实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定

实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定

【目的】

验证蛋白质的两性电离与等电点性质。 【原理】

蛋白质由氨基酸组成。蛋白质分子除两端游离的氨基和羧基可解离外，其侧链上的某些酸性基团或碱性基团，在一定的溶液pH 条件下，都可解离成带负电荷或带正电荷的基团。因此，蛋白质具有两性解离性质。当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势相等，既净电荷为零，成为兼性离子，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点（isoelectric point,pI ）。蛋白质在等电点状态时溶解度最低，容易沉淀析出。蛋白质在大于其等电点的pH 值溶液中带负电荷；在小于其等电点的pH 值溶液中则带正电荷。蛋白质在等点电以外的pH 值溶液中，因分子带有同种电荷而相互排斥，不易沉淀。本实验通过观察酪蛋白在不同pH 溶液中的溶解度来测定其等电点。

＞pI （pH ）pI （pH ）

=pI ＜（pH ）

Pr

NH 3+COO -Pr

NH 3+COOH

Pr

NH 2

COO -

蛋白质解离成阳离子 蛋白质成兼性离子 蛋白质解离成阴离子

【操作】

1. 蛋白质的两性电离

取试管1支，按以下步骤加入各种试剂，观察现象变化并记录。

2. 酪蛋白等电点的测定

取试管5支，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂并混匀。静置室温20分钟后观察各管沉淀出现情况，并以－，＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋符号记录沉淀的多少。

【思考题】

1．为什么说蛋白质是两性电离电解质，何谓蛋白质的等电点？

2. 在等电点状态下，为什么蛋白质容易发生沉淀？

3. 本实验中酪蛋白处于等电点时则从溶液中沉淀析出，由此得出蛋白质在等电点时必然沉淀，此结论对吗，为什么？

2

食品中蛋白质的测定实验报告

1.目的 掌握凯氏定氮法测蛋白质的原理、操作、条件、注意事项。 2.原理 蛋白质是含氮有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后在以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数，即为蛋白质含量。 3.试剂 3.1浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾，所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制 3.2混合指示液 1份（1g/L）甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚氯乙醇溶液临用时混合。 也可用2份甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.3氢氧化钠溶液（400g/L） 3.4标准滴定溶液 硫酸标准溶液［c（1/2H2SO4）=0.0500mol/L］或盐酸标准溶液［c（HCl） 0.0500mol/L］ 3.5硼酸溶液（20g/L） 4.仪器 定氮蒸馏装置 5.样品 全蛋（2.47g） 6.操作 6.1样品处理 准确称取2—5g半固体样品，小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜放于加有石棉网的电炉上，小火加热，待内容物全部炭化后，泡沫完全消失后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色呈请透明后，再继续加热0.5h，取下放冷，慢慢加入20mL水。 放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。 6.2连接装置 装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及少量硫酸，以保持水呈酸性，加入数滴玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，

蛋白质等电点测定

离表面越远，过剩的反离子越少， 直至在溶液内部反离子 蛋白质等电点测定 及性质实验 、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。 、原理: 固体颗粒在液体中为什么能够带电? 当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本 身发生电离作用而使离子进入溶液， 以致使固液两相分别带有不同符号的电荷， 由于电中性 的要求，带电表面附近的液体中必有与固体 表面电荷 数量相等但符号相反的多余的反离子。 在界面上 带电表面和反离子 形成了双电层的结构。 在两种不同物质的 界面上，正负电荷分 别排列成的面层。 对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于 1879年 Helmholz 提出平板型模型；1910年Gouy 和1913年Chap man 修正了平板型模型， 提出了扩 散双电层模型；后来 Stern 又提出了 Stern 模型。 根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范 德华力）而和表面紧密结合，构成 吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地 分布在溶液中，构成双电层的 扩散层（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在 扩散层 中反离子的浓度远大于同号离子。 紧密层（Stern 层〉 +++++^+++ 9 反号离子溶剂分子 扩散层

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧 密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。 滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的 电势差称为Z电势。 固体颗粒带电量的大小及测量方式？ Z电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。Z电势的大小由Zeta电位表示， 其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。 对于蛋白质分子来说： 蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1?100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多 亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而 形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间 不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利 用蛋白质的胶凝作用。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液 在碱性溶液中羧基形成-C00-而带负电 中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正 电， COO-COO J p\+ 0H- NH2 兼性痒孑 pH>pI pK = pl pl 电殛申：拓向配覆不暮动 蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为：在某一 pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。 等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。 蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。

蛋白质的等电点测定

蛋白质的等电点测定 一、蛋白质等电点的测定 1．目的 （1）了解蛋白质的两性解离性质。 （2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2．原理 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 3．器材 （1）水浴锅（2）温度计 （3）200mL锥形瓶4）100mL容量瓶 （5）吸管（6）试管 （7）试管架（8）乳钵 4．试剂 （1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200mL 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40—50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL1mol／L 醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50 C水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。

将锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 （2）1.00mol／L醋酸溶液100mL （3）0.10mol／L醋酸溶液100mL （4）0.01 mol／L醋酸溶液 50mL 5．操作 取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 （2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀——管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最 混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。

蛋白质测定实验报告

蛋白质测定实验报告标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

蛋白质测定方法——化学报告

蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述： 1 材料与方法 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,

实验三 蛋白质的两性反应和等电点的测定

实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定 一、目的和要求 1.了解蛋白质的两性解离性质。 2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。 二、原理 蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。 在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。 三、试剂和器材 1.试剂 0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；0.04%溴甲酚绿指示剂；0.02N盐酸； 0.1N醋酸溶液；0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；0.02N氢氧化钠溶液 2.器材 试管及试管架；滴管；吸量管（1、5ml） 四、操作方法 1.蛋白质的两性反应

（1）取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。观察溶液呈观的颜色，并说明原因。 （2）用细滴管缓慢加入0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH接近与酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。（3）继续滴入0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。（4）再滴入0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。 继续滴入0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何 变化？说明了什么问题？ 2.酪蛋白等电点的测定 （1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。 加入每种试剂后应混合均匀。 （2）静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以—，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少。根据观察结果，指出哪一个PH是酪蛋白的 等电点？

蛋白质测定实验报告

蛋白质测定方法——化学报告

蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：

1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1～1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量

蛋白质等电点测定

蛋白质等电点测定及性质实验 一、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。 二、原理： 固体颗粒在液体中为什么能够带电 当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。 对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。 根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。 滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。 固体颗粒带电量的大小及测量方式 ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。 对于蛋白质分子来说： 蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利用蛋白质的胶凝作用。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正电，在碱性溶液中羧基形成-COO-而带负电： 蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为：在某一pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。 等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。 蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。

蛋白质的性质实验(二)

蛋白质的性质实验（二） 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 一、蛋白质等电点的测定 1．目的 （1）了解蛋白质的两性解离性质。 （2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2．原理 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸和醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 3．器材 4．试剂 （1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 200mL 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200 mL锥形瓶内，用少量40～50 ℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10 mL1 mol／L醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至 100 mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 5．操作 （1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。

（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4 管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。 二、蛋白质的沉淀及变性 1．目的 （1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 （2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 （3）了解蛋白质变性和沉淀的关系。 2．原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶 体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 （2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀和凝固，蛋白质和重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

蛋白质的等电点测定与沉淀实验

实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应 姓名：指导教师：实验室： 组员：成绩： 第三部分：实验记录与分析 实验现象记录及分析： （一）蛋白质等电点测定 （二）蛋白质的盐析 1．蛋白质的盐析

2．重金属离子沉淀蛋白质 3．有机酸沉淀蛋白质

4．有机溶剂沉淀蛋白质 5．乙醇引起的变性与沉淀

第四部分：课后研讨题 1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。 适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。 2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。 3.氯化汞为何能做为杀菌剂？ 细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。 4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？ 蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。 （1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。 （2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。 （3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。 （4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。 （5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。 教师评阅： 签名

【1】生物样本中蛋白质的提取及测定(分子医学实验)

《分子生物学实验》 实验报告 实验名称：生物样本中蛋白质的提取及测定 姓名：杰 学号：3140104666 组别： 同组同学：唐曦

带教教师：伟俞萍 实验日期：2015年9月15日 目录 1.原理： (3) 1.1生物样本中蛋白质的提取 (3) 1.2生物样本中蛋白质的测定 (3) 1.2.1 Lowry法 (3) 1.2.2 考马斯亮蓝法 (4) 1.2.3 紫外吸收法 (4) 2.操作步骤 (4) 2.1生物样本中蛋白质的提取 (4) 2.2生物样本中蛋白质的测定 (5) 2.2.1 Lowry法 (5) 2.2.2 考马斯亮蓝法 (5) 2.2.3紫外吸收法 (5) 3、实验结果 (6) 3.1 原始数据 (6) 3.1.1 Lowry法 (6) 3.1.2 考马斯亮蓝法 (7) 3.1.3 紫外吸收法 (7)

3.2 数据处理 (8) 3.2.1 Lowry法 (8) 3.2.2 考马斯亮蓝法 (9) 3.2.3 紫外吸收法 (10) 4.讨论： (11) 1.原理： 1.1生物样本中蛋白质的提取 离体不久的组织，在适宜的温度及pH等条件下，可以进行一定程度的物质代谢。因此，在生物化学实验中，常利用离体组织来研究各种物质代谢的途径与酶系作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。例如，组织中的某些酶在久置后会发生变性而失活；有些组织成分如糖原、ATP等，甚至在动物死亡数分钟至十几分钟，其含量即有明显的降低。因此，利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时，都必须迅速将它取出，并尽快地进行提取或测定。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需的脏器或组织，除去外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液（必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液），再用滤纸吸干，即可用于实验。取出的脏器或组织，可根据不同的方法制成不同的组织样品。包括组织糜、组织匀浆、组织浸出液。由于动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。 1.2生物样本中蛋白质的测定 1.2.1 Lowry法 1921年，Folin发明了Folin-酚试剂法测定蛋白质的浓度，反应原理是利用蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂（磷钨酸-磷泪酸）生成蓝色

实验三 等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点

实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点 一、实验目的 了解等电聚焦的原理。通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。 二、实验原理 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。 蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。 两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。 在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分184

实验报告-从牛奶中分离酪蛋白

实验报告 一、实验名称：从牛奶中分离酪蛋白 二、实验目的： 1.学习从胶体中提取某一类物质的方法。 2.学习蛋白质的各种颜色反应及其原理。 三、实验原理： 1.蛋白质是两性化合物，溶液的酸碱性直接影响蛋白质分子所带的电荷。当调节牛奶 的pH值达到酪蛋白的等电点（pl）4.8左右时，蛋白质所带正、负电荷相等，呈电 中性，此时酪蛋白的溶解度最小，会以沉淀形式从牛奶中析出。 2.缩二脲反应原理：具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应,生 成红紫色的络合物。所有的蛋白质均有此显色反应。 3.蛋白黄色反应原理：硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，在加热状态下产生了黄色硝 基苯衍生物，再加碱颜色加深呈橙黄色。这是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸 和色氨酸的蛋白质所特有的颜色反应。 4.茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的 缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。 四、实验步骤及现象： 1.取50mL脱脂牛奶于150mL烧杯中，用热水浴加热至40℃，维持此温度，边搅拌 边加稀醋酸（1：9）溶液约2mL——有白色沉淀析出。 2.继续搅拌并使悬浊液冷却至室温，然后将混合物转入离心杯中，于3000r/min离心 15min。 3.离心完毕后，上清液倒入乳糖回收瓶中，沉淀用95%的乙醇（20ml）搅匀，然后用 布氏漏斗减压过滤，用乙醇-乙醚（1：1）混合液洗涤沉淀2次，每次约10ml，最 后用5ml乙醚洗涤沉淀一次，减压过滤至干——得到干燥的白色固体。 4.将干粉铺于表面皿上，称量并计算牛奶中酪蛋白含量。 5.称取0.5g酪蛋白，溶解于0.4M氢氧化钠溶液的生理盐水（5mL）中，然后滴加3-4 滴1%硫酸铜溶液，振荡试管——溶液变成紫色。 五、实验数据： 空表面皿的质量m0 =28.15g 表面皿与酪蛋白的总质量m1 =31.78g 牛奶中酪蛋白的质量m= m1 - m0 =3.63g 六、讨论与感想： 1.牛奶是一种胶体，在正常情况下是均一稳定的，要想分离出其中的某一成分，就应 该想办法使这种成分变成沉淀析出。通过本次实验，我知道了可以通过调节胶体的 酸碱性，来改变蛋白质分子所带电荷，使其达到等电点。此时蛋白质分子间的电荷 作用力最小，分子间没有了间隙，浮力减小，蛋白质就会沉淀。而实验中50ml牛 奶和2ml稀醋酸（1：9）所配成的混合液的pH恰好在4.8左右，正好是蛋白质的

实验一蛋白质含量测定

实验一蛋白质含量的测定 姓名：mangogola 一．实验原理 生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质含量测定方法有紫外吸收法、福林酚试剂法以及一些改进的Lowry法可以应用。 紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸中的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处，且蛋白质溶液的光密度值与其含量呈正比关系。该方法具有简单、灵敏、快速和不消耗样品的优点，但易受核酸分子中嘌呤、嘧啶等的干扰，准确度较差。根据蛋白质和核酸的吸收峰不同，可通过计算适当校正核酸的干扰作用。 Lowry法的原理是：在碱性条件下，蛋白质与铜离子形成铜-蛋白质复合物，该复合物可还原磷钼酸-磷钨酸（Folin试剂）产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。该方法灵敏度较高，但较费时。 对膜蛋白或相当稀的（如<1ug/ml）蛋白溶液的含量测定，以及为减小去污剂、脂类、碳水化合物的干扰，可采用一些改进的Lowry法，如蛋白质-染料结合法。原理是：当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时，最大吸收峰从465nm移动到595nm，而且吸收值在一定蛋白浓度下线性相关，因此用标准浓度的蛋白测OD595作标准曲线，即可求得待测样品的蛋白浓度。此方法简单经济、快速、灵敏度也较高。需要注意的是，染料与蛋白质可在3min内完成结合，由于染料试剂中含有酒精成分，易挥发，所以结合生成的复合物在1h 内可比较稳定地存在于溶液中，制作的标准曲线后部会出现弯曲现象。 二．实验过程（Lowry法） 1.溶液配制 A液：2%Na2CO3，用0.1mol/LNaOH配制。（不能将NaOH和 Na2CO3干粉混合配制，这样会因释放CO2而不准确） B液：0.5%CuSO4.5H2O,用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。 C液：使用前将A、B液按50:1混合，当天使用。 D液：Folin试剂 标准蛋白溶液：200ug/mLBSA溶液 2.标准曲线测定 按照下表进行操作，用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应，记录A500。取两组测定的平均值，以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 3.将待测样品稀释至标准曲线浓度范围内，同时按上述方法测A500，根据标准曲线读出蛋

酪蛋白的制备实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除酪蛋白的制备实验报告 篇一：酪蛋白的制备----生化实验 酪蛋白的制备 一、目的 1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 二、原理 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的ph调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 三、材料、试剂与器具 （一）材料 新鲜牛奶 （一）试剂 1、95%乙醇1200mL

2、无水乙醚1200mL 3、0.2mol/Lph4.7醋酸——醋酸钠缓冲液300ml先配A液与b液 A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称naAc·3h2o54.44g，定容至2000ml。b液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。 取A液1770ml，b液1230ml混合即得ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。 4、乙醇——乙醚混合液 乙醇：乙醚=1：1（V/V） （二）器具 1、离心机 2、抽滤装置 3、精密ph试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计 四、操作步骤 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、ph4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密ph试纸或酸度计调ph至4.7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000r/min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的纯化 1、用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r/min），弃

去上清液。 2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 3、将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。 （三）准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g/100mL牛乳（g%） 式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。 五、注意事项 1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。 2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。 3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。 六、实验报告 1、根据实际操作，以流程图形式总结酪蛋的制备方法。 2、合理分析实验所得率 七、思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？ 篇二：实验四、酪蛋白的制备

蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定 实验三蛋白质含量的测定 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l0,如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。 一、目的与要求: 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。 二、原理: 凯氏定氮法:食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。 ( 1 ) 2NH(CH)COOH+13HS0 (NH)2S0+6C0+12S0+ 16H 2222444222 (2)(NH)SO+2NAOH-----2NH+2HO+NASO 4242224 (3)2NH+4HBO----(NH)BO+5HO 33342472 (4) (NH)B0+HS0+5H0-(NH)SO+4HBO 424724249422 三、试剂与仪器: 1、硫酸钾 2、硫酸铜 3、硫酸

4、2,硼酸溶液 5、40,氢氧化钠溶液 6、混合指示剂:把溶解于95,乙醇的0.l,溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95,乙醇的0.l,甲基红溶液2毫升混合而成( 7、0.OINHCL标准溶液或0(01N硫酸标准溶液( 8、凯氏微量定氮仪一套。 9、定氮瓶100m1或50ml一只。 10、三角瓶150ml 3只。 11、量筒50ml、lOml、lOOml。 12、吸量管10ml只。 13、酸式滴定管1支。 14、容量瓶100毫升1只。 15、小漏斗1只。 四、操作方法: 1、样品处理:精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml 液体样品(约相当氮30-40mg)，移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g

蛋白质的等电点测定和沉淀反应

实验3 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 一、目的 1、了解蛋白质的两性解离性质。 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 二、原理 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。

（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固。蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 三、材料、试剂与器具 （一）材料 新鲜鸡蛋 （二）试剂 1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200ml 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40—50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL 1mol/L 醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 2、1.00mol/L 醋酸溶液100mL 3、0.10 mol/L醋酸溶液300mL 4、0.01 mol/L醋酸溶液50mL 5、蛋白质溶液500mL 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1:9） 6、pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液100mL 7、3%硝酸银溶液10mL 8、5%三氯乙酸溶液50mL 9、95%乙醇250mL 10、饱和硫酸铵溶液250mL 11、硫酸铵结晶粉末10000mL 12、0.1mol/L盐酸溶液300mL 13、0.1mol/L氢氧化钠溶液300mL 14、0.05mol/L碳酸钠溶液300mL 15、甲基红溶液20mL （三）器具 1、水浴锅 2、温度计 3、200mL锥形瓶 4、100mL容量瓶 5、吸管 6、试管及试管架 7、 7、乳钵 四、操作步骤 （一）酪蛋白等电点的测定 （1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 试管号蒸馏水 （mL） 0.01 mol/L蜡酸 （mL） 0. 1 mol/L蜡酸 (mL) 1. 0 mol/L蜡 酸(mL) 1 8.4 0.6 - — 2 8.7 - 0. 3 — 3 8.0 - 1.0 — 4 7.4 - - 1.6

酪蛋白的制备

实验5 酪蛋白的制备 一、目的 1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 二、原理 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 三、材料、试剂与器具 （一）材料 新鲜牛奶 （一）试剂 1、95%乙醇 1 200mL 2、无水乙醚 1 200mL 3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液300ml 先配A液与B液 A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。 B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。 取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。 4、乙醇——乙醚混合液 乙醇：乙醚=1 ：1（V/V） （二）器具 1、离心机 2、抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计 四、操作步骤 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化 1、用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。 2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 3、将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。 （三）准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%）

实验一 蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定

实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定 一、实验目的与要求 1.掌握蛋白质的两性解离性质； 2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。 二、实验原理 蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。 在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。 三、实验材料、试剂与仪器 1.材料与试剂 NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。 0.5 %酪蛋白溶液： 0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入 0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~ 8.5）；

0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有 0.57mL 0.1mol/LNaOH的水中。该指示剂的变色范围是： 酸性（pH 3.8）为黄色，pH 5.4为蓝色； 0.02 mol/L的HCl溶液：将0.8 mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480 mL即可； 0.02 mol/L的NaOH溶液：将0.8 g NaOH溶解于100 mL水中，最终加入到1000 mL； 0.1 mol/L的乙酸溶液： 将1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL； 0.01 mol/L的乙酸溶液：将0.1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL； 1 mol/L的乙酸溶液：1 mL冰醋酸（17 mol/L）加水到17 mL即可。 2.仪器 试管、滴管、移液管、pH试纸等。 四、实验方法与步骤 1.蛋白质的两性反应 1）取一支干净的试管，加入20滴 0.5 %的酪蛋白溶液，逐滴加入 0.01 %的溴甲酚绿溶液（约5~7滴），充分混合，观察溶液的颜色并解释（蓝色）。