玉米CMS_C不育系及保持系差异基因的克隆与表达分析

华北农学报·2014，

29(3):11-15收稿日期：2014－03－13

基金项目：国家自然科学基金项目（30971794）作者简介：王继玥（1984－），男，四川南充人，在读博士，主要从事玉米雄性不育研究。王继玥、易洪杨为同等贡献作者。通讯作者：曹墨菊（1965－），女，河北魏县人，教授，博士，主要从事玉米雄性不育研究。

玉米CMS-C 不育系及保持系差异基因的克隆与表达分析

王继玥，易洪杨，汪生庆，曹墨菊

（四川农业大学玉米研究所，教育部作物基因资源与遗传改良重点实验室，农业部西南玉米生物学及遗传育种重点实验室，四川成都611130）

摘要：以玉米不育系C48-2及保持系N48-2为材料，利用PCＲ和ＲT-PCＲ技术克隆了嵌合orf118-b 并研究了cox2转录本的结构变化。orf118-b 是玉米C48-2线粒体基因组特有的嵌合orf ，并能在单核期花药中特异表达。cox2*

仅在N48-2单核期花药中特异表达，cox2*是cox2基因转录本GＲM ZM5G862955_T01的新注释，其5'UTＲ区域被延长。利用Ｒeal-Time qPCＲ检测了cdpk 在不育系及保持系雄穗发育的花粉母细胞时期、四分体时期、单核期和双核期的基因表达水平。结果表明，cdpk 在C48-2的母细胞时期、四分体时期、双核期上调表达，在C48-2的单核期下调表达。这些发现为进一步探索玉米CMS-C 核质互作导致花粉败育的分子机制提供参考。关键词：玉米；CMS-C ；嵌合OＲF ；差异表达中图分类号：S513．03

文献标识码：A

文章编号：1000－7091（2014）03－0011－05

Cloning and Expression Analysis of Differential Genes Between C-Type

Cytoplasmic Sterile Line and Its Maintainer Line in Maize

WANG Ji-yue ，YI Hong-yang ，WANG Sheng-qing ，CAO Mo-ju

（Maize Ｒesearch Institute ，Sichuan Agricultural University ，Key Laboratory of Crop Genetic Ｒesource and Improvement ，Ministry of Education ，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Southwest Ｒegion ，Ministry of Agriculture ，Chengdu 611130，China ）

Abstract ：orf118-b and cox2*were cloned from sterile line C48-2and it maintainer line N48-2in maize by PCＲand ＲT-PCＲ．orf118-b is a specific chimeric open reading frame in mitochondria genome of CMS-C line．cox2*was special transcript of cox2only in N48-2，based on the maize genomic database ，5'UTＲregion of the transcript was extended comparison to the existed annotation．Expression of cdpk between C-Type cytoplasmic male sterility line and maintainer line at the pollen mother cells （PMCs ）stage ，the tetrad stage ，the uninucleate stage and the bi-nuclear stage were determined using Ｒeal-Time PCＲ．The results showed that cdpk was up-regulated in C48-2at mother cell stage ，tetrad stage ，the binuclear stage ，but was down-regulated in C48-2at binuclear uninucleate stage．This results provide foundation for further explaining molecular mechanism of CMS-C in maize．

Key words ：Maize ；CMS-C ；Chimeric OＲF ；Differential expression 细胞质雄性不育（CMS ）广泛存在于多种植物

中，作为重要的种质资源，在杂种优势利用中发挥重要作用。植物CMS 分子机制一直是遗传学家和分子生物学家的研究重点。大量研究表明，植物CMS 属于功能获得性突变，花粉败育是由线粒体基因与

核基因异常互作导致的［1］

。前人已经在植物线粒

体基因组上发现了许多与CMS 相关的嵌合基因或者orf ，如玉米CMS-T 中发现的T-urf13［2］

，向日葵中

的orf522

［3］

，小麦T-CMS 中位于线粒体coxl 基因上游的orf256

［4］

，水稻WA-

CMS 胞质中特有的orfB ［5］。有学者把与CMS 相关的基因或者蛋白称为MCAG

（CMS-associated gene or protein ），尽管在许多物种

12

华北农学报29卷

中都发现了与之相关的MCAG ，但仍然很难揭示导致植物CMS 的关键机制。主要原因在于CMS 线粒体基因组上大量存在正常线粒体上没有的orf ，以及在高等植物中尚无法进行线粒体的转化，因而无法直接评估可能参与雄性不育的MCAG 的功能。最

近在水稻中发现了一个线粒体嵌合基因WA352［6］

，WA352在水稻CMS-WA 绒毡层中大量积累，抑制核

基因编码的线粒体蛋白COX11的正常功能，使绒毡层细胞过早凋亡，从而导致花粉败育。这一研究证明，线粒体基因和保守核基因之间发生异常的互作会引发线粒体功能紊乱，进而产生败育表型。

玉米CMS 一般分为S 型、T 型和C 型，与S 型、

T 型相比，C 型不育系发现较晚，其败育的分子机制也不够明确。研究表明，植物激素［7］

、同工酶［8］

、活

性氧引发的细胞程序性死亡［9］

，线粒体基因重排或

重组

［10］

、ＲNA 编辑［11］以及选择性剪接等可能与玉

米CMS 的发生有关。虽然已经对玉米正常胞质和

T 型、S 型以及C 型不育胞质的线粒体基因组进行了全基因组测序，并且在CMS-C 线粒体基因组上发现了725个orf ，但仍无法确定与CMS-C 直接相关的基因。2012年Stephane Bentolila 等［12］

利用高通量测序技术，对水稻不育胞质和正常胞质的线粒体基因组进行了全基因组测序。发现不育胞质和正常胞质的线粒体基因组上都存在大量的基因重组或重

排，揭示嵌合基因orf126可能与水稻WA-CMS 的表型相关。Igarashi K 等［13］

通过比较水稻不育系及其育性恢复系线粒体基因组差异并结合Northern Blot

技术，揭示嵌合orf113是导致水稻ＲT98-CMS 败育的关键基因。虽然水稻和玉米的败育机制有所区别，这些发现仍对玉米CMS 的研究有重要的参考价值。

笔者前期通过转录组测序发现嵌合orf118-b 在C48-2中特异表达，cox2基因的GＲM ZM5G862955_

T01转录本5'UTＲ区域被延长，编码钙依赖蛋白激酶（CDPK ）的基因在C48-2中的表达量比N48-2高几十倍。本研究对这些差异表达基因进行克隆和表达分析，以验证转录组测序结果，为进一步研究玉米CMS-C 的分子机制提供参考。

1

材料和方法

1．1

材料

玉米C 型细胞质雄性不育系C48-2及其保持系N48-2，不育系经保持系多代回交。

1．2

线粒体DNA 和花药总ＲNA 的提取

采用汪静等［14］

的方法，分别提取不育系C48-

2及其保持系N48-

2的线粒体DNA 。采用TaKaＲa 公司的ＲNAiso Plus 总ＲNA 提取试剂盒提取C48-2和N48-2花粉母细胞时期、四分体时期、单核期和双核期花药总ＲNA 。1%琼脂糖凝胶电泳检测线粒体

DNA 和花药总ＲNA 质量。1．3

cDNA 第一链合成

以C48-2和N48-2的总ＲNA 为模板，采用

TaKaＲa 公司去基因组污染的反转录试剂盒反转录合成cDNA 第一条链。1．4PCＲ和ＲT-PCＲ

将cox2基因发生5'端延伸的转录本命名为

cox2*。根据orf118-b （350bp ）和cox2*（1399bp ）转录本的序列设计特异引物，

用TaKaＲa 公司的高保真酶（PrimeSTAＲ HS DNA Polymerase ），分别以DNA 和cDNA 第一条链为模板进行PCＲ扩增。PCＲ反应体系为20μL ：DNA 或cDNA 1μL ，dNTP Mixture 1．6μL ，Forward Primer （10μmol /L ）0．4μL ，

Ｒeverse Primer （10μmol /L ）0．4μL ，Prime STAＲBuffer （Mg 2+）4μL ，

Prime STAＲHS 0．2μL ，ddH 2O 12．4μL 。反应条件：94?预变性5min ；98?变性

10s ，55?退火5s ，72?延伸30 120s ，30个循环；72?再延伸8min 。引物序列如下：

orf118-b ：F 5'-CATCGCCCTACTCATCGCTTATA-3'，Ｒ5'-TCTGAGAAGGAAGTATTGGCTATGC-3'

cox2*：F 5'-TCAAGAATGGATCAGTCTAGTCTC C-3'，Ｒ5'-ATACCCAATCCGCATAATCTTTC-3'1．5

Ｒeal-Time PCＲ

根据cdpk （钙依赖的蛋白激酶）基因CDS 区的保守序列设计荧光定量PCＲ特异性引物，以18s 和β-Actin 为双内参基因，分析花粉母细胞时期、四分体时期、单核期和双核期花药中cdpk 基因的表达模式。反应体系（20μL ）：稀释10倍cDNA 2μL ，Ｒeal Master Mix 10μL ，Forward Primer 0．5μL ，Ｒeverse Primer 0．5μL ，ddH 2O 7μL 。反应程序：95?预变

性10min ；95?20s ，60?30s ，68?5s ，44个循环。按照2

－ΔΔct

方法分析基因的相对表达量。引物

序列如下：

cdpk ：F 5'-ACCTTGGACAAAACCGTGAA-3'，Ｒ5'-GGATGCTTTCCTCCCGTCT-3'；18s ：F 5'-CTGAGA AACGGCTACCACA-3'，Ｒ5'-TCTGAGAAGGAAGTAT TGGCTATGC-3'；β-Actin ：F 5'-GTCCCTCACCCTCCC

AAAAG-3'，Ｒ5'-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3'。1．6

序列分析

PCＲ产物回收后，连接到pEASY-zero （全式金公司）载体，转化大肠杆菌，挑取3个阳性克隆送上海美吉公司测序。DNAMAN 软件进行基因以及蛋

3期王继玥等:玉米CMS-C不育系及保持系差异基因的克隆与表达分析

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白质序列间多重比对。利用SOPMA软件在线分析蛋白质二级结构类型，分子量、等电点、疏水性等理化特性。利用WoLFPSOＲT（http：//swissmodel．ex-pasy．org/workspace/）在线软件进行亚细胞定位预测。利用TMHMM Server V．2．0（http：//www．cbs．dtu．dk/services/TMHMM/）在线软件进行跨膜结构预测。

2结果与分析

2．1orf118-b的克隆及序列分析

分别以C48-2和N48-2线粒体DNA和单核期花药的cDNA为模板扩增orf118-b，结果如图1所示。可以看出，在C48-2的线粒体DNA和cDNA中能扩增出嵌合orf118-b的目的条带，而在N48-2中未检测到扩增条带，这与转录组测序的结果一致，说明orf118-b是C胞质特有的嵌合基因，且能在单核期花药中特异表达。生物信息学预测显示，其编码蛋白质为亲水性蛋白，具有5个丝氨酸磷酸化位点，2个苏氨酸和络氨酸磷酸化位点，表明丝氨酸磷酸化可能是其发挥功能的主要方式。亚细胞定位预测显示，其编码的蛋白位于细胞核的可能性较大，二级结构预测显示该蛋白含有42%的α-螺旋和43%无规则卷曲。跨膜结构预测显示，orf118-b编码的蛋白不具有跨膜结构域。

2．2cox2*的验证

为了验证cox2*存在的真实性及特异性，我们设计了cox2*转录本的特异引物cox2*F-cox2*Ｒ（图2）。上引物位于cox2基因第一外显子5'端的基因间区，下引物位于cox2基因第二外显子区。以C48-2和N48-2线粒体DNA为模板，均能扩增出目的条带。说明在DNA水平，C48-2和N48-2的cox2基因不存在差异。而以C48-2和N48-2单核期花药的cDNA为模板，只能在N48-2中扩增出条带，C48-2中未能扩增出条带。说明C48-2中不表达cox2基因延长的转录本cox2*。

序列分析发现，与玉米基因组数据库现有cox2基因转录本GＲM ZM5G862955_T01的注释相比，在N48-2单核期花药中特异表达的延长转录本cox2*比cox2基因转录本T01向5'上游延长了55bp，即在正常胞质中获取了cox2基因转录本的新注释（图2）。通过对比N48-2中cox2的DNA和cDNA序列发现了22处ＲNA编辑位点，都是C-U的转换，其中2处共编辑位点，与前人研究结果吻合。跨膜结构预测显示cox2*编码的蛋白具有3个跨膜结构域。

图1PCＲ和ＲT-PCＲ电泳图

Fig．1The PCＲandＲT-PCＲamplification of orf118and cox2

*

A．5'端延长序列；B．第一外显子；C．内含子；D．第二外显子。A．Extended sequence in5'end；B．The first exon；C．Intron；D．The second exon．图2cox2*的引物设计和转录示意图

Fig．2Schematic diagram of primer design

and transcription of cox2*

2．3cdpk基因表达模式分析

通过实时荧光定量PCＲ检测了C48-2和N48-2花药中cdpk基因在花粉母细胞时期、四分体时期、单核期和双核期的表达水平。由图3可知，相对于N48-2，cdpk在C48-2的花粉母细胞时期、四分体时期、双核期上调表达，双核期的表达差异最明显，C48-2中的表达量比N48-2高20多倍，与转录组测序结果相吻合。单核期，cdpk在C48-2中的表达量略低于N48-2，但差异不明显。CDPK（钙依赖蛋白激酶）主要参与非生物胁迫的信号转导过程。cdpk 基因在C48-2

小孢子花粉母细胞时期和四分体时期

图3花粉母细胞时期、四分体时期、单核期和

双核期花药中cdpk基因的表达情况

Fig．3Gene expression analysis of cdpk during the

pollen mother cells（PMCs）stage，the tetrad stage，the uninucleate stage and the binuclear stage

14

华北农学报29卷

上调表达，可能促进钙离子在细胞内的积累，从而释放更多活性氧（ＲOS ）以及其他凋亡因子，从而诱导细胞过早凋亡。败育后由于大量凋亡因子释放，从

而促进双核期cdpk 基因在C48-

2中大量表达。3讨论

植物细胞质雄性不育是线粒体基因组与核基因

组间不协调所导致的［6］

。因此，研究线粒体嵌合基

因与核基因间的差异表达对于揭示核质互作的分子

机制十分重要。本研究发现嵌合orf118-b 是C48-2线粒体基因组特有的，其编码的蛋白不具有跨膜结

构域，与已知CMS 相关嵌合orf 的典型特征不吻合

［15］

。目前已在多种植物线粒体基因组上发现了

与植物CMS 相关的嵌合orf 。这些嵌合orf s 是CMS 线粒体基因组特有的，通过基因重组产生，通常与线粒体呼吸链相关基因嵌合，多位于线粒体呼吸链相关基因侧翼区，与其共转录，其推定的蛋白产物大多具有天然疏水性和跨膜结构域

［16］

。但有的CMS-

orf s 并不具有这些特征，而一些具有这些特征的orf 却与CMS 无关，因此很难根据核酸序列来判断与CMS 相关的线粒体基因。嵌合orf118-b 与玉米C 胞质花粉败育的关系还有待于进一步研究。

本研究发现cox2基因5'端延长转录本cox2*

只在保持系单核期花药中表达，不育系cox2基因的转录本未发生变化。N48-2中cox2*转录本的5'UTＲ区域向基因间区延长了55bp ，因此获得了cox2基因转录本的新注释。研究表明，

mＲNA 的5'末端对外显子具有调控作用［17］

。UTＲ不仅调控mＲNA 的体内稳定性及降解速率，控制其利用效率，协助辨认特殊密码子，而且还决定mＲNA 的翻译位点及控制其翻译效率。前人研究表明，玉米不育系C48-2中cox2的编辑频率明显低于其保持系［14］。cox2基因编辑率降低可能会影响翻译效率，从而产生不完整或者缺陷的COX2蛋白，最终导致花粉败育。但cox2基因编辑频率降低是否与cox2基因5'末端UTＲ结构差异有关尚待进一步研究。

本研究显示，

cdpk 基因在C48-2和N48-2小孢子发育过程中的表达水平存在差异，尤其双核期的差异十分明显，验证了前期转录组测序的结果。CDPK 作为植物细胞内胞质Ca 2+的受体，在植物Ca 2+

信号转导过程发挥重要功能。CDPK 通过识别

细胞内Ca

2+

浓度的变化，并进一步使信号级联放

大

［18］

。CDPK 通过调控信号转导过程中下游基因

的表达从而影响植物生长、发育和抗胁迫响应等多

种代谢活动［19］

。研究表明在玉米花粉发育晚期，抑

制花粉管中的cdpk 基因的表达会导致花粉萌发和

花粉管延伸受阻［18］。Gyeong 等［20］

的研究表明在矮牵牛花粉发育过程中，过量表达CDPKl 会影响花粉管的生长极性，过量表达CDPK2会抑制花粉管的延伸。这些研究证明，cdpk 基因参与花发育过程的调控，其异常表达会影响花的正常发育。花发育涉及

多种代谢途径，某一个或者多个代谢途径的异常都会影响小孢子的正常发育，从而影响雄性配子的形成。C48-2和N48-2线粒体基因结构与核基因表达的差异，反映出核质互作不协调。因此，有必要对这些差异基因进行深入研究以揭示核质互作的关键机制。参考文献：

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红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

基因的克隆、表达载体构建与功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，

移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.wendangku.net/doc/b36192215.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.wendangku.net/doc/b36192215.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.wendangku.net/doc/b36192215.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.wendangku.net/doc/b36192215.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.wendangku.net/doc/b36192215.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发

基因克隆和表达

Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/b36192215.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006

gfp基因的克隆与表达

基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L

目的基因的克隆与及表达

分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定

(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)

第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中

目的基因的克隆表达

目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照， 不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环

（6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2）在微波炉中打化，每20s摇一下 （3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记