EMSA步骤

B 准备跑预电泳

1、用0.5XTBE配制聚丙烯酰胺凝胶或者使用预制的DNA凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的浓度取决于靶DNA和结合蛋白的大小。大部分情况下使用4-6%的胶。

2、向电泳槽中倒入0.5XTBE高于泳道底（用以减少电泳中产生的热）。冲洗泳道并预电泳30-60mins。对于8x8x0.1cm的胶使用100v电压即可。

3、胶预电泳过程中进行C。

C 准备进行结合反应

注意：包括实验中的对照，以确保试剂盒正常发挥作用（见Section A）

1、将结合反应的组分、EBNA对照组份和试验样品融化后置于冰上。避免过度加热DNA

探针。马上要开始实验再融化EBNA提取物。

2、按照表格2和3混好20ul对照EBNA组和实验组结合体系。

3、结合体系在室温孵育20mins。

4、20ul结合体系中加入5ul的5XLoading buffer，用移液器混合几下。动作轻柔，不要剧烈！

D 结合反应产物进行电泳

1、暂停预电泳。

2、冲洗泳道，每个样上20ul。

3、接通电流（8x8x0.1cm的胶使用100v电压），电泳直到溴酚蓝条带跑到胶板2/3或3/4处。一般6%的胶上自由生物素-EBNA对照DNA双链迁移到溴酚蓝后面的位置。

E 转膜

1、将尼龙膜浸泡在0.5XTBE至少10mins。

2、将胶和膜按照三明治在清洁的电泳转移装置上摆好。在循环水浴锅中将0.5XTBE预冷到10度。使用洁净的镊子和无粉手套，用镊子夹膜的时候只夹在边角上。

注意：使用洁净的转移海绵。避免使用曾在Western blots用过的海绵。

3、380mA（~100V）转膜30mins。一般情况下，使用标准转移装置以380mA转移8x8x0.1cm 的胶30-60mins即可。

4、转移结束后，将膜溴酚蓝面朝上放在干燥滤纸上（保证胶上没有染液）。使得膜表面的buffer吸收进膜里，大概需要一分钟。不要使膜变干。接下来进行Section F。

F 将转移的DNA交联到膜上

交联有三种方法：

交联后进行Section G。或者，膜可以室温干燥保存几天，除非要进行Section G，否则不要使膜接触液体。

G 化学发光法检测生物素标记的DNA

下面的用量是针对8x10cm的膜。如果胶大的话，这步要适当调整用量。封闭和检测孵育都要放在干净的托盘或者塑料板里在摇床上进行。

1、在37-50度的水浴锅里轻轻晃动Blocking Buffer和4X Wash Buffer使其融化。这些buffer

可以在室温到50度之间使用，只要所有物质仍在溶液中。Substrate Equilibration Buffer 在4度和室温之间使用。

2、封闭：加入20ml Blocking Buffer摇床上孵育15mins

3、制备conjugate/blocking buffer solution：向20ul封闭液中加入66.7ul Stabilized

Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate (1:300 dilution)

注意：conjugate/blocking buffer solution用以优化核酸检测分子，不得加以修改。

4、将膜从封闭液中取出，放入conjugate/blocking buffer solution中，摇床上孵育15分钟。

5、制备1X wash solution：120 ml超纯水中加入40 ml 4X Wash Buffer。

6、将膜放到一个新的容器里，用20ml 1X wash solution简单漂洗一下。

7、洗膜：每次使用20ml 1X wash solution，洗5mins，共洗四次。

8、将膜放到一个新的容器里，加入30ml Substrate Equilibration Buffer。摇床上孵育5分钟。

9、制备Substrate Working Solution：向6 ml Stable Peroxide Solution中加入6 ml

Luminol/Enhancer Solution。

注意：暴露在阳光或其他任何强光下会影响Working Solution的作用。为了得到好的结果，应将Working Solution保存在棕色瓶中并且避免长时间暴露于强光下。短时间暴露于实验室灯光下不会影响Working Solution的作用。

10、将膜从Substrate Equilibration Buffer中取出，小心用滤纸接触膜的边缘吸干膜上多余液体。将膜放在一个干净的容器里或者干净的保鲜膜上。

11、将Substrate Working Solution滴在膜上，使其完全覆盖在膜表面。或者把膜的DNA面朝下置于Substrate Working Solution液体上。静置孵育5mins。

12、将膜从Substrate Working Solution中取出，小心用滤纸接触膜的边缘2-5s吸干膜上多余液体。不要使膜太干。

13、在膜上覆盖一层保鲜膜，避免产生气泡和皱纹。

14、X-光片曝光2-5分钟。