猪流行性腹泻病毒CH_ZJ分离株S基因的克隆、原核表达和免疫原性分析
万方数据
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《黑龙江畜牧兽医》科技版２０１０年２月（上）２１
２．１ＰＥＤＶＣＨ／ＺＪ株Ｓ基因Ｐ—ＰＳＩ片段的一步法ＲＴ—ＰＣＲ扩增结果
将一步法ＲＴ—ＰＣＲ产物于１．Ｏ％琼脂糖凝胶电泳中检测，结果显示扩增的Ｐ—ＳＰｌ片段长度与预期的９６６ｂｐ相符（见图１）。
Ｍ．ＤＬ一２０００Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｐ—ｓＰ！片段ＲＴ—ＰＣＲ产物。
图１Ｐ—ＰＳＩ片段ＲＴ—ＰＣＲ产物１．０％琼脂锖凝胶电泳结果ＦｉｇｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｐａｔｔｅｒｎｏｆＲＴ—ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＰ—ＰＳｉｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｎ１．０％ａｇａｒｏｓｅｇｅｔ
２．２重组载体ｐＥＴ２８ａ（＋）一Ｐ—ＳＰｌ的构建结果利用内切酶ＸｈｏＩ、Ｎｃｏ１分别对目的片段Ｐ—ＳＰｌ和表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）进行双酶切，切胶回收，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行连接，转化到大肠杆菌Ｔｏｐｌ０中，小量提取质粒后进行ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ双酶切鉴定（结果见图２），表明成功构建了表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）一Ｐ—ＳＰｌ，将构建好的表达载体转化到表达菌ＥｃｏｌｉＢ１２１一ＤＬ３（Ｒｏｓｅｔｔａ）中。将构建好的的质粒送上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司进行测序，结果表明，Ｐ—ＳＰＩ基因序列与ＰＥＤＶＣＶ７７７毒株Ｓ基因序列同源性为９６％，经过对密码子的分析发现其包含９个稀有Ａｒｇ密码子（ＡＧＧ、ＡＧＡ）和Ｇｌｙ密码子（ＧＧＡ）。
１．１ｋｂＤＮＡＭａｒｋｅｒ；２．ｐＥＴ—Ｐ—ＳＰＩ／ＸｈｏＩ、ＮｅｏＩ双酶切产物。
图２ｐＥＴ—Ｐ—ＳＰＩ的酶切鉴定
Ｆｉｇ２Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＥＴ—Ｐ—ＳＰＩ
２．３Ｐ—ＳＰＩ基冈的表达及表达时间的优化
ＩＰＴＧ诱导表达后，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳检测，结果见图３。在约３６．７ｋｕ处见到表达条带，与预计大小相符。而未加ＩＰＴＧ诱导的菌没有表达条带，说明该蛋白为插入的目的片段所表达。薄层扫描结果表明，表达产物占菌体蛋白的８０％。以不同的诱导时间表达Ｐ—ＳＰｌ基因，并取样经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测，结果见图４。ＩＰＴＧ诱导２．５ｈ后蛋白的表达量不再增加，表明最佳的诱导表达时间为２．５ｈ。
１．低分子质量蛋白质标准；２．阴性对照；３．诱导后的表达产物。
图３Ｐ—ＳＰＩ基因在Ｅ．ｃｏｌｉＤＬ３（Ｒｏｓｅｔｔａ）中的表达
№３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰ—ＳＰＩｇｅｎｅｉｎＥ．ｃｏｉｌＤＬ３（Ｒｏｓｅｔｔａ）
１．低分子质量蛋白质标准；２．阴性对照；３—１２．ＩＰＴＧ诱导０，２５，
０．５，１．０，１．２５，１．５，１．７５，２．０，１．５，３．０ｈ后的表达产物。
图４Ｐ—ＳＰ！基因诱导时间优化
Ｆｉｇ４
ＥｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｅｓｔｉｎｄｕｃｅｔｉｍｅｏｆＰ—ＳＰｌ
窖ｅ耻
２．４表达蛋白的纯化和Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测
ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳检测表达蛋白的纯化结果见图５。结果表明，ｐＨ值为５．５的８ｍｏｌ／Ｌ尿素为最佳。以纯化的蛋白为抗原，以ＰＥＤＶ阳性血清为一抗进行Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测，结果表明，在３５．６ｋｕ处出现ｌ条清晰的反应条带，说明重组蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达并保留了其免疫学活性（见图６）。
３讨论
猪流行性腹泻是危害养猪业的最重要的传染病之一，在世界分布很广，给养猪业带来巨大的经济损失。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达１００％，尤以哺乳仔猪受害最为严重。猪流行性腹泻
病毒ｓ蛋白由猪流行性腹泻病毒ｓ基因编码，是位 万方数据
ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ№２２０１０
１．低分子质量蛋白质标准；２—４，用ｐＨ值为６．３的８ｍｏｌ／Ｌ尿素
洗涤后的结果；５—７．用ｐＨ值为５．５的８ｍｏｌ／Ｉ．尿索洗涤后的
结果；８一１０．用ｐＨ值为４．０的８ｍｏｌ／Ｌ尿素洗脱后的结果。
陶５Ｐ—ＳＰｌ蛋白的纯化
Ｆｉｇ５ＥｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＰ—ＳＰＩｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍ．低分子质量蟹自质标准；１．阴性对照；２．Ｐ—ＳＰｌ蛋白。
图６Ｐ～ＳＰＩ蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测
Ｆｉｇ６Ｗｅｓｔｅｒｎ－－ｂｌｏｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰ?—ＳＰＩ
ｐｒｏｔｅｉｎ
于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，在免疫反应中有识别靶细胞、使病毒和细胞膜融合的作用ＨＪ。因此，ｓ蛋白在猪流行性腹泻病毒基因工程疫苗和诊断技术等方面的研究中是最重要的一个靶蛋白。但目前国内对此研究较少，更深一步地对其功能进行研究是很有必要的。
研究根据ＧｅｎＢａｎｋ提供的ＰＥＤＶＣＶ７７７株Ｓ基因全序列设计引物，从临床分离出ＰＥＤＶＣＩ－Ｉ／ＺＪ株，利用ＲＴ—ＰＣＲ技术，扩增该毒株Ｓ基因前段具有生物学功能的日的片段，克隆到高效原核表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）中，转化于Ｂ１２１（ＤＥ３）感受态细胞中，最后进行诱导表达。ＳＤＳ一?ＰＡＧＥ电泳未检测到目的蛋白，经分析可能的原因是信号肽以及稀有密码子的存在。因此，根据有关人士预测的抗原决定簇所在区域分布，克隆起始端开始于约１０００ｂｐ的片段，同时利用因特网上提供的信号肽分析软件Ｓｉｇｎａｌｐ３．０ｓｅｒｖｅｒ分析ｓ基因信号肽所在位置，设计引物时去除该部分，最后克隆到原核表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）中，转化到能够翻译Ａｒｇ和Ｇｌｙ稀有密码子的Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１一ＤＬ３（Ｒｏｓｅｔｔａ）感受态细胞中。利用ＩＰＴＧ进行诱导表达，经过蛋白可溶性分析试验证明表达的目的蛋白是以包涵体的形式存在的。同时对诱导时间进行优化并进行薄层扫描，结果显示出构建的原核表达重组载体ｐＥＴ２８ａ（＋）一Ｐ—ＳＰｌ能够在较短的时间内获得大量表达，这也为将来获得足量的蛋白提供了基础。
表达的蛋白经过Ｎｉ—ＮＴＡ纯化，发现用ｐＨ值为５．５的８ｍｏｌ／Ｌ尿素即可从Ｎｉ—ＮＴＡ上把目的蛋白剥离出，同时对纯化后的重组蛋白的免疫原性进行了分析，Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测结果湿示，纯化的蛋白与抗ＰＥＤＶ猪阳性血清发生反应，但不与抗ＰＥＤＶ猪阴性血清反应，证明试验获得的Ｐ—ＳＰＩ蛋白具有免疫原性，为进一步研究表位疫苗以及诊断提供了依据。
参考文献：
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［４］ＫＡＮＧＴＪ，ＳＥＯＪＥ，ＫＩＭＤＨ，ｅｔａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌ?ｙ鼍ｊｓｏｆｔｈｅＫｏｒｅａｎｓｔｒａｉｎｏｆｓｐｉｋｅｇｅｎｅｏｆＰｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｌ．ｉｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｔｓｎｅｕｔｒａｌｉ五ｎｇｅｐｉｔｏｐｅｉｎｐｈｎｔｓ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ，２００５。４１（２）：３７８—３８３．
（００９） 万方数据
猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株S基因的克隆、原核表达和免
疫原性分析
作者：刘邓， 冉多良， 袁秀芳， 徐丽华， 牛登元， 张存， 王朝文， 王一成， Liu Deng，RAN Duo-liang， YUAN Xiu-fang， XU Li-hua， NIU Deng-yuan， ZHANG Cun， WANG
Chao-wen， WANG Yi-cheng
作者单位：刘邓,Liu Deng(新疆农业大学,新疆,乌鲁木齐,830052;浙江省农业科学院,畜牧兽医研究所猪病研究室,浙江,杭州,310021)， 冉多良,RAN Duo-liang(新疆农业大学,新疆,乌鲁木齐
,830052)， 袁秀芳,徐丽华,牛登元,张存,王一成,YUAN Xiu-fang,XU Li-hua,NIU Deng-
yuan,ZHANG Cun,WANG Yi-cheng(浙江省农业科学院,畜牧兽医研究所猪病研究室,浙江,杭州
,310021)， 王朝文,WANG Chao-wen(甘肃农业大学,甘肃,兰州,730070)
刊名：
黑龙江畜牧兽医（科技版）
英文刊名：HEILONGJIANG ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY MEDICINE
年，卷(期)：2010(2)
参考文献(4条)
1.KANG T J;SEO J E;KIM D H Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of Porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants[外文期刊]
2005(02)
2.KANG T J;KIM Y S;JANG Y S Expression of the synthetic neutralizing epitope gene of Porcine epidemic diarrhea virus in tobacco plants without nicotine[外文期刊] 2005(17/18)
3.KANG T J;SEO J E;KIM D H Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of Porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants[外文期刊]
2005(02)
4.PENSAERT M B;DeBOUCK P A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine 1978(03)本文链接：https://www.wendangku.net/doc/bc3788397.html,/Periodical_hljxmsy201002008.aspx