第二十一章 氧化磷酸化和光合磷酸化作用

第二十一章氧化磷酸化和光合磷酸化作用

一、选择题

1.下列化合物哪个不是电子传递链中的成员: 答（）

①辅酶Q；②细胞色素c；

③细胞色素b; ④细胞色素P

450。

2.下面关于呼吸链的论述，哪项不正确？答（）

①呼吸链各组分在膜结构中都具有特定的定位关系；

②NADH脱氢酶复合物含有铁硫蛋白；

③来自NADH的电子必须经CoQ传递至分子氧；

④氰化物不能阻止电子从细胞色素C传递到氧。

3.下述呼吸链组分哪种不含铁卟啉辅基？答（）

①细胞色素b; ②细胞色素c；

③NADH脱氢酶；④细胞色素aa

。

3

4.下列关于电子传递链的叙述，哪项正确？答（）

①电子传递过程依赖于氧化磷酸化；

②电子从NADH转移给氧的过程，形成3分子A TP；

③电子从NADH转移给氧的过程，自由能变化为正值；

④电子可从CoQ直接转移到分子氧。

5.下列物质中哪种是常见的解偶联剂？答（）

①2,4二硝基苯酚；②氰化物；

③寡霉素④安密妥。

6.下述抑制剂虽然在呼吸链的不同部位上起作用，但如果它们具有同等抑制效果时，造成

毒害作用最大的是: 答( )

①安密妥；②鱼藤酮；

③抗霉素A；④一氧化碳。

二、填空题

1.电子传递过程是电子从NADH或FADH2通过一系列，按其_从

低到高顺序排列构成的呼吸链传递到氧的过程。

2.线粒体由________________层膜组成，嵴是由__ _______形成的。

3.呼吸链是由NADH(或FADH2)、_ _和_ __组成的电子传递链。

4.阻断电子从细胞色素b到细胞色素C1传递的物质有________________。

5.CoQ是一个在呼吸链中与蛋白质结合不紧的辅酶，因而它能在_ 类和____________________类电子传递之间作为一种特殊的载体而起作用。

6.在氧化磷酸化的过程中，A TP的生成必须以_________________为前提，当一对电子从NADH传递到氧时产生___________________分子A TP。

7.电子传递和A TP形成在正常细胞内总是相偶联的，因此在完整的线粒体中只有当ADP

和_ __都充足时，才能使__________________达到最高水平。

8.质子电化学梯度产生的质子动力大小，与跨膜的_ _________________和_____________有关。

9.抗霉素A阻断电子由_ ______向__________________的传递.

10.阻断电子由NADH向CoQ传递的物质有__ _______________、

_______________和杀粉蝶菌素。

11.线粒体有两层膜，外膜平滑稍有弹性，内膜内陷为_ ______________，呼吸链各组分分

布在线粒体的___________________。

12.位于线粒体内膜的A TP合成酶主要由__ _______________和____ _____________两

部分组成。

13.解偶联剂使氧化磷酸化作用不能正常进行，常用的解偶联剂是__ _____，解偶

联剂对底物水平的磷酸化_____________________影响。

14.就目前所知，根据化学物质对氧化磷酸化过程影响的方式，可将它们分为三类:_

__ 、_ ____和离子载体抑制剂。

15.呼吸链中产生A TP的三个部位分别为____________________、_ _________________

和细胞色素C和分子氧之间。

16.电子通过呼吸链传递过程产生的自由能，不仅可用于形成________________，还可以

转变为___________________释放出来。

17.根据P.Mitchell的化学渗诱假说，认为由线粒体电子传递所释放的自由能蕴藏在____________________中，通过ATP合成酶_____________________。

三、判断题

1.CO抑制呼吸链中的细胞色素氧化酶而不是NADH脱氢酶。答（）

2.褐色脂肪组织的线粒体中，NADH经呼吸链被氧化，其P/O值低于1。答（）

3.在线粒体内膜上，FADH2氧化磷酸化的P/O值为3。答（）

4.在生物氧化过程中，分子氧可以直接与氢原子结合生成水。答（）

5.呼吸链又称电子传递链，它由一系列电子传递体组成，能将代谢物氧化脱下的H+和电子传递到分子氧。答( )

6.电子从呼吸链起始成员传递到CoQ时，只是保证CoQ的还原，并不产生A TP。答（）

7.呼吸链中的细胞色素类蛋白是以FAD为辅基的电子载体。答（）

8.按摩尔数计算，呼吸链中的FAD含量大于细胞色素C的含量。答（）

9.含FAD或FMN的黄素蛋白能与电子受体起反应。答（）

10.呼吸链存在于原核细胞的质膜和真核细胞的线粒体内膜上。答（）

11.铁硫蛋白的铁-硫中心的铁原子只与酸不稳定的无机硫原子结合，而不与蛋白质的半胱

氨酸残基的硫原子结合。答（）12.大多数铁硫蛋白处在还原状态时，在可见光波长范围内的吸收减少50%，因而可以直

接用来测定在线粒体内膜中该组分氧化还原状态的变化。答（）

13.寡霉素对电子传递所造成的抑制作用可被抗霉素A解除。答（）

14.当线粒体内ADP浓度很低时，加入解偶联剂导致电子传递速率降低。答（）

15.解偶联剂与氧化磷酸化抑制剂的作用机制相同。答（）

16.在解偶联剂存在的情况下，氧化磷酸化抑制剂如寡霉素不影响电子传递的速度。

答（）17.电子传递与磷酸化是紧密偶联的，这种关系意味着电子的传递只在A TP合成时才能发生。答（）

18.NAD+和NADH的互变在于吡啶环上氮原子价数的改变和C4的加氢和去氢。答（）

19.安密妥抑制异柠檬酸氧化过程中的A TP形成，但不抑制琥珀酸氧化过程中的A TP形成。

答（）

四、名词解释

1.解偶联剂

2.呼吸链

3.氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)

五、问答题

1.寒带动物体内的褐色脂肪组织，含有较多数量的线粒体，在氧化磷酸化的过程中，NADH

氧化的P/O比低于1，说明该组织线粒体中P/O比低的生理意义。

2.需氧细菌如何进行氧化磷酸化？

3.体外重组的呼吸链复合物Ⅱ和Ⅲ在有氧条件下与琥珀酸，CoQ及细胞色素C混合，37?C 保温数小时后，混合液中会发生什么变化？

4.氰化物是电子传递链中细胞色素氧化酶的抑制剂，而亚硝酸盐是氰化物有效的解毒剂，请说明其解毒机理

5.采用何种实验方法可以区分呼吸链中的各种细胞色素？

6.缬氨霉素是氧化磷酸化的解偶联剂还是抑制剂？请予以解释。

7.将二环已基碳二亚胺(DCCI)加入到呼吸活跃的线粒体悬浮液中，氧消耗的速度和A TP产生的速度都明显降低，如果再加2,4-二硝基本酚到线粒体制剂中，氧的消耗得到恢复，但

A TP的生成仍被抑制:

①DCCI是抑制电子传递过程还是抑制磷酸化作用？

②DCCI为什么会影响线粒体的氧消耗？

③下面哪种抑制剂与DCCI的作用相似？抗霉素A、鱼藤酮、寡霉素、砷酸盐。

六计算题

1.试计算下列过程中P/O的理论值(GTP相当于A TP)

①异柠檬酸→琥珀酸；

②在二硝基苯酚存在的情况下，α-酮戊二酸→琥珀酸

③琥珀酸→草酰乙酸

②α-酮戊二酸+NAD+→琥珀酰CoA+NADH?H+，

③琥珀酸+FAD→延胡索酸+FADH2

2.葡萄糖转变为乳酸时，在标准条件下，?G0'= -217.36kJ/mol，在厌氧细胞内，每摩尔葡萄糖转变为乳酸时，产生2摩尔A TP，请问:

0'是多少？

①该反应与A TP生成的偶联反应的?G

②在厌氧细胞中，该反应能量转变为A TP的效率是多少

磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一, 白质磷酸化和去磷酸化为...

摘要 磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，蛋白质磷酸化和去磷酸化为真核细胞提供了调节机制。随着高通量鉴定磷酸化蛋白质技术的发展，尤其是质谱技术在蛋白质组学中的应用，磷酸化修饰数据不断积累，从现有数据中挖掘规律从而对未知蛋白质进行磷酸化修饰位点预测的条件日益成熟。将计算方法引入磷酸化蛋白质组学的研究中，将有利于发现新的磷酸化修饰规律并为生物学实验提供验证信息，从而推动磷酸化蛋白质组学的发展。 计算智能领域的方法可以很好地应用于位点预测问题。但对于生物信息学来说，除了给出较为准确的预测结果外，还需要给出对判断结果易于理解的解释才能够增加预测方法的可信度。规则抽取不但可以提供合理的解释来指导生物学实验，而且可以从现有数据中发现新的具有生物学意义的磷酸化修饰规律为磷酸化蛋白质的进一步研究提供有价值的参考信息。 本文深入分析了磷酸化修饰位点数据的特点，采用支持向量机分类方法试验和比较了多种特征构造提取、特征选择和分类方法的有效性；提出用AdaBoost 方法对筛选后的氨基酸性质和邻近序列位置进行特征选择并进行分类器训练，形成了新的磷酸化位点预测算法AproPhos，该算法在特异性高于已有预测算法（约2个百分点）的基础上，大大提高了预测的灵敏度（约10个百分点）。同时设计了一种新的基于AdaBoost方法的规则抽取方法，可以给出可理解的修饰位点邻近序列上氨基酸性质分布规律，并对分类结果进行解释。AproPhos及其规则抽取算法扩展了磷酸化位点预测方法在实际中的应用范围，既可以用于提供充分信息的位点预测，又可以用来提高磷酸化蛋白质质谱鉴定效率。 最后本文提出了一种利用串联质谱同位素信息进行分子式预测的算法和系统FFP(Fragment ion Formula Prediction)，无论从计算效率上还是预测精度上较以前的方法都有了很大的提高。使分子式预测可以广泛用于质谱的预处理和蛋白质（包括磷酸化蛋白质）的鉴定，提高鉴定效率。 关键词：磷酸化，位点预测，规则抽取，SVM，AdaBoost

蛋白质磷酸化概述

蛋白质磷酸化概述 蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增值的基础。很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用，而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。此外，在所以有核生物中，细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。磷酸化作用也控制着分化和发育，如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。最后，新陈代谢受磷酸化作用的调节控制，尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。因而，形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能，他们常常不约而同，有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。 研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐（32Pi）进行生物合成标记。这种方法非常简单，而只将标记物中加入到培养基中。在节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。该方法能达到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。 大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。这三种羟基磷酸氨基酸在

酸性PH条件下化学性质稳定，酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。在节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合，它们可以是以磷酸－酶的中间体或稳定修饰物的形式存在，这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定，不能用对酸稳定磷酸氨基酸的标准技术来研究，它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围，读者可以参考《酶学方法》（Methods in Enzymolcgy）第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。 磷酸酪氨酸不是含量丰富的磷酸氨基酸，因而一般很难在用32Pi标记的样品中检出，尤其是当样品中含有大量在丝氨酸残基上磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难。凝胶电泳分级后的样品以碱处理，使RNA水解并使磷酸丝氨酸脱磷酸，可以大大提高磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检出率，在节中描述一种碱处理的简单方法。 如果蛋白质被磷酸化，无需借助生物合成标记方法也可鉴定磷酸氨基酸。例如，蛋白质中所含的稀有的磷酸酪氨酸可用抗磷酸酪氨酸的抗体来检测，其特异性和敏感性相当高。更普遍的是，蛋白质的磷酸化常常使蛋白质在SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳中的迁移率发生变化，而且几乎总是改变它的等电点。将蛋白质和磷酸酶共同温育后，从凝胶迁移率的变动可以推论出非标记蛋白质存在磷酸化残基。这种方法在内源性ATP以[γ-32P]ATP进行标记的效率很差时很实用，如目的蛋白是来源于某些难以进行生物合成标记的组织或来源于体外翻译的情

光合作用机理

光合作用机理 光合作用的是能量及物质的转化过程。首先光能转化成电能，经电子传递产生ATP和NADPH形式的不稳定化学能，最终转化成稳定的化学能储存在糖类化合物中。分为光反应（light reaction）和暗反应（dark reaction），前者需要光，涉及水的光解和光合磷酸化，后者不需要光，涉及CO2的固定。分为C3和C4两类。 （一）光合色素和电子传递链组分 1．光合色素 类囊体中含两类色素：叶绿素（图7-21）和橙黄色的类胡萝卜素，通常叶绿素和类胡萝卜素的比例约为3:1，chla 与chlb也约为3:l，全部叶绿素和几乎所有的类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，与蛋白质以非共价键结合，一条肽链上可以结合若干色素分子，各色素分子间的距离和取向固定，有利于能量传递。 图7-21 叶绿体分子结构 2．集光复合体（light harvesting complex）

由大约200个叶绿素分子和一些肽链构成（图7-22）。大部分色素分子起捕获光能的作用，并将光能以诱导共振方式传递到反应中心色素。因此这些色素被称为天线色素。叶绿体中全部叶绿素b和大部分叶绿素a都是天线色素。另外类胡萝卜素和叶黄素分子也起捕获光能的作用，叫做辅助色素。 图7-22 集光复合体 3．光系统Ⅱ（PSⅡ） 吸收高峰为波长680nm处，又称P680。至少包括12 条多肽链。位于基粒于基质非接触区域的类囊体膜上。包括一个集光复合体（light-hawesting comnplex Ⅱ，LHC Ⅱ）、一个反应中心和一个含锰原子的放氧的复合体（oxygen evolving complex）。D1和D2为两条核心肽链，结合中心色素P680、去镁叶绿素(pheophytin)及质体醌(plastoquinone)。 4．细胞色素b6/f复合体(cyt b6/f complex)

写出氧化磷酸化和光合磷酸化的具体过程

?写出氧化磷酸化和光合磷酸化的具体过程。、 氧化磷酸化： 代谢物脱下的氢离子和电子经电子呼吸链传递到O，生成水，同时释放的能量使ADP磷酸化成ATP的过程即氧化磷酸化，也是电子传递与ATP形成的偶联机制。具体过程： 1.蛋白质、糖类、脂肪、经过分解后，产生相关产物，产生乙酰CoA后进入 三羧酸循环 2.三羧酸循环后产生含有高能电子的NADH与FADH2 3.进入电子传递链（2条途径） 1）NADH呼吸链： 复合体Ⅰ（氧化NADH，获得高能电子并传递给CoQ）→CoQ →复合体Ⅲ（氧化UQH2，获得电子传递给Cytc ）→Cytc →复合体Ⅳ（氧化Cytc ，获得电子并传递给O2，泵出H+）→O2 2）FADH2呼吸链： 复合体Ⅱ→CoQ →复合体Ⅲ→Cytc →复合体Ⅳ→O2 4.高能电子通过电子传递链传递给氧生成水 5.质子驱动，ATP合成 电子传递过程中，膜上电子传递复合物将基质中质子转运至膜间隙，形成 ATP合成酶所需的质子梯度，使ADP磷酸化成ATP。 光合磷酸化

叶绿体的类囊体膜或光合细菌的载色体在光下催化ADP与磷酸（Pi）形成ATP 的反应。在光合作用的光反应中,除了将一部分光能转移到NADPH中暂时储存外,还要利用另外一部分光能合成ATP,将光合作用与ADP的磷酸化偶联起来,这一过程称为光合磷酸化。 具体过程： 1.捕光色素/天线色素（大部分叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素）捕获光能 光，不发生光化学反应 2.反应中心色素（特殊状态的叶绿素a）将光能转变为化学能，分为P700与 P680 3.反映中心色素、原初电子供体（D）和原初电子受体(A)组成反应中心 4.捕光色素捕获光能，通过共振，反应中心色素被激发，在原初电子供体处 获得电子，并将电子传递给原初电子受体，反应中心色素被氧化，从原初电子供体处得电子恢复原初状态，电子供体被氧化。氧化还原不断发生，实现D被氧化A被还原，光能转换为化学能。 5.电子传递： LHCⅡ中天线色素分子吸收光能并将光能传递给P680，P680夺取水中电子，将水氧化成O2，Pheo将电子传递给PQ，PQ接受电子并将基质中的质子转移至类囊体。建立质子梯度。 Cytb6f将电子传递给PC，连接PSⅡ与PSⅠ。 PC接受电子后结合并传递给PSⅠ中激发态P700。电子传递到Fd-NADP+还原酶，合成NADPH。

蛋白质磷酸化1

浅谈蛋白质磷酸化 摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。 关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测 随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。 一、蛋白质磷酸化的概述 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷

论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展

论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展 病毒所梁晓声200628012415030 细胞信号传导过程中磷酸酶/磷酸激酶对蛋白磷酸化程度的调控控制了细胞信号传递与否，信号强度等等细胞信号传导的过程从某种程度上说就是信号传导相关分子磷酸化水平的调节过程。 磷酸酶/磷酸激酶作为胞内信号直接或间接的靶酶通过磷酸化程度控制其它酶类或蛋白质的活性，一般情况下被磷酸化的酶有活性，脱磷酸后的酶没有活性。通过这种方式可以在不改变细胞内酶或相关蛋白的浓度的情况下将部分酶活冻结或解冻。在有外界信号刺激的时候可以迅速解冻酶活而不必合成新的酶。 由于酶反应具有高度专一性，使得蛋白质磷酸化与去磷酸化这种方式在胞内介导胞外信号时具有专一应答的特点。这就使得细胞信号传导途径的上游成分只能针对一个或几个的下游成分起作用,使信号传递具有很强的专一性。同时对信号的灭活也不会由于识别的错误而影响其他信号传导途径。 磷酸化与去磷酸化在细胞对外界信号的持续反应中具有重要的作用。信号引起的细胞生理学效应中，有许多是相当持久的，如细胞的分裂、分化等。虽然胞内信号分子的寿命可以很短，但蛋白激酶一旦激活，其活性却可以通过某些方式（如自身磷酸化）维持较长时间；更重要的是被它磷酸化所调节的蛋白质和酶类，其效应可以维持更长时间，直到被蛋白磷酸酶脱磷酸化为止。 蛋白磷酸化对外界信号具有放大作用，由于是酶促反应，一个酶分子可以催化成百上千个底物分子，即使只有很弱的胞外信号也可以通过酶促反应得到充分的放大。 蛋白质激酶 蛋白质激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨基酸残基的特异性，将这些激酶分为4类。其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为250-300个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的，并认为它们有共同的祖先。因此，它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是，这些序列表现为一组组高度保守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有11种这类高度保守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名，从最N-端的I开始,到最C-端的XI。对这些酶的结晶进行X-射线结构分析，发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为，亚域I,II和VII在结合ATP中起重要作用；而亚域VIII则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说，在亚域VIII中，紧靠关键模体上游的氨基酸残基有十分有趣的差异，它们是-KWTAPE- 或-KWMAPE-，看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。 蛋白磷酸酯酶 丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶，选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性。主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C等。 酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)分胞质型(非受体型)和受体型(PTPR)

磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来. 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC 柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。 1.3 TiO2色谱 近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注。2004年，Pinkse等人将二氧化钛（TiO2）技术引进磷酸化蛋白质组学领域，利用TiO2与磷酸肽上磷酸基团的亲和能力实现对磷酸肽的相对富集，并建立了通过TiO2作为预分离的2D-NanoLCESI-MS/MS 技术平台。虽然该技术在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术，但仍然存在非特异性吸附等问题。后来，人们又利用纳米材料比表面积大的特点，对TiO2纳米级材料进行了开发

分子生物学---11蛋白质磷酸化和信号转导

蛋白质磷酸化和信号转导 一、蛋白质磷酸化过程和功能 1、蛋白质磷酸化p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n （1）过程： P r o t e i n k i n a s e(蛋白激酶) P r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n A T P A D P P h o s p h a t a s e（磷酸酶） P i （2）主要磷酸化位点（对有-O H的氨基酸进行磷酸化） 丝氨酸（S e r）/苏氨酸（T h r）:磷酸化之后电荷发生变化使蛋白质活性改变 酪氨酸（T y r）:磷酸化之后通常招募其他蛋白因子，使下游蛋白质活性改变 （3）蛋白质磷酸化的功能 生物热力学；蛋白质降解；酶活性的调控（激活o r抑制）；蛋白质相互作用 2、重要的蛋白激酶 （1）C D K s：c y c l i n-d e p e n d e n t k i n a s e周期蛋白依赖性蛋白激酶，属于一组调控细胞周期的S e r/T h r蛋白激酶，和周期蛋白c y c l i n协同作用发挥激酶活性，作用于细胞周期的不同阶段 （2）R T K s：R e c e p t o r T y r o s i n K i n a s e受体酪氨酸激酶，是具有酪氨酸激酶活性的受体，如E G F R（表皮生长因子受体） （3）C y t o p l a s m i c P r o t e i n-T y r o s i n e K i n a s e s：非受体酪氨酸激酶，存在于细胞质中，大部分结构中存在S H2、S H3结构域，是磷酸化的结合位点。如S r c、J A K、 F A K等 二、信号转导 1、信号转导的种类 E n d o c r i n e（内分泌）：激素 P a r a c r i n e（旁分泌）：神经递质 A u t o c r i n e（自分泌）：生长因子 2、信号转导的步骤 （1）信号分子的合成 （2）信号分子释放 （3）信号分子传导 （4）信号分子与受体结合 （5）激活细胞内信号通路 （6）细胞内信号传导

磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍

磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。

磷酸化

磷酸化（phosphorylation ）：生物分子结合磷酸基团的过程。 磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质（protein）上的过程。磷酸基团的添加或除去（去磷酸化）对许多反应起着生物“开/关”作用。磷酸基团的添加或除去能使酶（enzyme）活化或失活，控制诸如细胞分裂这样的过程。添加磷酸基团的酶称为激酶（kinases）；除去磷酸基团的酶称为磷酸酶。 磷酸化就是通过磷酸转移酶在底物上加上一个磷酸基团。 光合磷酸化（photophosphorylation）：在光照条件下，叶绿体将ADP和 无机磷(Pi)结合形成ATP的生物学过程。是光合细胞吸收光能后转换成化学 能的一种贮存形式。 氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）：物质在体内氧化时释放的能量供给ADP与无机磷合成ATP的偶联反应。主要在线粒体中进行。 底物水平磷酸化（substrate level phosphorlation）：物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成，这种产生ATP等高能分子的方式称为底物水平磷酸化 底物水平磷酸化不同于：氧化磷酸化（电子传递水平磷酸化） 1. 氧化磷酸化偶联在生物氧化过程中，代谢物脱下的氢经呼吸链氧化生成水时，所释放出的能量用于ADP磷酸化生成A TP。氧化是放能反应，而ADP生成ATP是吸能反应，这两个过程同时进行，即氧化时偶联磷酸化的过程称为氧化磷酸化。这种方式生成的ATP 约占ATP生成总数的80%，是维持生命活动所需能量的主要来源。 2. 电子传递链中A TP形成的部位 3. 影响氧化磷酸化的因素 （1）ATP与ADP的调节作用：ADP/ATP比值下降，说明细胞储备ATP较多，所以氧化磷酸化速度缓慢甚至停止。反之这个比值升高说明细胞需要ATP，于是氧化磷酸化加速进行。 （2）甲状腺素的调节作用：导致氧化磷酸化增强，促进物质氧化分解代谢，结果耗氧量和产热量均增加。故甲状腺机能亢进的病人常出现基础代谢率（BMR）增高、怕热，易出汗等症状。 （3）氧化磷酸化的抑制剂：氧化磷酸化的抑制剂主要有两类：一是抑制电子传递的抑制剂（呼吸链抑制剂）；另一类是使氧化磷酸化拆离的解偶联剂。呼吸链抑制剂的作用与一定部位的电子传递体结合而阻碍其电子传递。 氧化磷酸化解偶联剂不影响呼吸链的电子传递，但能减弱或停止ATP合成的磷酸化反应。最常见的解偶联剂是2，4-二硝基苯酚（DNP）。

植物生理生态学复习资料

植物生理生态学 ●绪论 植物生理生态学：研究植物与环境的相互作用和机制的一门实验科学。 研究层次：植物个体—器官—组织水平。 植物生理生态学特点：植物生态学的一个分支，主要用生理学的观点和方法来分析生态学现象。研究生态因子和植物生理现象之间的关系。 植物生理生态学主要集中在组织、器官、个体与生物环境之间的相互关系，作为对生态现象的验证和解释，同时也对微观植物生理学提供了表征验证。 ●植物与环境 环境：某一特定生物体或生物群体周围一切因素的总和，包括空间及直接或间接影响该生物体或生物群体生存的各种因素。 环境的本质就是生物生存和发展的资源或影响这种资源的因素。 生态因子：环境中对生物起作用的因子。对生物的生长、发育、生殖、行为和分布有着直接或间接影响。 生存条件：生态因子中对生物生存环境不能缺少的生态因子的总称。 生境：特定生物个体或群体的栖息地的生态环境。 生态因子根据性质划分： 1)气候因子：温度、水分、光照、风、气压和雷电等。 2)土壤因子：土壤结构、土壤成分的理化性质及土壤生物。 3)地形因子：陆地、海洋、海拔高度、山脉走向与坡度等。 4)生物因子：包括动物、植物和微生物之间的各种相互作用。 5)人为因子：人类活动对自然的干预、影响、破坏及对环境的污染等。 植物与生态因子之间的相互关系： 1)生态作用：生态因子对植物的结构、过程、功能、分布等产生的影响。 2)生态适应：植物改变自身结构与过程以与其生存环境相协调的过程。 3)相互作用：植物对环境做出的响应和反馈，并影响环境的过程。（环境小 气候、土壤结构、土壤微生物、大气组分、生物链结构、协同进化、生 物多样性。）

植物生理思考题 (2)

高等植物生理学思考题 龚月桦： 光合产物的运输与分配思考题 1.韧皮部装载和卸出的途径有哪些？各有何特点？ 2.同化物的分配受哪些因素的影响？其中什么是主要的决定因素？ 3.同化物在库器官是如何转化的？ 以蔗糖为最终储藏物质植物与器官的转化 ? a ：蔗糖从se —cc 复合体卸出至质外体后，b ：被胞壁酸性转化酶水解成已糖，c ：贮存薄壁细胞吸收已糖进入细胞质，d ：然后已糖进入液泡，在液泡中合成蔗糖。 以淀粉为最终储藏物质植物与器官的转化 库细胞中Suc （蔗糖）分解形成的磷酸己糖可通过造粉体膜上己糖载体进入造粉体， 或者通过糖酵解途径形成TP （磷酸丙糖），再由“Pi 转运器”进入造粉体，通过醛缩酶和FBPase 的作用形成F6P ，造粉体内的磷酸己糖最后都转变成G-1-P ，在ADPG 焦砱酸化酶的作用下形成ADPG ，ADPG 则在淀粉合成酶和分支酶的作用下最终合成淀粉。 4.若你现在需要研究小麦(或其它作物)同化物的转运分配,可以进行哪些测定? 光合作用复习思考题 1.类囊体膜脂的种类及特点 膜脂有一个很强的亲水基团，有两个非极性的脂酰基，具有疏水性。 除此之外，类囊体膜脂与其它生物膜相比，还具有以下几个特点： ①不带电荷的糖脂占膜脂的75%左右，主要是单半乳糖基油二酯（MGDG ）和双半乳糖基甘油二酯（DGDG ）；而且两种糖脂均含高比例的不饱和脂肪酸，主要是亚麻酸（18:3）。 ②磷脂的主要组分是阴离子脂类磷脂酰甘油PG ，约占类囊体膜脂的10%，而不是PC; 而且磷脂酰甘油PG 中含有叶绿体特有的脂肪酸——反式十六碳一烯酸（trans-16:1），它需要在光下才能合成。 ③含有带负电荷的硫脂SQDG ，含量占类囊体膜脂的10%左右。在非光合组织中SQDG 的含量极低。 ④类囊体膜的主要脂类单半乳糖基甘油二酯MGDG 是非双层结构脂，在生理温度上，DGDG ，SQDG ，PG ，PC 单独分散到水中时都形成双层结构，而高等植物类囊体膜的MGDG 则不形成双层结构，而是形成非双层结构。 糖脂类 磷脂 单半乳糖基甘油二酯 （MGDG) 双半乳糖基甘油二酯 （DGDG) 硫代异鼠李糖基甘油二酯 （SQDG ） 磷脂酰甘油（PG ） 磷脂酰胆碱（PC ）

植物生理学试题1

植物生理学试题1 一、选择题：（10分，每题1分） 1．近年来研究证明糖蛋白具有多方面的生物活性，如（? ?） A．??抗原与抗体的识别? ?? ?? ?? ? B．识别进入质膜的物质 C．有机物质的运输? ?? ?? ?? ?? ? D．增加了膜的流动性 2．仙人掌的抗旱机制主要是（??）。 A．耐旱? ?? ? B．避旱? ?? ?? ?C．耐兼避? ?? ???D．都不是 3．油料种子发育过程中，最先积累的贮藏物质是（? ?） ? ? A．淀粉? ?? ? B．油脂? ?? ?? ?C．有机酸? ?? ???D．脂肪酸 4．将北方冬小麦引种到广东栽培，结果不能抽穗结实，其主要原因是（??）。? ? A．日照长? ???B．气温高? ?? ? C．光照强? ?? ???D．日照短 5．植物的向光性与（??）的不均匀分布有关。 ? ? A．CTK? ?? ? B．GA? ?? ?? ? C．IAA? ?? ?? ???D．ABA 6．在组织培养中，当IAA/CTK的比例高时，有利于（??）。 A．根的分化? ?B．芽的分化? ???C．愈伤组织的生长D．都不对 7．当一株植物处于不良环境时，则自由水/束缚水的比值将（??）。 A．降低? ?? ? B．升高? ?? ?? ?C．不变? ?? ?? ? D．为零 8．当植物从缺氧环境转移到空气中，三羧酸循环则（??）。 A．停止? ?? ? B．减慢? ?? ?? ?C．加快? ?? ?? ? D．不变 9．植物细胞与外界发生水分交换时，当细胞的水势小于外界时，则细胞（??）。A．吸水? ?? ? B．失水? ?? ?? ?C．不吸不失? ?? ?D．水分子不动 10．反映植株需肥的形态指标中，最敏感的是（? ?）。 A．株高? ?? ? B．节间长度? ???C．叶色? ?? ?? ? D．生长速率 二、名词解释：（10分，每题2分） 1.双光增益效应? ??? 2.代谢源? ? 3. 呼吸跃变? ? 4. 水分临界期? ??? 5.呼吸商 三、判断正误：（10分，每题1分）? 1．C3植物是光呼吸植物，因而根系也能进行光呼吸。（? ? ） 2．有机物质运输分配是决定产量高低和品质好坏的一个重要因素。(? ? ) 3．任何逆境都会使光合速率下降。(? ???) 4．在光周期诱导过程中,用闪光中断暗期不影响短日植物开花。(? ???) 5．ABA能诱导三重反应。(? ?) 6．生长最快的温度是生长最适温度。(? ???) 7．提高环境中的氧含量,可使EMP加快。(? ?) 8．植物吸水量和吸盐量之间存在着直接的依赖关系。(? ? ) 9．蒸腾效率高的植物,一定是蒸腾量小的植物。(? ? ) 10．PEP羧化酶对CO2的亲和力和Km值均比RuBP 羧化酶高。（? ? ） 四、简答题：（50分） 1．粮食贮藏为什么要降低呼吸速率？（7分） 2．水分在植物生命活动中的作用有哪些？（7分） 3．简述引起种子休眠的原因有哪些？生产上如何打破种子休眠？（7分）4．外界环境因素是如何影响植物根系吸收矿质元素的？（7分） 5．简述果实成熟时有哪些生理变化？（7分）

植物生理第3章光合答案

参考答案： 一. 填空题 1. CO2，H2 O 2. 20~100（或200 ），40~60，10~50 （或100 ） 3. 卟啉，水，叶醇，脂 5. -CH3，CHO 6. 长光，短光 7. 光，温度，水分，矿质营养 8. 原初反应，电子传递与光合磷酸化，碳素同化作用 9. 光，暗，光能向活跃化学能，活跃化学能向稳定化学能 10. 表观光合速率，呼吸速率 11. 100 ，外，P 700 ，175 ，内，P 680 12. 原初反应，电子传递与光合磷酸化，碳素同化作用 13. 光能的吸收，传递，光能转变成电能，类囊体膜 14. 原初反应 15. 非环式光合磷酸化，环式光合磷酸化，假环式光合磷酸化，非环式光合磷酸化 16. C3，C4，PEP，PEP 羧化酶，草酰乙酸，叶肉，RuBP，RuBP羧化酶，3 –磷酸甘油酸，叶肉 17. H2O 18. 卡尔文，同位素示踪，纸谱色层分析 19. 反应中心色素分子，原初电子供体，原初电子受体 20. P 700，P 680 21. 700nm ，680nm 22. 2，3，12，18 23. ATP，NADPH 24. H2O，NADP+ 25.原初反应，电子传递与光合磷酸化，ATP，NADPH，O2，类囊体膜 26. RuBP 羧化酶，NADP –磷酸甘油醛脱氢酶，FBP 磷酸酯酶，SBP 磷酸酯酶，Ru5P 激酶 27. CAM，C3，夜间气孔张开，夜间有机酸含量高 28. 50 μmol/mol 左右，0~5 μm ol/mol，PEP 羧化酶对CO2的亲和能力强 29. CO2，液泡，CO2 30. 叶肉，维管束鞘 31. PEP，CO2，OAA，RuBP，CO2，PGA 32. 乙醇酸，葡萄糖，叶绿体，过氧化体，线粒体，线粒体 33. 乙醇酸，RuBP 加氧 34. RuBP 羧化酶-加氧酶（Rubisco），羧化，加氧 35. 叶绿体，叶绿体，过氧化体，叶绿体，线粒体 36. 卡尔文，米切尔，爱默生，明希 37. C3，C4，CAM代谢途径，C3，糖 38. 小麦，大豆，棉花，玉米，甘蔗，高粱 39. CO2 /O2比值高，CO2 /O2比值低 40. 光照，温度，水分，CO2，矿质营养 41. 光反应不能利用全部光能，暗反应跟不上 42. H2O 被氧化到O2水平，CO2被还原到糖的水平，同时伴有光能的吸收、转换与贮存 43. 反应中心，聚光（天线） 44. 叶绿体，细胞质 45. 维管素鞘，叶肉 46. 胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a 、叶绿素b

磷酸化蛋白的研究进展

多学科的相互渗透和研究技术手段的高速发展，生命科学在20世纪取得了巨大的进步。特别是在基因组研究方面已取得了许多的成果，包括人类基因组在内的多种生物的基因组全序列测定已陆续完成，面对庞大的遗传信息，人们开始关注这些序列信息与生命活动之间的直接或间接的联系。基因的功能是什么？它们又是如何发挥这些功能的？ 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文介绍了蛋白质磷酸化定义、修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质鉴定技术、检测方法并综述了近年来国内外的主要研究进展。 蛋白质磷酸化：指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。

磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类，即:O-磷酸盐、N-磷酸盐、酰基磷酸盐和S-磷酸盐。O-磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的,如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸,羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚；N-磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；而S-磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成。 蛋白质磷酸化具有以下功能: (1) 磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S-或N-磷酸盐) ,如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统( PTR) 的组氨酸蛋白激酶(HPr) 。 (2) 磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基) 或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基) 。 (3) 天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。 [32 P]放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法。体内代谢培养用[32P]标记磷酸盐作为磷酸基团供体,被[32P]标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。磷蛋白酸水解产物用二维磷酸肽作图法分析可以确定蛋白质的磷酸化氨基酸类型。磷蛋白水解肽段经HPLC分离,通过监测放射性活度收集到磷酸肽,用Edman测序或串联质谱分析都可以确定磷酸化位点,当然这需要有足够量的磷蛋白用于分析。早在1991年, Arrigo等就采用[32P]代谢标记和二维凝胶电泳分析的方法观察了细胞在耐热处理后再经热刺激和肿瘤坏死因子刺激后热休克蛋白hsp28磷酸化程度的变化,发现耐热处理后细胞在热刺激和肿瘤坏死因子刺激下所引起的hsp28的磷酸化程度会显著降低。[32P]放射性标记可以非常灵敏、直观地检测磷蛋白,尤其是与二维凝胶电泳结合后可以从蛋白质组的角度整体观察细胞内蛋白质磷酸化程度的变化,它的缺点是不能标记组织样本,并且存在放射性污染的问题。

蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的,包括细胞

蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素（ubiquitin）介导的蛋白降解等过程。特别是酪氨酸磷酸化，作为细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，通常通过引发蛋白质之间的相互作用，进而介导生长因子、荷尔蒙和细胞因子等对细胞膜上受体的信号调控。 然而，酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰中所占的比例却非常低。大概10%的细胞蛋白会受到磷酸化共价修饰，但每100次蛋白的磷酸化修饰中仅有1次酪氨酸基团的修饰。与大部分细胞中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估计要低2000倍。正是由于细胞中酪氨酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷酸化对于细胞信号的调控和许多重要生物现象的研究具有极为重要的意义，而对发生酪氨酸磷酸化的蛋白质的识别及磷酸化位点的鉴定对揭示细胞过程的调控和药物的作用位点起到非常重要的作用。 研究蛋白质磷酸化的相关方法： 磷酸化Western Blot 对于信号转导科研来说，抗酪氨酸磷酸化抗体的出现是一个意义重大的事件。在没有抗酪氨酸磷酸化抗体之前，蛋白质和酶的酪氨酸磷酸化只能通过非常危险的并且很费时的放射性实验来检测。而利用抗酪氨酸磷酸化抗体，则可以通过Western Blot或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。常规的检测方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗体在Western Blot上检测内源或外源表达的磷酸化蛋白。如果目标蛋白的含量较低，也可利用免疫沉淀的方法先富集发生磷酸化的酪氨酸蛋白，再检测目标蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗体也常用于检测在不同处理的条件下，细胞内总的酪氨酸磷酸化水平的变化情况，作为许多细胞生物现象的一个重要指标。 我们都知道如果需要检测某一个目标蛋白的某一特定位点的磷酸化状态，可以选用该蛋白特定位点的磷酸化特异性抗体。但由于我们研究的通常是新的磷酸化位点，或者这些蛋白特定位点的磷酸化抗体效果不够好，我们不得不自己制备磷酸化抗体。如果大家自己制备过磷酸化抗体，就会知道磷酸化抗体的制备比一般抗体的制备更加困难，而且浪费大量宝贵时间。现在国外的科学家发现可以使用通用型的磷酸化抗体，只要巧妙的设计实验，也可以达到同样的检测目的。以Yuan的文章为例，他们需要检测BCR-ABL的磷酸化，但他们没有特异性的磷酸化抗体。他们首先使用了抗c-ABL的抗体和蛋白G-琼脂糖珠子来免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通过Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗体（pan-phosphotyrosine）来鉴定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一组以Clemens 为首的科学家，则利用抗Dock蛋白抗体先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗体来检测DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通过区分这些蛋白的分子量大小，来确认相应的磷酸化条带的蛋白身份。 与做普通的Western Blot相比，磷酸化Western Blot有一些要额外需要注意的事项： 首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个免疫检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，我们在样品制备时，需要在细胞裂解液中加入足量的并且是新鲜的磷酸酶抑制剂，如

第五章 微生物的新陈代谢习题及答案

第五章微生物的新陈代谢习题及答案 一、名词解释 1.生物氧化：发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总称。 2.P/O比：每消耗1mol氧原子所产生的ATPmol数，用来定量表示呼吸链氧化磷酸化效率的高低。 3.无氧呼吸：又称厌氧呼吸，指一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物（少数为有机氧化物）的生物氧化。 4.延胡索酸呼吸：以延胡索酸作为末端的氢受体还原产生琥珀酸的无氧呼吸。 5.发酵：指在无氧等外源氢受体的条件下，底物脱氢后所产生的还原力[H]未经呼吸链传递而直接交某一内源中间代谢物接受，以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应。 6.异型乳酸发酵：凡葡萄糖经发酵后除主要产生乳酸外，还产生乙醇、乙酸和CO2等多种产物的发酵，称异型乳酸发酵。 7.Stickland 反应：以一种氨基酸作底物脱氢（即氢供体），另一种氨基酸作氢受体而实现生物氧化产能的发酵类型，称为Stickland 反应。 8.循环式光合磷酸化：可在光能驱动下通过电子的循环式传递而完成磷酸化产能的反应，是一种存在于光合细菌中的原始光合作用机制。 9.非循环式光合磷酸化：电子循环途径属非循环式的光合磷酸化反应，是各种绿色植物、藻类和蓝细菌所共有的利用光能产生ATP的磷酸化反应。 10.生物固氮：是指大气中的分子氮通过微生物固氮酶的催化而还原成氨的过程。生物界中只有原核生物才具有固氮能力。 12.反硝化作用：又称硝酸盐呼吸。是指在无氧条件下，某些兼性厌氧微生物利用硝酸盐作为呼吸链的最终氢受体，把它还原成亚硝酸、NO、N2O直至N2的过程，称为异化性硝酸盐还原作用，又称硝酸盐呼吸或反硝化作用。 13.同型酒精发酵：丙酮酸经过脱羧生成乙醛，以乙醛为氢受体生成乙醇，若发酵产物中只有乙醇一种有机物分子称为同型酒精发酵。 14.次生代谢物：指某些微生物生长到稳定期前后，以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初生代谢物作前体，通过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂的化合物。 15.细菌酒精发酵:运动发酵单胞菌等微好氧菌经ED途径形成丙酮酸脱羧成乙醛，进一步被还原成乙醇，这种经ED途径发酵生产乙醇的方法称为细菌酒精发酵。 二、问答题 （一）试述HMP途径在微生物生命活动中的重要性。