐酸、氢氧化钠等购于北京化工厂,分析纯。

1.3实验仪器

JA2003电子天平,上海上平仪器公司;JJ -1A 精密定时电动搅拌器,江苏金坛荣华仪器制造有限公司;DK -S26型电热恒温水浴锅,北京长安科学仪器厂;PHS -3C 酸度计,上海理达仪器厂;KQ -400KDB 高功率数控超声波清洗器,常州诺基仪器有限公司;800-离心机,江苏金坛城西小阳电子仪器厂;752型紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;DHG -9140A 电热鼓风干燥箱,上海-恒科学仪器有限公司;RE -2000旋转蒸发器,成都雅荣生化设备有限公司。

2实验方法

2.1月季花色素粗提液的制备

准确称取5.0000g 月季花粉末,按1:20的料液比加入95%乙醇[8]浸泡1h ;用49KHZ 的超声波[9]提取

25min 后静置1h ;再用49KHZ 超声波提取25min ;3000r /min 离心15min 后滤纸过滤,用一定量石油醚萃取;真空旋蒸后放置在50?烘箱12h ,得到的液体充分溶解在95%的乙醇溶液中,并定容在100mL 的容量瓶中,待用。

2.2月季花色素精制品的制备

准确称取20.0000g 月季花粉末,按1:20的料液比加入95%乙醇浸泡1h ;用49KHZ 的超声波提取25min 后静置1h ;再用49KHZ 超声波提取25min ;3000r /min 离心15min 后过滤,用一定量石油醚萃取;提取

液50?下真空旋蒸;旋蒸后液体过AB -8大孔树脂,

并用60%的乙醇洗脱;洗脱出的液体真空旋蒸后放入50?烘箱过夜。得到月季花色素精制品。

2.3最大吸收波长的测定

取月季花色素精制品0.0500g 用95%的乙醇溶解,定容在10mL 容量瓶中。并加入2滴0.1%的HCL ,

颜色呈红色,测定其在400 650nm 之间的吸光度[10],月季花色素吸光度如图1所示

图1月季花色度吸收光谱图

由图1可见,月季花色素在530nm 处有最大吸收峰,吸光度为1.721A 。

2.4双水相体系的配制

小烧杯中加入一定量的PEG ,一定量的无水硫酸钠,一定量的去离子水,一定体积的月季花色素粗提

液,

使双水相总质量为10g ,用磁力搅拌器搅拌至两相充分混匀,2000r /min 离心5min ,以加速相分离过程。用胶头滴管吸取上、下相溶液,分别测定上、下相体积,并分别测定530nm 下的吸光度[11]。

相比为R =V u /V d ;分配系数为K =C u /C d ;萃取率为Y =1/(1+1/RK )。式中,

V u —上相体积(mL );V d —下相体积(mL );C u —上相月季花色素的质量浓度(mg /mL );C d —下相月季花色素的质量浓度(mg /mL )。3

结果与讨论3.1标准曲线

取0.6500g 月季花色素精制品溶解在25ml 的95%乙醇中,则浓度为0.0260g /mL 。用移液枪分别取0mL 、1.0mL 、2.0mL 、3.0mL 、4.0mL 、5.0mL 、6.0mL 溶液,并用95%乙醇定容到10mL 容量瓶中,分别测其在530mn 处的吸光值,标准曲线如图2所示

图2月季花色素标准曲线

图2可见,标准曲线方程为Y =19.782x +0.4411,相关系数R 2为0.9982,这说明月季花色素浓度为0

16mg /mL 范围内,吸光度与月季花色素浓度间呈现良好的线性关系。

75第2期

信璨,等:双水相萃取法分离纯化月季花色素

3.2聚乙二醇(PEG )的选择选择25%分子量分别为400、

600、1000和2000的PEG 、18%Na 2SO 4和1mL 月季花色素粗提液组成双水相体系,在30?下,用磁力搅拌器搅拌至两相充分混匀,2000r /min 离心5min ,对其上、下相溶液进行分析,不

同分子量PEG 下月季花色素的分配系数和萃取率如图3所示

图3PEG 平均分子量对双水相体系的影响

由图3中可以看出,不同分子量的PEG 和18%Na 2SO 4组成的双水相系统,均具有良好的分相能力,

PEG 的分子量越大,分配系数K 和萃取率Y 反而降低。这是由于随着PEG 分子量降低,系统粘度减小,水溶性增强。PEG 分子量为400时,分配系数K 和萃取率Y 最大,说明月季花色素有很强的亲水性。因此双水相体系选择PEG 400。

3.4温度对双水相萃取月季花色素的影响

选择25%PEG400、18%Na 2SO 4和1mL 月季花色素粗提液组成双水相体系,在不同温度下(30?、

40?、50?、60?),用磁力搅拌器搅拌至两相充分混匀,2000r /min 离心5min ,并对其上、下相溶液进行分析,不同温度下月季花色素的分配系数和萃取率如图4所示

图4温度对双水相体系的影响

由图4中可以看出,30?时月季花色素的萃取率最高,随温度的升高,分配系数K 和萃取率Y 随之降低。

升温后会加快高聚物在水中的溶解,相分离的速度也加快,有利于双水相的形成,但相比R 随着温度的升高反而降低,从而影响分配系数K ,导致月季花色素萃取率Y 逐渐降低。因此萃取温度选择30?。

3.4粗提液的体积对双水相萃取月季花色素的影响

选择25%PEG400、18%Na 2SO 4组成双水相体系,在30?下,加入不同体积粗提液(2mL 、

1mL 、1/2mL 和1/3mL ),用磁力搅拌器搅拌至两相充分混匀,2000r /min 离心5min ,并对其上、下相溶液进行分析,不同粗

提液体积下月季花色素的分配系数和萃取率如图5所示。

由图5中可以看出,随粗提液体积的增加,分配系数K 和萃取率Y 呈现先升高后下降的趋势,粗提液体积为1/2mL 时,月季花色素的萃取率Y 最高。在工业化操作中,粗提液体积虽然影响月季花色素提取率,但从经济上考虑还是加入体积越大越好,粗提液体积为1/2mL 与体积为1mL 比较,萃取率Y 仅相差1.32%,

8

5河北联合大学学报(自然科学版)第34卷

分配系数K 仅相差0.350,因此确定粗提液体积选定为1mL

图5粗提液体积对双水相体系的影响

3.5pH 值对双水相萃取月季花色素的影响

选择25%PEG400、18%Na 2SO 4和1mL 月季花色素粗提液组成双水相体系,在30?下,浓度为1mol /L

的HCL 调pH 值至2.0、3.0、4.0和5.0,用磁力搅拌器搅拌至两相充分混匀,2000r /min 离心5min ,并对其

上、下相溶液进行分析,不同pH 值下月季花色素的分配系数和萃取率如图6所示

图6pH 值对双水相体系的影响

由图6中可以看出,随溶液pH 值的增加,月季花色素的分配系数K 和萃取率Y 呈现先下降后升高的趋势,

pH 值为2时月季花色素萃取率最高。4结论

采用实验方法确定了萃取分离月季花色素的双水相体系组成为25%PEG 400与18%Na 2SO 4;双水相体

系中粗提液体积、

pH 值和温度等因素对双水相体系的相比、分配系数及萃取率均有一定影响,最佳萃取条件为:温度30?;粗提液体积1mL ;pH 为2.0。在此条件下,月季花色素的萃取率可达到98.45%。因此采用PEG /Na 2SO 4双水相体系萃取分离月季花色素是可行的。该法具有萃取率高、分相快、温度低、易于操作等优

点,

是色素类化合物萃取分离的一种有效方法。参考文献:

[1]张沛,薛莹,青琳森等.月季花的化学成分研究[

J ].中草药,2010,10(10):1616-1618.[2]赵永光,常丽新,刘红梅等.月季花色素提取工艺研究[J ].食品科学,

2008,29(12):342-345.[3]杨琼,张来新,徐改娥等.月季花色素的提取及稳定性研究[

J ].化工时刊,2009,5(5):5-9.[4]茹宗玲,李安林,张换平.月季花黄色素清除超养自由基和羟基自由基作用研究[J ]

.化学研究与应用,2009,9(9):1331-1333.[5]石慧,陈媛梅.PEG /(NH4)2SO 4双水相体系在加杨叶总黄酮萃取分离中的应用[

J ].现代生物医学进展,2008,8(5):854-857.[6]董树国,赖红伟,陆钊.双水相萃取在黄酮类化合物分离分析中的应用[J ].广州化工,

2009,37(7):43-44.[7]朱茂电.双水相萃取技术进展及其应用概况[J ].江苏化工,2007,6(12):5-8.

[8]李春和,贾少英,王晓闻.月季花提取物对DPPH 自由基的清除活性[J ]

.农产品加工,2010,9(9):30-32.95第2期信璨,等:双水相萃取法分离纯化月季花色素

[9]茹宗玲,李安林,张换平.超声波提取月季花红色素的工艺研究[J].食品研究与开发,2007,(8):56-58.

[10]赵爱丽,陈晓青,蒋新宇.应用双水相萃取法分离黄芩苷的研究[J].中成药,2008,30(4):498-501.

[11]卢俊彩,崔岩岩,陈火林等.丙酮-硫酸铵双水相体系分离纯化红花红色素[J].化学研究与应用,2007,6(6):679-682.Partition and Purification ofPigment from Rose by Aqueous Two-phase extraction

XIN Can,CHANG Li-xin,JIA Chang-hong

(School of Chemical Engineering,Hebei United University,Tangshan Hebei063009,China)

Key words:Aqueous two-phase system;Pigment of Rose;Partition and purification

Abstract:Partition and purification of Rose pigment by PEG400/Na

2SO

4

aqueous two-phase system was investiga-

ted in this paper.Determined aqueous two phase system was consisted with25%PEG400and18%Na

2SO

4

.Influ-

ence of temperature,volume of pigment crude extract,pH on extraction efficiency of pigment was investigated through experiments.The results showed that the main factor iMPact the extraction efficiency of pigment was the vol-ume of pigment crude extract.The second and third factors were pH in solution and temperature.The optimum ex-traction conditions include the followings:pH being2.0,leaching solution volume1mL and temperature30?.In this condition,the extraction rate of pigment reached to96.86%.Aqueous two-phase is an effective method to sepa-

檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵rate and purify the pigment of plants.

(上接第8页)

参考文献:

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[2]刘建明,蒋胜.高炉喷吹混合煤实验[J].钢铁钒钛,1998,19(3):34-38.

[3]张文强,郑学顺.唐钢新3号高炉喷煤将焦生产实践[J].炼铁,2009,28(2):26-28.

[4]周瑜生,项仲庸.合理喷煤比的技术分析[J].钢铁,2010,45(2):1-8.

[5]陈文敏,刘淑云.煤质及化验知识问答[M].北京:化学工业出版社,2008.

[6]王竹民,刘然,吕庆等.煤岩组分对高炉喷吹煤粉燃烧率的影响[J].钢铁研究学报,2010,22(5):23-26.

[7]张建良,黄冬华,张曦东等.新型高炉喷煤模拟燃烧实验装置设计[J].北京科技大学学报,2009,31(5):633-637.

Optimum Selection of PCI at Hanbao Steel

LIANG Kun-feng1,LV Qing1,LIU Ran1,LI Jian-chao2,DU Lin-sen2,WANG Zhu-min2

(1.College of Metallurgy and Energy,Hebei Key Laboratory for Advanced Metallurgy Technology,

Hebei United University,Tangshan Hebei063009,China;

2.Handan Iron and Steel Co.;Ltd.;Hebei Iron&Steel Group;Handan Hebei056000,China)

Key words:Hanbao Steel;blast furnace;mixed jetting;combustibility of pulverized coal

Abstract:Based on the coal injection state of Hanbao blast furnace,the physical and chemical analyses of anthra-citecoal and bituminite,such as industry analysis,explosiveness,flare point,ash fusion point and mix coal burning rate,were investigated systemically.The results showed that Meijiaokushenhua coal was the best kind of bituminite to be used in Hanbao blast furnaces,Meijiaokufugu and Jimin bituminite are the second choices.The optimal anthra-cite coal was Gaoping(Meijiaokugaoping and Rendagaoping anthracite)anthracite.The mixture of Shenhua coal and Meijiaokugaoping coal was the better mixed coal to be used in Hanbao blast furnace.

06河北联合大学学报(自然科学版)第34卷

双水相萃取法

双水相萃取法的应用及研究进展 摘要:双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视,它与传统的萃取及其它分离技 术相比具有操作条件温和、处理、量大、易于连续操作等优点,从而使其能广泛应用于生物分离工程中。本文介绍了双水相的形成、双水相萃取技术的基本原理以及影响物质分配系数的因素。同时对双水相萃取技术的研究进展及其应用进行了综述。 关键词:双水相萃取分离纯化进展 一:方法 随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新技术研究工作的广泛开展,各种高附加值的生化新产品不断涌现,对生化分离技术也提出了越来越高的要求。包括精馏、吸收、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术有三大特点:分离过程伴随有相的变化;筛分过程不能实现分子级别的分离;精制过程成本极高,这些特征对于节约能源、生物分离、环境 保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术发展不相适应。围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流,即新型分离技术产生的背景。双水相萃取技术始于20世纪60年代,从1956年瑞典伦德大学Albertsson发现双水相体系[2]到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离,虽然只有20多年的历史,但由于其条件温和,容易放大,可连续操作,目前,已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化,双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中。 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时,由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性,使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时,就会分成不相溶的两相,因使用的溶剂是水,因此称为双水相原则上,无论是天然的还是合成的亲水聚合物,绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时都可分成两相,构成双水相体系。 双水相萃取与水一有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。对于某一 物质,只要选择合适的双水相体系,控制一定的条件,就可以得到合适的分配系数,从而达到分离纯化之目的。 二:讨论 双水相萃取是一项可以利用不复杂的设备,并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分的新型分离技术。因此,广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域。然而有关双水相分配的基础研究还不够,工业化的一些关键问题还没有解决。为此,有必要加强这方面的基础研究,解决大规模萃取生物活性物质的工艺条件和设备方面的问题,促进双水相萃取技术的不断发展。 影响双水相萃取的因素比较复杂,主要包括静电作用、疏水作用和界面张力等。通过对各个因素的调节,可以极大地提高蛋白质的选择性,达到向一相富集的目的。A 1}'帅的组分性质千差万别,从晶体到无定形聚合物、从非极性到极性、从电解质到非电解质、从无扫L 小分子到有扫L高分子甚至生物大分子,这些都不可避免地造成理论计算的复杂性,以至 于现在还没有一套比较完善的理论来衡量各个影响因素之问的关系和解释生物大分子在体 系中的分配扫L理.有关A丁PS分配模型的研究中,较为成功的有的渗透维里模型,以及晶格模型。前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度;后者在粒子的能

双水相体系萃取(精)

双水相萃取技术 早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液,随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉,这种现象被称为聚合物的不相溶性(incompatibility,从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system,ATPS。 传统的双水相体系是指双高聚物双水相体系,其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用,相互无法渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异,混合时就可发生相分离,且憎水程度相差越大,相分离的倾向也就越大。可形成双水相体系的聚合物有很多,典型的聚合物双水相体系有聚乙二醇(polyethylene glycol,略作PEG/葡聚糖(dextran,聚丙二醇(polypropylene glycol/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose/葡聚糖等。另一类双水相体系是由聚合物/盐构成的。此类双水相体系一般采用聚乙二醇(polyethylene glycol作为其中一相成相物质,而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。 萃取原理 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示: K= C上/ C下 其中K为分配系数,C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。 分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律,即,“在一定温度一定压强下,如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里,达到平衡后,该物质在两相中浓度比等于常数”,分离效果由分配系数来表征。

第二章----提取分离和结构鉴定

第二章 提取---是指根据天然产物中各种化学成分的溶解性能,选择对有效成分溶解度大而对其他成分 溶解度小的溶剂,用适当的方法将所需要的化学成分尽可能完全地从药材组织中溶解提出的过程。溶剂提取法:利用天然产物化学成分在特定溶剂中溶解的性质,将其从原材中提取出来。多数情况下采用溶剂法。 溶剂提取法的原理:溶剂在渗透、扩散作用下,溶剂渗入药材组织细胞的细胞膜进入细胞内部,溶解可溶性的溶质,形成细胞内外溶质的浓度差,从而带动溶质做不断往返的运动,将溶质渗出细胞膜,直到细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达到平衡,达到提取所需化学成分的目的。溶剂选择的依据-----“相似者相溶”原则 常用溶剂按照极性大小分为三类:水溶性(糖类、氨基酸、蛋白质、盐类)、亲水性(苷类如:黄酮、三萜、甾体与糖的结合体)、亲脂性(未成盐的生物碱,未成苷的黄酮、蒽醌、萜类、甾体)。优缺点,能溶生么物质。 水:极性最强:优点:安全,经济易得缺点:水提取液(尤其是含糖及蛋白质者)易霉变,难以保存,且不易浓缩和滤过。 亲水性有机溶剂:指甲醇、乙醇、丙酮等极性较大且能与水相互混溶的有机溶剂。(故不能萃取)优点:提取范围较广,效率较高,提取液易于保存,滤过和回收。缺点:易燃,价格较贵,有些溶剂毒性较大。 亲脂性有机溶剂:与水不相混溶,具较强选择性,如石油醚、苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯等。优点:提取液易浓缩回收缺点:穿透力较强,需长时间反复提取,毒性大,易燃,价格较贵,设备要求高。 影响提取效果的因素 :溶剂提取的效果主要取决于选择合适的溶剂和提取方法。此外,原料的粉碎程度,提取温度, 浓度差,提取时间,操作压力,原料与溶剂的相对运动等因素也不同程度地影响提取效果。 原料的粉碎程度:原料经粉碎后粒度变小,浸出速度加快,但粉碎度过高,并不利于浸出,一般而言粒度以20-60目为适。浸出温度:扩散速度加快有利于浸提,并且温度适当升高,可 使原料中的蛋白质凝固、酶破坏而增加浸提液的稳定性,但温度过高,会破坏不赖热的成分,并且导致浸提液的品质劣变。一般浸出温度控制在60-100℃。浓度差:浓度差越大,扩散推动力越大,越有利于提高浸出效率。浸提时间:原料中的成分随提取时间延长,提取的得率增加,一般而言,热提1~3h,乙醇加热回流提取1~2h。

双水相萃取分离

双水相萃取技术应用 摘要:双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到重视,它与传统的萃取方法相比有独特的优点。本文总结了双水相萃取形成的原理,萃取过程的基本理论、萃取体系的特点,综述了双水相萃取技术在生化工业、分析检测、稀有金属分离等方面的应用,介绍了该技术的最新进展,指出了该技术工业化存在的问题,并对今后的发展作了展望。 关键词:双水相萃取分离应用 引言 双水相萃取技术(Aqueous two—phase extraction,简称ATPE)与传统的萃取分离技术不同,有其独特的优点,是一种新型的分离技术。双水相萃取在诸多方面有着广泛的应用,具有良好的应用前景。 1、双水相萃取技术的基本原理 1.1双水相体系的形成 当一定浓度的某种有机物水溶液与其它有机物水溶液,或者有机物水溶液与无机盐水溶液以一定体积比混合时,能够自然分相并形成互不相溶的双水相或者多水相体系,这就是双水相体系。 从溶液理论来说,当2种有机物或者有机物与无机盐混合时,是分相还是混合成一相,取决于混合时的熵变和分子间的相互作用力。由于双水相体系本身的复杂性,体系的熵很难准确计算,分子间的相互作用力也不清楚,所以双水相的形成机理很复杂。对于高聚物/高聚物双水相体系,用传统的理论来解释,是由于界面张力等因素形成两相之间的不对称,使得在空间上产生阻隔效应,使两相之间无法相互渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,一般这种分离倾向的大小和形成双水相的2种物质的疏水性成线性关系。对于有无机盐存在的双水相体系,以及新开发的表面活性剂双水相体系,这种解释就无能为力了。 表1是各种双水相体系的成相原理。由表1可知,不同的成相原理可以解释不同组成的双水相体系.但各种原理并不能普遍适用。而且各种原理问的相互关

双水相萃取实验

一、双水相系统的相图绘制 1.实验目的 了解制作双水相系统的相图的方法,加深对相图的认识。 2.实验原理 相图是研究两水相萃取的基础,双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图,两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相,上相组成用T点表示,下相组成用B点表示,由图1可知上下相所含高聚物有所偏重,上相主要含B,下相主要含A。曲线TCB称为结线,直线TMB称为系线。结线上方是两相区,下方为单相区,若配比取在曲线上,则混合后,溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点,分为两相后,其上下相组成分别为T和B,T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小,故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。 图1 A-B-水双水相体系相图 O aqueous two-phase system Figure 1 The phase diagram of the A-B-H 2 3.实验器材和试剂 (1)器材:电子台秤,漩涡混合器,大试管,滴定管,密度计,温度计。(2)试剂:聚乙二醇,硫酸铵,硫酸镁。 4.操作方法 (1)溶液的配制 配制40%的盐(硫酸铵或硫酸镁)溶液 配制40%的聚乙二醇溶液,液体聚乙二醇可用纯溶液。 (2)相图的制作

精确称取一定质量(0.7000g 左右)PEG 溶液于大试管中,按表1所列第1列数据,加入0.5mL 去离子水,用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液,并不断在漩涡混合器上混合,观察溶液的澄清程度,直至试管内液体出现浑浊为止。记录盐溶液的加量(g)。然后,按表格所列第2列数据加入水,溶液澄清,继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀,直至再次达到浑浊,如此反复操作。计算每次达到浑浊时,PEG 和盐在系统总量中的质量分数,将实验数据填入表中,以PEG 的质量分数为纵坐标,某种盐的质量分数为横坐标作图,即得到一条双节线的相图。 表1相图制作表 编 号 水 /g (NH 4)2SO 4溶液加量/g 纯(NH 4)2SO 4累计量/g 溶液累计总量/g (NH 4)2SO 4质量分 数/% PEG 质量分数/% 1 0.5 3.1315 0.895 4.3786 20.4 4.79 2 0.3 2.1792 1.5186 5.9511 21.85 3.02 3 0.3 2.0456 2.1 9.2867 22.65 2.26 4 0.3 3.1372 3.0 12.6738 23.68 1.65 5 0.5 6.0769 4.7 19.3276 24.52 1.08 6 0.5 6.1909 6.5 26.0138 25.02 0.8 7 0.5 6.8585 8.5 33.4596 25.32 0.62 根据以上数据以(NH 4)2SO 4质量分数为横坐标,以PEG 质量分数为纵坐标即可做出相图。 二、双水相系统比例的选择 根据相图,选择五个成相比例。 三、蛋白酶酶活标准曲线的绘制—— Folin 酚法或紫外分光光度法 PEG4000与MgSO4双水相图 y = 0.0995x 2 - 5.3887x + 73.334 2012345 6 20 21 22 2324 25 26 MgSO4% P E G 4000%

生物分离工程第四章综合测试

第四章萃取 一、名词解释 萃取:是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。 反萃取:通过调节水相条件,将目标产物从有机相转入水相的萃取操作成为反萃取。 分配系数:在恒温恒压条件下,溶质在互不相容的两相中达到分配平衡时,其在两相中的浓度之比为一常数,该常数称为分配系数。即K=溶质在萃取相中的浓度/溶质在萃余相中的浓度=C2/C1。 分离因子:萃取剂对溶质A和B的选择或分离能力可以用分离因子表示。即α=(C2A/CIA)/(C2B/C1B)=KA/KB (C:浓度;下标1,2分别表示萃余相和萃取相;A、B:溶质;α越大,A和B越容易分离,分离效果越好) 超临界流体:物质均具有其固有的临界温度和临界压强,在P-T相图上称为临界点,在临界点以上物质处于即非液体也非气体的超临界状态,这时的物质称为超临界流体。 化学萃取:化学萃取是指利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合因子实现水溶性溶质向有机相的分配,主要用于一些氨基酸和极性较大的抗生素的萃取。 双水相体系:某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相,并且在两相水分均占有很大比例,即形成双水相系统。 萃取因子:即萃取平衡后萃取相和萃余相中质量之比。用E表示。 盐效应:由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同,故分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异,这称为盐效应。 二、选择 1.萃取利用的是物质在两相之间的___B___不同来实现分离或纯化。 A.溶解度比 B.分配系数 C.分离系数 D.稳定常数 2.下列搭配中不适合双水相萃取的是____C__。 A.聚乙二醇/磷酸盐 B.葡聚糖/甲基纤维素 C.聚乙二醇/丙三醇 D. 聚乙二醇/葡聚糖 3.荷电溶质分配系数的对数与溶质的净电荷数成___A___关系,称为______。 A.正比/盐效应 B.指数/塞曼效应 C.非线性/道南效应 D.反比/法拉第效应 4.对于超临界流体萃取,溶解萃取物时通常__C____;分离萃取物时通常______。 A.降压降温/加压加温 B.降压加温/加压降温 C.加压降温/降压加温 D.加压降温/降压加温 5. 对于液液萃取时的两相,下列名词中搭配正确的是_A B D_____。 A.上相/下相 B.萃取相/萃余相 C.萃取相/料液相 D.溶剂相/物料相 6. 下列说明中正确的是__BC__。

萃取分离法习题

萃取分离法习题 1、目前常用的萃取方法有哪几种?各有何特点? 2、衡量萃取完全的指标是什么?其影响因素有哪些? 3、衡量萃取速度的指标是什么?其影响因素有哪些? 4、衡量萃取分离效率的指标是什么?它在评价一个萃取分离方法中的作用是什么? 5、试述萃取剂的选择原则。 6、试述萃取溶剂的选择原则。 7、说明分配系数、分配比和分离因数三者的物理意义 8、在形成螯合物的萃取体系中PH1/2表示了什么?它的大小由什么因素决定的?对于PH1/2相差较大的离子,应如何使它们分离?对于PH1/2相差较小的离子又如何使它们分离?分别举例加以说明。 9、什么是盐析剂?为什么盐析剂作用可以提高萃取效率? 10、当HgI2溶液中有I-存在时,形成HgI3-和HgI42-。试推导用有机溶剂萃取HgI2时,HgI2的分配比与[I-]间的关系。 11、A和B化合物的分配比分别为9和2,通过多次萃取可以将它们分开吗?为什么? 12、试计算:当所用提取溶剂与被萃液的相比(R)分别为0.5,1,2时的萃取率E(假设萃取体系的分配比D为1)。由上述计算,可说明什么问题。 13、当三氟乙酰丙酮分配在CHCl3和水中时得到如下的结果:当溶液的PH值为1.16时,分配比为2.00;当PH值为6.39时,分配比为1.40。求它在氯仿和水中的分配系数K D 和离解常数K i。 14、用8-羟基喹啉为萃取剂,用氯仿为溶剂,萃取分离Fe3+,Co2+,Mn2+时,已知它们萃取曲线的PH1/2值分别为1.5、5.2、6.7。问这三种离子是否可用这样的溶剂萃取法进行分离?如果可以,萃取分离时溶液的PH值应控制在什么范围内?(分离完全时β≧104)。 15、若一次萃取的E1=50%,欲达到En=99%,需连续萃取几次?欲达到En=99.9%,又必须连续萃取几次? 16、什么是反胶束萃取?反胶团萃取的特点有哪些?它在蛋白质分离中有何应用? 17、什么是双水相萃取?双水相构成体系有哪些?它在生物分离中有何应用? 18、影响反胶束萃取和双水相萃取的因素有哪些? 19、(1)简述超临界流体萃取的原理和应用,在超临界流体萃取中应注意哪些操作条件? (2)简述超声辅助萃取、微波协助萃取以及固相萃取和固相微萃取技术的原理、特点、操作条件和应用。 20、设计方案,用超临界流体萃取法分离提取银杏内酯的分析方案。 21、设计方案,用超声法或微波协助萃取法分离提取山楂总黄酮的分析方案。 22、设计方案(包括方法、试剂、主要工艺流程等),用固相萃取或固相微萃取技术分离提取牛蒡苷元的分析方案。

双水相萃取技术在分离_纯化中的应用(精)

第39卷第8期化工技术与开发 V ol.39 No.8 2010年8月 Technology & Development of Chemical Industry Aug.2010 综述与进展 双水相萃取技术在分离、纯化中的应用 谭志坚,李芬芳,邢健敏 (中南大学化学化工学院,湖南长沙 410083 摘要:双水相技术是一种新型的液-液萃取技术,由于其条件温和、易操作等特点,目前已广泛应用于物质的分离、纯化。本文综述了双水相形成原理、工艺流程和特点、体系类别、影响双水相分配的因素及其在分离纯化中的应用,并针对其未来发展趋势进行了展望。 关键词:双水相萃取;分离纯化;应用 中图分类号:TQ 028.32 文献标识码:A 文章编号:1671-9905(201008-0029-07 基金项目:国家自然科学基金(项目编号:20956001 通讯联系人:李芬芳(1964,女,湖南邵阳人,教授,博士生导师,研究方向:植物活性成分提取及分离纯代,E-mail:lff lgg@https://www.wendangku.net/doc/bc3684349.html, 收稿日期:2010-03-30 与传统的分离技术相比,双水相技术作为一种新型的分离技术,因其体积小,处理能力强,成相时间短,适合大规模化操作等特点[1],已经越来越受到人们的重视。 Beijeronck 在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合,发现了双水相现象。双水相萃取(Aqueous two-phase extraction, ATPE技术真正应用是在20

世纪60年代,1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson 将双水相体系成功用于分离叶绿素,这解决了蛋白质变性和沉淀的问题[2]。1979年德国Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离,为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础[3]。迄今为止,被成功应用于生物医药工程,天然产物分离纯化,金属离子分离等方面[4~6]。因其广泛的应用性,已经发展成为一种相对成熟的技术,但仍有很大潜在的价值等待我们去开发。 1 双水相的形成 1.1 双水相的形成机理 将2种不同的水溶性聚合物水溶液(或聚合物与一定浓度的盐溶液混合时,当聚合物浓度(或盐的浓度达到一定值,体系会自然分成互不相溶的两相,这就是双水相体系。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性,一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异混合时就可发生相分离,且憎水程度相差越大,相分离倾向也就越大。 1.2 双水相体系的特点 双水相萃取与传统的水-有机溶剂萃取时一样的,都是利用物质在两相间的分配系数不同来实现分离的。但是与传统萃取相比,双水相有其独特之处[7 ~9] :(1两相的溶剂都是水,上相和下相的含水 量高达70 %~90 %(w/w,不存在有机溶剂残留问题。条件很温和,常温常压操作,不会引起生物活性物质失活或变性;(2两相界面张力小,仅为10-6~10-4N/m (普通体系为10-3~10-2 N/m ,双水相的两相差别(如密度、折射率相差很小,萃取时两相能够高度分散,传质速度快,但也引起乳化现象;(3溶剂对目标组分选择性强,大量杂质能 与所有固体物质一同除去,使分离过程简化,易于工业放大和连续操作;(4分相时间短,常温常压下自然分相时间一般为5~10 min ;(5目标产物的分配系数一般大于3,大部

分离技术-习题.doc

组分的富集?为什么? 分离技术思考题与习题第一章绪论 1?分离技术在定量分析中有什么重要性? 2?定量分离分析对常量和微量组分的回收率要求分别是什么? 3?选择分离方法的依据主要是什么? 第二章沉淀与共沉淀分离法 1.设计下列各组离子的系统分离方案 (1).Ag\ K+、Fe3+、Cr3+、Hg2+ (2). Hg22\ Cu2+、Al"、Ba2+ 2.氢氧化物沉淀分离中,常用控制溶液pH的试剂有哪些?举例说明。 3.用氢氧化物沉淀分离时,常有共沉淀现象,有什么方法可以减少沉淀对其他 组分的吸附? 4?写出下列有机试剂的分子式或结构式: 毗危六次甲基四胺,尿素;丁二酮肪,8?羟基哇咻, 铜试剂(DDTC),铜铁试剂。 5.某试样含Fe, Al, Ca, Mg, Ti元素,经碱熔融后,用水浸取,盐酸酸化, 加氨水中和至出现红棕色沉淀(pH约为3左右),再加六亚甲基四胺加热过滤, 分出沉淀和滤液。试问:为什么溶液中刚出现红棕色沉淀时,表示pH为3左右? 过滤后得到的沉淀是什么?滤液又是什么?试样中若含Zn2+和Mn2+,它们是 在沉淀中还是在滤液中? 6.査阅资料,在药物分析中,沉淀分离法有哪些类型?各有何特点? (以后小组讨论) 7.什么是共沉淀现象?沉淀分离法和共沉淀分离法的区别是什么? 8.什么是均匀分配?什么是非均匀分配?均匀分配和非均匀分配谁更有利于微 9.分析影响吸附共沉淀分离的主要因素。

[HP 為 =3.16 X 10-5 8. 第3章《萃取分离法》习题 1.饮用水中有少量CHC13,取水样lOOmL,用10mL 戊醇萃取,有91.9%的 CHCb 被萃取。计算取10mL 水样用lOmL 戊醇萃取时,氯仿被萃取的百分 率。 2.当三氯乙酰丙酮分配在CHCh 和水中时,得到如下结果:当溶液的pH=1.16 时,分配比为2.00,当pH=6?39时,分配比为1.40o 求它在氯仿和水中的分 配系数K D 和离解常数K HAO 3?毗庭(Py )时一种弱碱,在水中有下列平衡: 毗睫在水和氯仿之间的分配系数为K D =2.74 xlO 4,求在pH=4时,毗腱在水和 CHCb 之间的分配比是多大?(设毗腱Py 在CHCb 中没有聚合反应)。 4.在pH=6时,用双硫腺氯仿溶液萃取A,其萃取率为95%。同样条件下,B 仅 被萃取5%,求这两种金属离子的分离系数是多少? 5.有一金属离子鳌合物于pH3从水相萃入甲基异丁基酮中,其分配比为5.96, 现 取50.0毫升含该金属离子的试液,每次用25.0毫升甲基异丁基酮于pH3 萃取,要求萃取率为99.9%,问一共要萃取多少次? 6.用30毫升10_3mol

双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究(精)

化学与生物工程 2006,Vol.23N o.10 Ch emistry &B ioengin eerin g 7 收稿日期:2006-04-17 作者简介:郑楠(1982-,女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。E -mail:zheng nan1982@https://www.wendangku.net/doc/bc3684349.html, 。 双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究 郑楠,刘杰 (南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029 摘要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。 关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素 中图分类号:T Q 02818 Q 512+11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(200610-0007-03 液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。

与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5~15min;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。 1 双水相萃取原理 双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。当生物物质进入双水相体系后,由 于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K 等于两相中生物物质的浓度比,由于蛋白质的K 值不相同(大致在011~10之间,因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。 2 双水相萃取中影响蛋白质分配的因素 211 聚合物的分子量 同一类聚合物的疏水性随分子量的增大而增强[1] ,当聚合物的分子量减小时,蛋白质易分配于富含该聚合物的相。如在PEG -Dex tr an 系统中,PEG 的分子量减小或Dextran 的分子量增大都会使分配系数变大,相反PEG 的分子量增大或Dex tran 的分子量减小会使分配系数变小。这是由于PEG 分子量增大时,它的疏水性显著增强,使蛋白质在上相的表面张力增大,从而易于向下相

双水相萃取技术研究论文

双水相萃取技术 姓名:小行星学号: 2015xxxx专业:化工工艺 摘要:双水相萃取是一种新型的萃取分离技术,本文介绍了双水相体系的形成 及特点,重点介绍了双水相萃取技术的应用和双水相萃取的主要设备, 对双水相萃取技术应用前景及展望 关键字:双水相萃取分离技术应用展望 1、引言 溶剂萃取法是分离技术中最重要的方法之一。传统的溶剂萃取分离是依据被分离物质在两个互不相溶液相中的溶解性不同而达到分离目的。一般的萃取体系包括有机相和水相两部分,迄今为止,已有若干种分类方法。随着近年来分离技术在生命科学、天然药物提纯及各类抗生素药物等方面应用的迅速发展,新型的萃取技术应运而生。例如对于生物物质来说,分离的对象复杂,既包括可溶物,如蛋白质和核酸,也包括悬浮的小颗粒,如细胞器和整个细胞;由于生物物质极易变性和失活,传统的有机相和水相的两相萃取不能解决生物物质失活等问题,给分离带来很大的难度,而双水相萃取技术能够很好的解决这一难题。 双水相萃取(Aqueoustwo-phase extraction, ATPE)[1]是两种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液,在一定的浓度下,体系就会自然分成互不相容的两相,被分离物质进入双水相体系后由于表面性质、电荷间作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键)等因素的影响,在两相间的分配系数K不同,导致其在上下相的浓度不同,达到分离目的,这种现象在1896年被 B eijerinck首次发现,随后双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到重视,与传统的萃取及其他分离技术相比具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点,随着生物、医药等行业的蓬勃发展,从而使双水相萃取技术能越来越广泛应用于生物工程、药物分析和金属分离等方面。 2、双水相体系 简而言之,双水相萃取是利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同

萃取分离法

萃取分离法 1,按萃取的目的,粗去方法可大致分为两类,一类称“完全萃取”,他是要将一个样品中的某个物质全部萃取出,这种萃取常称为提取。如用大量的溶解度高的二甲基甲酰胺从橘皮中提取出橙皮苷而使溶解性差的细胞壁物质残留。另一类成为选择性萃取,他是用于比较困难的分离过程。如金属离子混合物的分离;化学标准品如光谱纯试剂的纯化制备。2,溶剂萃取按萃取原理的不同,可分为两类:一类为物理萃取,这些萃取是基于被萃取物在水相和有机相(或反相胶团)中溶解度不同来实现的。另一类为化学萃取。 3,溶剂萃取的有机相涉及两个概念,萃取剂和萃取溶剂。萃取剂是指被萃取物有化学反应,而能是被萃取物被萃入有机相的试剂。而用于稀释萃取剂的有机相溶剂被称为萃取溶剂(准确称为稀释剂)。 4,在分析化学中选择萃取剂的原则是: a)对萃取物有高的分配比,以保证尽可能地萃取出被萃取物; b)萃取剂对被萃取物的选择性要好,即对需分离的共存物具有足够大的分离因子; c)萃取剂对后面的分析测定没有影响,否则需要反萃除去; d)毒性小,容易制备。 5,所谓反萃,是指在溶剂萃取中常不可缺少的一后处理步骤。反萃即是使用在萃取步骤时,被萃取物最不易被萃取的这种条件,将被萃取物萃取回纯的水相,而与萃取剂分离。6,根据所形成的被萃取物质的不同,可把萃取体系分成以下几类:螯合物萃取体系,离子缔合物萃取体系,三元络合物萃取体系,共萃取体系,酸性磷类萃取体系等。 7,反胶团萃取 a)微胶团概述:反胶团萃取也类似于水-有机溶剂的液液萃取,但他是李永乐表面活性 剂在有机相形成的反胶团水池的双电层与蛋白质的静电吸引作用,而将不同极性 (等电点)、不同分子量的蛋白质选择性地萃取到有机相,达到分离的目的。 b)将表面活性剂溶于水中,当其浓度超过临界胶束浓度时表面活性剂就会在水溶液中 聚集在一起形成聚合体,称为胶束。 c)表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性 分子,可分为:阴离子表面活性剂(脂肪醇硫酸酯盐等)、阳离子表面活性剂(十 六烷基三甲基季铵溴化物等)、非离子表面活性剂(烷基酚类聚醚等) d)形成反胶团的条件:加入的表面活性剂在有机相中的浓度达临界胶束浓度值以上。 e)反相微萃取的原理:表面活性剂有表面聚集的倾向,在宏观有机相和水相界面的表 面活性剂层,同临界的蛋白质发生静电作用而变形,从而接着在两相界面形成包含

双水相萃取技术

三、双水相萃取 3.1 双水相萃取的原理及特点 3.1.1 双水相萃取的原理 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。 3.1.2 双水相萃取的特点 双水相体系萃取具有如下特点:(1)含水量高(70%~90%),是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性;(2)分相时间短,自然分相时间一般为5~15min; (3)界面张力小(10-7~10-4mN/m),有助于强化相际间的质量传递;(4)不存在有机溶剂残留问题; (5)大量杂质能与所有固体物质一同除去,使分离过程更经济;(6)易于工程放大和连续操作。由于双水相萃取具有上述优点,因此,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。 3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用 用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。在黄豆匀浆中加入PEG4000,可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%),PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液,用离心萃取器完成双水相体系的两相分离,整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。用PEG/(NH4)2SO4双水相体系,经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%),pH=8,α-淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5倍,蛋白酶在水相中的收率高于60%。通过向萃取相(上相)中加进适当浓度的(NH4)2SO4可达到反萃取。实验结果表明,随着(NH4)2SO4浓度的增加,双水相体系两相间固体物析出量也增加。固体沉淀物既可干燥后生产工业级酶制剂,也可将固体物加水溶解后用有机溶剂沉淀法制造食品级酶制剂. Harris用双水相体系从羊奶中纯化蛋白,研究了牛血清清蛋白(OSA)、牛酪蛋白、β-乳球蛋白在PEG/磷酸盐体系中的分配以及PEG相对分子质量、pH值和盐的加入对3种蛋白分配的影响。实验结果表明。增加NaCl浓度,可提高分配系数,最佳pH为5。对OSA和牛酪蛋白,可得到更高的分配系数。在含有疏水基葡聚糖中,蛋白质和类囊体薄膜泡囊的分配研究表明,苯甲酰基葡聚糖和戊酰基葡聚糖具有疏水性。疏水基影响氨基酸、蛋白质和薄膜泡囊在双水相体系中的分配,在只有磷酸盐缓冲溶液的PEG8000/葡聚糖双水相体系中,大部分β-半乳糖苷酶被分配在上相,但在下相中加入少量的苯甲酰基葡聚糖(取代程度为0.054)或戊酰基葡聚糖(取代程度为0.12)时,β-半乳糖苷酶的分配系数就降低了100倍。在对牛血清清蛋白、溶菌酶、脂肪酶和β-乳球蛋白的分配进行的观察中发现具有相似的现象。类囊体薄膜泡囊的分配受疏水基的影响特别大,薄膜泡囊被分配在含有疏水基的一相中。在含有N,N-二甲基甲酰胺的聚合物双水相中,利用逆流分配可对玉米醇溶蛋白进行分级分离。Miyuki在PEG/K3PO4双水相体系中用两步法对葡糖淀粉酶进行了萃取纯化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG组成双水相作为第二步萃取体系,称作两步法。葡糖淀粉酶的最佳分配条件是PEG4000(第一步)、PEG1500(第二步),pH=7,纯化系数提高了3倍。

双水相萃取

双水相萃取 一实训目的掌握双水相萃取的原理 及方法。 学习双水相萃取相图的制作。 二实训原理 双水相萃取法(aqueous two-phase extraction)是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。高聚物PEG和盐(硫酸铵)形成的互不相溶的两相,倒入牛奶中,蛋白质富集在一相中。 三实训仪器和药品 试管,离心机,天平,离心管,三角瓶,滴定管,聚乙二醇2000 (PEG2000),硫酸铵,牛奶。 四实训步骤 1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定(1) 取10%PEG2000溶液10mL于三角瓶中; (2)用40%硫酸铵溶液装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液出现浑浊,记录硫酸铵消耗的体积。加入1mL水使溶液澄清,继续用硫酸铵滴定至浑 浊,重复7~8次,记录每次硫酸铵消耗的体积,计算每次出现浑浊时体 (3)以硫酸铵的浓度(W/V)为横坐标,PEG浓度(W/V)为纵坐标,绘制出PEG2000-硫酸铵双水相体系相图。 2PEG2000-硫酸铵双水相体系的配制 自行在相图中双水相区选择一个点,根据该点的PEG2000浓度和硫酸铵浓度,分别量取适量的10%PEG2000溶液和硫酸溶液,混合均匀后以2500rpm/min离心5min后分相,得到双水相体系(总量约3mL)。 3利用PEG2000-硫酸铵双水相体系萃取分离牛奶中的蛋白质 取1mL 牛奶装入上述双水相体系中,搅拌均匀,于2500rpm/min 离心5min,静置分层,分别量取上下相的体积。 萃取完成后,如果牛奶中的蛋白质不能被萃取到上相,则证明所选的

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PEG2000 与硫酸铵浓度不对,应重新选择。 五结果与讨论 1如果正确地绘制相图。 2如何根据相图配制双水相体系,并对混合物进行分离。 2

双水相萃取的特点

双水相萃取的特点 双水相萃取是一种可以利用较为简单的设备, 并在温和条件下进行简单操作就可获得较高收率和纯度的新型分离技术。与一些传统的分离方法相比, 双水相萃取技术具有以下独有的特点。 ( 1) 两相间的界面张力小, 一般为10- 7—10- 4mN·m- 1 ( 一般体系10- 3—2×10- 2mN·m- 1 ) ,因此两相易分散, 而且它比一般的有机萃取两相体系界面张力低的多, 这样有利于强化相际间的物质传递。 ( 2) 操作条件温和, 由于双水相的界面张力大大低于有机溶剂与水相之间的界面张力, 整个操作过程可以在常温常压下进行, 对于生物活性物质的提取来说有助于保持生物活性和强化相际传质。 ( 3) 双水相体系中的传质和平衡速度快, 回收率高, 分相时间短, 传质过程和平衡过程速度均很快, 自然分相时间一般为5—15min, 因此相对于某些分离过程来说, 能耗较低, 而且可以实现快速的分离。 ( 4) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉, 与其他常用固液分离方法相比, 双水相分配技术可省去1—2 个分离步骤, 使整个分离过程更经济。 ( 5) 含水量高, 一般为75%—90% , 在接近生理环境的体系中进行萃取, 不会引起生物活性物质失活或变性。 ( 6) 一般不存在有机溶剂的残留问题, 现已证明形成双水相的聚合物( 如PEG) 对人体无害, 可用于食品添加剂、注射剂和制药, 因此

对环境污染小。 ( 7) 聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度, 以及体系的pH 值等因素都对被萃取物质在两相间的分配产生影响, 因此可以采用多种手段来提高选择性和回收率。 ( 8) 易于连续化操作, 设备简单, 并且可直接与后续提纯工序相连接, 无需进行特殊处理。例如可以采用高分配系数和高选择性的多级逆流分配操作。 ( 9) 分配过程因素较多, 可以采取多种手段来提高分配选择性或过程收率。

双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究

化学与生物工程 2006,Vol.23No.10  Chemistry &Bioengineering 7  收稿日期:2006-04-17 作者简介:郑楠(1982-),女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。E 2mail :zhengnan1982@https://www.wendangku.net/doc/bc3684349.html, 。 双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究 郑 楠,刘 杰 (南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029) 摘 要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。 关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素 中图分类号:TQ 02818 Q 512+11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2006)10-0007-03 液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。 与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于 水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5~15min ;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。 1 双水相萃取原理 双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。当生物物质进入双水相体系后,由 于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离 子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K 等于两相中生物物质的浓度比,由于蛋白质的K 值不相同(大致在011~10之间),因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。 2 双水相萃取中影响蛋白质分配的因素 211 聚合物的分子量 同一类聚合物的疏水性随分子量的增大而增强[1],当聚合物的分子量减小时,蛋白质易分配于富含该聚合物的相。如在PEG 2Dext ran 系统中,PEG 的分子量减小或Dextran 的分子量增大都会使分配系数变大,相反PEG 的分子量增大或Dext ran 的分子量减小会使分配系数变小。这是由于PEG 分子量增大时,它的疏水性显著增强,使蛋白质在上相的表面张力增大,从而易于向下相分配。同理,Dext ran 的疏水性随其分子量的增大而增强,使蛋白质在下相的表面张力增大,从而不断向上相分配。212 聚合物的浓度 在双水相系统中,界面张力很低并且随结线长度呈指数规律的增大。当系统组成处于临界点时,系线长度为零,上下相组成相同,蛋白质均匀地分配在两相中,分配系数K =1。当成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增加时,系统远离临界点,系线长度增大,两相性质的差别也增大,同时蛋白质在两相中的界面张力差别增大,使其趋于向一侧分配,即K 值或增大超过1,或减小低于1。

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