水稻抽穗期基因的精细定位、克隆和生物学功能分析

　万方数据

　万方数据

　万方数据

　万方数据

郑康乐：水稻抽穗期基因的精细定位、克隆和生物学功能分析

５ＱＴＬ的克隆和生物学功能分析

精细定位为应用图位克隆法克隆基因奠定了良

好的基础，水稻中第一个被克隆的抽穗期ＱＴＬ是Ｈ棚［１３｜。

将９０００多株ＢＣ３Ｆ３植株种植在自然长日条件下，选出１５０５个极端早熟的植株，它们在Ｈ以上为Ｋａｓａｌａｔｈ等位基因纯合，应用Ｈ棚两侧的标记Ｒ１６９７和Ｐ１３０，发现有９株在Ｒ１６７９和Ｈ棚之间发生重组，２株在Ｐ１３０和Ｈ棚间重组，在Ｒ１６７９和Ｐ１３０之间又建立了３个标记，将Ｈ扰定位于￥２０４８１和Ｐ１３０之间，与￥２５３９共分离，￥２０４８１与Ｈ棚发生重组的植株只有１株。以这３个标记筛选日本晴基因组ＹＡＣ（ｙｅａｓｔａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）和ＰＡＣ（Ｐｉ－ｄｅｒｉｖｅｄａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）克隆，找到一个包含这３个标记而且又是最短的ＰＡＣ克隆，经测序，在￥２０４８１和Ｐ１３０之间又发展了９个标记，根据标记间的重组，将Ｈ棚界定于１２ｋｂ的区域

内。应用Ｇｅｎｓｃａｎ分析候选基因组序列，预测到两个假定的基因，一个与拟南芥ＣＯＮＳｍＮＳ（ＣＯ）基因相似，以日本晴基因组只含有Ｃ０基因的７．１ｋｂ片段转化ＮＩＬ（Ｈ棚／Ｈ出），该近等基因系内Ｈ棚和Ｈｄ２上均为Ｋａｓａｌａｔｈ等位基因，对光周期不敏感，而部分转化植株对光周期敏感，对一个在短日照早熟的只含单拷贝的转基因植株的自交后代进行分析，在短日照转基因纯合或杂合植株的抽穗期比不含转基因的植株要早，说明７．１ｋｂ基因组区域内的Ｈ棚序列具有光周期反应的功能［１３］。

水稻Ｈ棚基因含两个外显子，编码一个３９５个氨基酸的蛋白，是拟南芥带有锌指结构域的ＣＯ家族中的一员，Ｈ棚上日本晴和“Ｋａｓａｌａｔｈ等位基因之间有许多结构上的不同，Ｋａｓａｌａｔｈ等位基因第二个外显子有一个２ｂｐ的缺失，产生一个提前的终止子，Ｋａｓａｌａｔｈ的Ｈｄｌ蛋白就缺少Ｃ末段区域而短于日本晴的蛋白。Ｈｄｌ可能具有双重功能，在短日照促进抽穗和在长日照抑制抽穗。由于锌指结构的存在，Ｈ棚会与转录活性有关，但由于Ｈ棚本身的转录并不受１３长的影响，推测转录受它影响的基因的表达受光周期变化的控制Ｅ１３ｆ。

接着，通过大分离群体进行高分辨力精细定位和构建目的基因区域的克隆重叠群，Ｈ始和Ｈｄ３ａ也先后被克隆［１４，１５］。Ｈ彩编码蛋白激酶ＣＫ２的ａ亚基（ＣＫ２ａ），在编码区内，日本晴和Ｋａｓａｌａｔｈ的等位基因只有一个核苷酸的替换，在日本晴是一个提前的终止子（ＴＡＧ），在Ｋａｓａｌａｔｈ是一个赖氨酸编码子（ＡＡＧ），Ｋａｓａｌａｔｈ的等位基因编码一个具有功能的ＣＫ２ａ，而日本晴的等位基因可以看作是一个自然发生的Ｈ彩座位上的ＣＫ２ａ无效突变体。遗传互补试验将含ＣＫ２ａ基因的Ｋａｓａｌａｔｈ基因组片段导入日本晴，转基因植株自交后代在自然长日出现早、迟抽穗的分离，早抽穗的与日本晴相同，迟抽穗的与ＮＩＬ（Ｈｄ６）相同［１４｜。

Ｈｄ３ａ为一个与拟南芥中促进开花的ＦＬＯＶ弘ＥＲＩＮＧＬＯＣＵＳＴ（ＦＴ）基因高度相似的基因，该基因在植株从长日照转变为短日照时诱导表达，互补试验表明，低拷贝转基因植株自交后代的抽穗期出现分离，含转基因（包括Ｋａｓａｌａｔｈ等位基因和日本晴等位基因）的植株比不含转基因的植株早抽穗，含Ｋａｓａｌａｔｈ等位基因的转基因植株比含日本晴等位基因的植株更早。根据表达分析，在短日条件下，Ｋａｓａｌａｔｈ等位基因表达的ｍＲＮＡ比日本晴等位基因表达要早，表达水平也较高；将反义的Ｈｄ３ａ的Ｋａｓａｉａｔｈ等位基因导入ＮＩＬ（Ｈｄ３ａ），Ｈｄ３ａ转录本的水平下降，抽穗推迟，说明Ｈｄ３ａ转录本的水平影响抽穗期。Ｋａｓａｌａｔｈ和日本晴等位基因在编码区内有一个单碱基同义替换和一个２碱基替换，引起该蛋白羧基端的氨基酸改变，在日本晴是脯氨酸，在Ｋａｓａｌａｔｈ是天门冬氨酸编码子。但这两种等位基因均具有功能Ｅ１５］。将Ｈｄ３ａ的Ｋａｓａｌａｔｈ等位基因转入拟南芥，能促进开花，与过量表达ＦＴ基因的拟南芥相似，进一步说明Ｈｄ３ａ与Ｆ丁的同源性；在拟南芥中，ＦＴ在Ｃ０下游起作用，是ＣＯ的直接目标，Ｈ棚是ＣＯ的同源基因，在ＮＩＬ（Ｈｄ／）中，Ｈ棚上的Ｋａｓａｌａｔｈ等位基因的产物由于缺失Ｃ末端而丧失功能，ＮＩＬ（Ｈ棚）的抽穗期迟于日本晴，经检测，ＮＩＬ（Ｈ棚）中Ｈｄ３ａ的表达水平下降，表明Ｈ扰的功能性等位基因能上调Ｈｄ３ａ的ｍＲＮＡ，也就是说，Ｈｄ３ａ促进抽穗是受控于Ｈｄｌ，在调节水稻抽穗期的遗传网络中，Ｈｄ３ａ在Ｈｄｌ的下游起作用［１５］。在拟南芥中，ＣＯ和ＦＴ转录本水平随昼夜节律而变化，在水稻中，Ｈ棚和Ｈｄ３ａ的转录本水平也随昼夜节律而变化，说明Ｈ棚和Ｃ０、Ｈｄ３ａ和ＦＴ分别为同源基因，但Ｈ棚和Ｈｄ３ａ在短日被诱导，而Ｃ０和ＦＴ在长日被诱导，但它们的功能及调节关系在短日照植物水稻和长日照植物拟南芥中得到保留。６结语

近年来的多数研究中，在单个群体内能检测到

　万方数据

９０

某个数量性状的ＱＴＩ。的数目总是很有限的［２Ｉ。本文描述水稻抽穗期ＱＴＬ定位，应用相同亲本不同类型不同世代的多个群体，共检测到１５个ＱＴＬ（Ｈ棚～Ｈｄ３ａ，Ｈｄ３ｂ～Ｈｄｌ４）［９Ｊ，说明自然的变异是水稻复杂性状遗传分析的有效资源；经精细定位，已将Ｈ棚、Ｈ毖、Ｈｄ３ａ、Ｈｄ３ｂ、Ｈｄ４、Ｈｄ５、Ｈｄ６和Ｈｄ９确定为单个孟德尔因子，根据ＱＴＬ－ＮＩＬ的光周期反应以及这些座位间上位性互作的研究，明确了Ｈｄｌ、Ｈ彪、Ｈｄ３ａ、Ｈｄ３ｂ、Ｈ撕和Ｈｄ６的生物学功能，即与水稻光周期敏感性有关；应用图位法，克隆了其中３个ＱＴＬ，研究了它们的表达和调控，并与拟南芥的同源基因进行比较，初步揭示短日照植物开花遗传控制的机理。

有证据表明，ＱＴＩ。与主效基因可以看作是同一座位上的不同等位基因［１６］。ＱＴＬ的特点就是多个基因决定同一性状，ＱＴＩ。研究的困难就在分解多个基因。对同一性状作贡献的ＱＴＬ越多，单个ＱＴＬ就越难区别。基因组研究，与经典遗传学研究一样，依靠的是变异。在进行基因精细定位、克隆和功能分析的时候，必须将材料中的变异由繁而简，即保持目的基因座位上的变异，整个基因组背景尽量一致，以避免基因组其他变异产生的干扰；另一方面，在进行基因精细定位时，目的基因所在基因组区域的分子标记则应由简而繁，即发展大量标记，将目的基因定位在尽可能小的区间，通过标记辅助选择可以得到比较精确的近等基因系，这些近等基因系在ＱＴＬ研究中的重要作用，在本文中得到了充分的体现。

对于水稻各种性状的ＱＴＬ定位，国内外均有综述［２，１７］，这些文章大多数是通过不同实验室应用不同群体对相同性状ＱＴＬ定位结果进行比较和深入的分析，以提高下一步研究的水平。本文写的是一个研究小组应用同一对亲本衍生的材料，对水稻抽穗期ＱＴＬ进行的系统而深入的研究。水稻抽穗期是一个数量性状，该课题组在水稻材料上下功夫，采用与研究主效基因相同的策略，所得结果完全达到主效基因研究的水平，这样的ＱＴＬ研究是很成功的。借助这样的思路，结合功能基因组学的最新进展，水稻其他数量性状以及其他作物数量性状的遗传学研究，有望新的突破。

参考文献：

１ＡｈｎＳＮ，ＢｏｌｉｃｈＣＮ，ＭｃＣｌｕｎｇＡＭ，ｅｔａ１．ＲＦＬＰａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｏｍｉｃｒｅｇｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｏｋｅｄ－ｋｅｒｎｅｌｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｉｎｒｉｃｅ．中国水稻科学（ＣｈｉｎｅｓｅＪＲｉｃｅＳｃｉ）第１９卷第１期（２００５年１月）

ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，１９９３，８７：２７—３２．

２ＸｕＹＢ．ＧｌｏｂａｌｖｉｅｗｏｆＱＴＬ：Ｒｉｃｅａｓａｍｏｄｅｌ．／ｎ：ＫａｎｇＭＳ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＧｅｎｏｍｉｅｓａｎｄＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ．０ｘｆｏｒｄＳｈｉｒｅ：ＣＡＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００２．１０９—１３４．

３ＹａｎｏＭ．ＨａｒｕｓｈｉｍａＹ，ＮａｇａｍｕｒａＹ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｈｅａｄｉｎｇｄａｔｅ

ｉｎｒｉｃｅ

ｕｓｉｎｇａｈｉｇｈ—ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｎｋａｇｅｍａｐ．ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，１９９７，９５：１０２５—１０３２．４ＬｉｎＳＹ，ＳａｓａｋｉＴ，ＹａｎｏＭ．Ｍａｐｐｉｎｇｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉｃｏｎ—ｔｒｏｌｌｉｎｇｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙａｎｄｈｅａｄｉｎｇｄａｔｅｉｎｒｉｃｅ，ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．，ｕｓｉｎｇｂａｃｋｃｒｏｓｓｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓ．ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，１９９８，９６：９９７—１００３．

５ＹａｎｏＭ，ＫｏｊｉｍａＳ，ＴａｋａｈａｓｈｉＹ，ｅｔａ１．Ｇｅｎｅｔｉｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｆｌｏｗ—ｅｒｉｎｇ

ｔｉｍｅｉｎｒｉｃｅ，ａｓｈｏｒｔｄａｙｐｌａｎｔ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２７：１４２５—１４２９．

６ＹａｍａｍｏｔｏＴ．ＬｉｎＨＸ，ＳａｓａｋｉＴ，甜ａ１．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｅａｄｉｎｇｄａｔｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌＯＣＵＳＨｄ６ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｅｐｉ—ｓｔａｔｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈＨｄ２ｉｎｒｉｃｅｕｓｉｎｇａｄｖａｎｃｅｄｂａｃｋｃｒｏｓｓｐｒｏｇｅｎｙ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，１５４：８８５—８９１Ｉ

７ＬｉｎＨＸ，ＡｓｈｉｋａｒｉＭ，ＹａｍａｎｏｕｃｈｉＵ，ｅｔａＺ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ。Ｈｄ９，ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｈｅａｄｉｎｇｄａｔｅｉｎｒｉｃｅ．ＢｒｅｅｄｉｎｇＳｃｉ，２００２，５２：３５—４１．８ＹａｍａｍｏｔｏＴ，ＫｕｂｏｋｉＹ，ＬｉｎＳＹ，ｅｔａ１．Ｆｉｎｅｍａｐｐｉｎｇｏｆｑｕａｎ—ｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔ１０ｃｉＨ击ｌ，Ｈ毋２ａｎｄＨ小３，ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｈｅａｄｉｎｇｄａｔｅｏｆｒｉｃｅ，ａｓｓｉｎｇｌｅＭｅｎｄｅｌｉａｎｆａｃｔｏｒｓ．ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，１９９８，９７：３７—４４．

９ＬｉｎＨ，ＬｉａｎｇＺ，ＳａｓａｋｉＴ，ｅｔａ１．Ｆｉｎｅｍａｐｐｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ—ｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉＨｄ４ａｎｄＨｄ５ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｈｅａｄｉｎｇｄａｔｅｉｎｒｉｃｅ．ＢｒｅｅｄｉｎｇＳｃｉ，２００３，５３：５１—５９．

１０ＬｉｎＨＸ，ＹａｍａｍｏｔｏＴ，ＳａｓａｋｉＴ，ｅｔａ１．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉＯｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅｐｉｓｔａｔｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｒｅｅＱＴＬｓ，Ｈｄ／，Ｈ韶ａｎｄＨｄ３，ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｈｅａｄｉｎｇｄａｔｅｉｎｒｉｃｅｕｓｉｎｇｎｅａｒｌｙｉｓｏｇｅｎｉｅｌｉｎｅｓ．ＴｈｃｏｙＡＰｐｌＧｅｎｅｔ，２０００，１０１：１０２１—１０２８．

１１ＴａｋｅｕｃｈｉＹ，ＬｉｎＳＹ，ＳａｓａｋｉＴ，ｅｔａ１．Ｆｉｎｅｌｉｎｋａｇｅｍａｐｐｉｎｇｅｎ—ａｂｌｅｓｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｏｆｃｌｏｓｅｌｙｌｉｎｋｅｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｅｉｆｏｒｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙａｎｄｈｅａｄｉｎｇｉｎｒｉｃｅ．ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，２００３，１０７Ｉ１１７４—１１８０．

１２ＭｏｎｎａＬ，ＬｉｎＨＸ，ＫｏｊｉｍａＳ，ｄａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｏｆａｇｅ—ｎｏｍｉｃｒｅｇｉｏｎｆｏｒａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ，Ｈ刃，ｉｎｔｏｔｗｏｌｏｃｉ，Ｈｄ３ａａｎｄＨｄ３６，ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｈｅａｄｉｎｇｄａｔｅｉｎｒｉｃｅ．ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，２００２，１０４：７７２—７７８．

１３ＹａｎｏＭ，ＫａｔａｙｏｓｅＹ，ＡｓｈｉｋａｒｉＭ，ｅｔａ１．Ｈ棚，ａｍａｊｏｒｐｈｏｔｏ—ｐｅｒｉｏｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓｉｎｒｉｃｅ，ｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｆｌｏｗｅｒｉｎｇ

ｔｉｍｅ

ｇｅｎｅＣＯＮＳＴＡＮＳ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０００，１２：２４７３—２４８３．

１４ＴａｋａｈａｓｈｉＹ，ＳｈｏｍｕｒａＡ，ＳａｓａｋｉＴ，ｄａ１．Ｈｄ６，ａｒｉｃｅｑｕａｎｔｉ—ｔａｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｅｎｃｏｄｅｓｔｈｅａｓｕｂｕｎｉｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣＫ２．ＰＮＡＳ，２００１，９８：７９２２—７９２７．１５ＫｏｊｉｍａＳ，ＴａｋａｈａｓｈｉＹ，ＫｏｂａｙａｓｈｉＹ，ｅｔａ１．Ｈｄ３ａ，ａｒｉｃｅｏｒ—ｔｈｏｌｏｇｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＦＴｇｅｎｅ，ｐｒｏｍｏｔｅｓｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｔｏｆｌｏｗ—ｅｒｉｎｇ

ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｏｆＨ棚ｕｎｄｅｒｓｈｏｒｔｄａｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏＺ，２００２，４３：１０９６—１１０５．

１６ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＤＳ．ＡｐｏｓｓｉｂｌｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｎｇｇｅｎｉｃＤＮＡｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｓｉｎｐｌａｎｔｓ．ＪＴｈｅｏｒＢｉｏｌｔ１９８５，１１７ｔ１—１０．１７毛传澡，程式华．水稻农艺性状ＱＴＬ定位精确性及其影响因素的分析．农业生物技术学报，１９９９，７（４）ｔ３８６—３９３．

　万方数据

【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析

（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多

控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸

整个基因克隆实验流程完整

一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。

水稻基因组学的的研究进展

基因组学课程论文 所在学院生命科学技术学院 专业14级生物技术（植物方向） 姓名金祥栋 学号2014193012

水稻基因组学的研究进展 摘要：随着模式植物——拟南芥和水稻基因组测序的完成，近年来关于植物基因组学的研究越来越多。水稻是世界上重要的粮食作物之一，养活着全世界近一半的人口。同时南于水稻基冈组较小、易于转化及与其他禾本科植物基因组的同线性和共线性等特点，一直被作为禾本科植物基因组研究的模式作物。水稻基因组测序的完成及种质资源的基因组重测序，为水稻功能基因组研究奠定了基础。现综述我国水稻基因组测序和功能基因组研究历史，重点介绍了近年来在水稻基因组序列分析中获得的几项最新的研究结果。 关键词：水稻；基因组测序；功能基因组；研究历史；基因组学；研究进展 The recent progress in rice genomics research Abstract: With the completion of genome sequencing ofthe model plant-- Arabidopsis and rice，more and more researches on plant genomics emerge in recent years. Rice i s one of the most important crops in the world, raised nearly half of the world popul ation. At the same time in south rice Keegan group is smaller, with linear and linear features such as easy transformation and other gramineous plant genome, has been use d as a model crop for plant genome research of Gramineae. Genome sequencing and germplasm resources the rice genome sequencing completed laid the foundation for ric e functional genomics research. This article reviews the history and function of our ge nome sequencing of rice genome research, introduces several latest research results in recent years in the analysis of rice genome sequences. 前言 基因组是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念，是研究生物基因结构与功能的学科，是在遗传学的基础上发展起来的一门现代生物技术前沿科学，也是现代分子生物学和遗传工程技术所必要学科，是当今生物学研究领域最热门、最有生命力、发展最快的前沿科学之一。基因组学的主要任务是研究探索生物基因结构与功能，生物遗传和物理图谱构建，建立和发展生物信息技术，为生物遗传改良及遗传病的防治提供相关技术依据。 进入21 世纪，随着全球化、市场化农业产业发展和全球贸易一体化格局的逐步形成，我国种业正面临前所未有的严峻挑战，主要表现在：依靠传统育种技术难以大幅度提高粮食单产；土地资源短缺，农业环境污染日益突出；种质资源发掘、基因组育种技术亟需创新等。水稻不仅是重要的粮食作物，由于其基因组较小且与其他禾本科作物基因组存在共线性，以及具有成熟高效的遗传转化体系，已成为作物功能基因组研究的模式植物。因此，水稻基因组研究对发展现代农作物育种技术、提升种业国际竞争力和保障粮食有效供给具有重大战略意义。 基因组研究主要包括三个层次:①结构基因组学，以全序列测序为目标，构建高分辨率的以染色体重组交换为基础的遗传图谱和以DNA 的核苷酸序列为基础的物理图谱。②功能

基因克隆步骤

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]

1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。

一个水稻不育突变体基因的初步定位

一个水稻不育突变体基因的初步定位 发表时间：2018-06-22T14:45:55.647Z 来源：《知识-力量》2018年6月上作者：金永浩[导读] G537是从籼稻品种中恢8015经γ射线辐照诱变后代群体中获得的一个雄性不育突变体。本论文以该突变体及其野生型品种中恢8015为材料，比较分析了该突变体的性状表型特征和花粉育性；以该突变体与广亲和粳稻品种02428杂交配置G537/02428 F2群体，运用 SSR、InDel等分子标记进行基因定位[1]。（长春科技学院，吉林长春 130600） 摘要：G537是从籼稻品种中恢8015经γ射线辐照诱变后代群体中获得的一个雄性不育突变体。本论文以该突变体及其野生型品种中恢8015为材料，比较分析了该突变体的性状表型特征和花粉育性；以该突变体与广亲和粳稻品种02428杂交配置G537/02428 F2群体，运用 SSR、InDel等分子标记进行基因定位[1]。结果表明突变体与野生型表型相比表现出株高降低，突变体的穗颈包颈，且穗长加长，叶子色彩加深，还有结实率下降的现象。突变体的花药较为瘦小、没有开裂的现象，从外表上看是黄白色，花药中的花粉不能正常发育，这种不育要属于普通雄性不育型。这个基金在3号染色体的RM3646与RM3204中间，其间距为7Mb。关键词：水稻；籼稻；雄性不育；突变体；基因定位 1 材料与方法 1.1 试验材料 从籼稻品种中恢8015经过Co60γ射线辐照诱变M1 代群体中获得的一个雄性半不育突变体G537，经过连续多代自交后获得的稳定雄性半不育突变体G537；但是某些野生品种中恢8015；而后以G537为父本，使其与广亲以及粳稻品种02428进行配置杂交组合，从而衍生得到F2定位群体。 1.2 试验方法 1.2.1 材料的种植 本实验在2016年12月-2017年4月和2017年5月 -9月分别于海南陵水县的水稻试验田和杭州的中国水稻试验田来进行了实验。第一代在11月23号进行种植，在12月20日进行移栽。第二代在杭州种植，5月20日开始种植，于6月15日进行移栽，在移栽之后每行都种了12颗植株，这些植株的肥水管理和一般大田一样。F1种植306株，在种子收获后，再进行播种，得到第二代单株个体。并观察第二代的突变体G357以及中恢8015在外观和性状上的差异。2.2.2 突变体的表型与花粉育性观察取同一时期G537突变体和野生型中恢8015，比较测定突变体与野生型中恢8015的株高、穗颈包颈情况、穗子长短、叶色深浅、颖壳颜色、结实率。 在水稻花药成熟即将开花时，分别从野生型中恢的8015与突变体G537的单株上取穗上的部位相同的花，随后将其置入配好的乙醇和冰乙酸的混合液中，将其置于4°C的环境下保存。在镜检时一般使用I2-KI溶液来进行染色。在染色之后用显微镜来观察，观察花粉的形态和颜色的变化，从而得到可育的划分，和败育的原因和类型。从外观上看，染色深或是染色不彻底的为可育的单株。与其相对应的染色浅或者是染色形状较为不规则的是败育的单株。整个实验过程中，花粉粒总数应该足够大，在其中取平均值则能代表了单株的花粉特性。 1.2.3 DNA的提取 将试验材料于插秧后20天，取单株主茎叶片，采用改良的CTAB法 (Mμrray andThompson,1980)快速提取水稻总DNA，具体提取方法如下： (1)称量0.1g嫩叶并将其置入2ml离心管中，而后加入2×CTAB的缓冲液900μL，再用无菌棒搅拌叶片，快速捣碎； (2)将离心管中的液体在65℃的环境下进行水浴30min后取出，而后滴入体积相同的氯仿或是异戊醇的混合液，将混合液搅拌，混匀约10分钟； (3)完成上述操作后，放到-4℃的环境下进行离心处理，在8000-12000rpm离心操作10min； (4)取实验中的上清液移动至另一个1.5ml 新的离心管内，加入同样体积的且经过处理的异丙醇，而后将离心管轻柔混匀约5min； (5)在-4℃的环境下离心，10000rpm离心操作10min； (6)之后将液体倒入废弃池中，先用70％浓度的乙醇清洗一遍，再用95％浓度的乙醇再次清洗； (7)等到风干后，加入已灭菌的1×TE溶液对液体进行稀释， (8)置于-20℃的环境下中保存备用。 1.2.4 分子标记的选择和开发 分子标记的选择与开发：根据相关网站https://www.wendangku.net/doc/bf6695671.html,以及分子技术的网站https://www.wendangku.net/doc/bf6695671.html,提供的水稻的基因序列，并将其与籼稻进行基因序列的信息比较，进而找出串联或是重复，或是大部分相似的序列。之后用Primer来设计引物。而后用引物来检测两个杂交的父本，从而可以有效的筛选出引物来发掘群体中的隐性的单株。 1.2.5 引物筛选与PCR扩增及PCR产物检测 573条的反应引物是由https://www.wendangku.net/doc/bf6695671.html,网站上提供的序列，而后委托北京奥克鼎盛公司合成，使得这些引物分布在12条水稻染色体的两端，在这些染色体上来对引物进行甄别。 (1)关于PCR技术，它的基本反应应该在S1000型PCR仪上全程操作，在PCR反应体系中包含：模板DNA、10×PCR bμffer 1μl、Primer(20μM) 0.05μl、和dNTP 0.8μl (北京TIANGEN生物公司)、Taq酶：0.15μl，ddH2O 6μl 。 (2)PCR的反应过程应该是：首先咋94°C的高温下来进行预变性处理，约为5分子，之后在同样的环境下进行正式变性，持续30秒，而后在退火30秒，等温度降低到72°C时再延伸30秒，最后延伸7分钟。 扩增的产物用6％聚丙烯酰胺凝胶处理，使用 6μl与1μl的样品缓冲液来做混合处理并搅拌均匀，其中电泳缓冲液为1×TBE,120V恒压电泳1.5h，经0.05%的AgNO3溶液染色15分钟、显色后进行特异性检测。 1.2.6 基因的初步定位

基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.wendangku.net/doc/bf6695671.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；

水稻基因组进化的研究进展

水稻基因组进化的研究进展 水稻是世界上重要的粮食作物之一，养活着全世界近一半的人口。同时南于水稻基冈组较小、易于转化及与其他禾本科植物基因组的同线性和共线性等特点，一直被作为禾本科植物基因组研究的模式作物。水稻是第一个被全基因组测序的作物，目前栽培稻2个亚种全基因组测序工作已经完成：粳稻品种日本晴(Nipponbare)通过全基因组鸟枪法和逐步克隆法被测序，籼稻品种扬稻6号(9311)通过全基因组鸟枪法被测序。除核基因组外，水稻叶绿体和线粒体基因组也于1989年和2002年分别被测序。水稻2个亚种的全基因组测序完成，一方面开启了植物比较基因组学的大门，另一方面为人们在基冈组水平上鉴定出所有水稻基因并分析其功能奠定了基础，同时也使得人们对植物进化的认识，尤其是对禾本科植物进化的了解，逐步从系统分类和分子标记水平进入到了基因组序列水平。许多研究者通过对水稻基因组序列的分析，利用生物信息学工具，对水稻在基因组水平上的进化进行了大量研究。 1 水稻及其他禾本科植物基因组的古多倍体化过程 水稻是典型的二倍体植物，其核基因组中共有12条染色体。在水稻基因组被完整测序之前，人们就已经采用分子标记、DNA重复元件等方法探究水稻基因组的古多倍体化(polyploidization)过程，并发现了一些重复的染色体片段。随着水稻基因组测序计划的完成，越来越多的证据表明水稻基因组曾发生过全基因组复制(whole genome duplication)，即古多倍体化过程。 Golf等利用鸟枪法完成了粳稻品种日本晴全基因组的测序工作，并利用同义替换率分布方法(Ks- based age distribution)提出水稻基因组可能发生过一次全基因组复制过程。此后多家研究机构和一些研究者对水稻基因组中的重复片段进行了研究，虽然得出的结论不尽相同，但均发现水稻基因组中存在大量的重复片段。根据所采用方法和参数的不同，这些重复片段占整个水稻基因组的15％～62％。Yu 等在水稻基因组中发现了18对大的重复片段，大约占整个基因组的65．7％。其中17对重复片段形成的时间很相近，发生在禾本科物种分化之前；最近的一次片段复制事件发生在水稻11和12号染色体之间，在禾本科物种分化之后。 水稻基因组被测序之后，许多科研机构对基因组数据进行了详尽的注释。其中应用比较广泛的是美国基因组研究院(the institute for genome research，TIGR)和日本农业生物科学研究所(national in- stitute of agrobiological sciences，NIAS)的水稻基因组注释信息。TIGR根据其注释的结果和基因相似性矩阵(gene homology matrix，GHM)方法，检测到大量染色体间的重复片段，这些重复片段几乎覆盖了整个水稻基因组。TIGR水稻基因组注释数据库从第4版开始便增加了对片段重复的注释，该分析是利用DAGChainer程序进行的，重复片段采用100 kb和500 kb 2种参数模型进行了染色体片段的基因共线性分析(图1)，这是全基因组复制的有力证据。根据复制片段上同源基因的分子进化分析，估计全基因组复制发生在大约7 000万年前，在禾本科物种分化之前。此外，Zhang等利用TIGR更新的数据进行分析，采用同义替换率分布方法检测到另一次更古老的(单、双子叶植物分化前)基因组复制事件，说明水稻基因组至少经历了2次全基因组复制过程。 全基因组复制或多倍体化是植物尤其是禾本科作物物种形成和进化过程中非常重要的事件，大部分开花植物在进化过程中均经历了多倍体化过程。基因组加倍后，再经历所谓的二倍体化过程(diploidization)，进化成当代的二倍体物种，并造成大量重复片段中基因的重排和丢失。Salse等研究发现基因组复制事件对禾本科植物的物种形成和演变具有重要作用。他们认为禾本科植物的祖先物种是一个基因组内包含5条染色体的物种，在进化过程中，首先在距今5 000～7 000万年前经基因组复制产生了10条染色体；此后，在基因组内发生了2次染色体置换和融合而形成了12条中间态染色体。以这12条中间态染色体为基础，逐渐分化出水稻、小麦、玉米和高粱的基因组，其中水稻基因组保留了原有的12条中间态染色体，而小麦、玉米和高粱均又发生了染色体丢失和融合才形成了现有的基因组。水稻全基因组复制片段是至今为止在动、植物基因组中发现的最为清晰、完整的基因组复制的遗迹。水稻之所以保存这么完整，一方面是水稻基因组保持了12条中间态染色体的基本形态，另一方面可能与水稻基因组相对较稳定有关。 2水稻籼粳2个亚种的分化 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在其11 500多年的栽培历史中，因适应不同的农业生态环境而产生了丰富的遗传多样性和明显的遗传分化。长期以来，基于形态性状、同工酶以及对一些化合物不同反应的研究，把亚洲栽培稻(Oryza sativa L．)分为籼稻(indica)和粳稻(japonica)2个亚种。其中籼亚种耐湿耐热，主要适应于热带和亚热带等低纬度地区，而粳亚种则耐寒耐弱光，适应于高纬度和高海拔地区种植。这2个亚种间不仅产生了生殖隔离的基因库，还在形态特征、农艺性状和生理生化反应等方面存在明显的差异。近期群体

红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

4植物基因克隆的策略与方法

4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该

水稻SBP 基因家族生物信息学分析

水稻SBP 基因家族生物信息学分析 摘要：SBP (squamosa promoter binding protein, SBP)基因家族是植物所特有的一类重要转录因子，广泛参与植物生长、发育以及多种生理生化反应的信号传导。水稻是目前为止基因组测序相当完整的一类植物，而且水稻也是现在人类生存赖以依存的粮食，因此水稻早已成为分子生物学研究的重点对象，进行水稻基因组信息挖掘与分析对于水稻功能基因组学的发展具有重要意义。本实验以植物（水稻）特异转录因子SBP基因家族为实例，讲述如何利用生物信息数据库资源和软件工具，对该基因家族进行分析。本章所用数据主要来自北京大学生物信息中心（https://www.wendangku.net/doc/bf6695671.html,/chinese/）构建的植物转录因子数据库，研究对象主要为水稻基因组中 29个SBP转录因子基因。所用生物信息学工具包括基因结构显示、双序列比对、蛋白质功能域识别、蛋白质保守域预测、序列图标构建、多序列比对、系统发育树构建、，以及蛋白质二级、三维结构空间图形显示等。本实验结果均为水稻SBP 基因家族的进一步功能分析提供了重要研究基础。 关键词：水稻、SBP家族、生物信息学 引言：我们知道，转录前调控、转录调控和转录后调控是真核生物基因表达调控的重要组成部分，其中转录调控通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用实现。顺式作用元件（cis-element）泛指 DNA 序列一个片段，通常位于被调控基因的上游，主要包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）和抑制子（suppressor）三类。反式作用因子泛指与顺式作用元件直接或间接结合 并参与靶基因转录过程的调控因子，通称转录因子（transcription factor）。转录因子可以分为两大类，即通用转录因子（general transcription factor）和特异转录因子（specific transcription factor）。通用转录因子与靶基因上游约 10-35 位的 TATA 框（TATA-box）或启动子区域转录起始位点（transcription start site）DNA序列结合，并与 II型 RNA聚合酶一起，形成转录起始复合物。特异转录因子种类繁多、功能复杂，它们与靶基因上游各种特定 DNA序列片段结合，激活或抑制靶基因转录活性，以调控靶基因在不同组织、不同细胞、不同环境条件下特异表达。如无特别说明，通常所说的转录因子即指特异转录因子。 一、结果与分析 1.水稻SBP的挖掘 先到Pfam 数据库中去搜索SBP 结构域(domain), 其标识号应该是xxx（PF03110）, 获取它的HMM 序列文件。从TIGR 水稻数据库(https://www.wendangku.net/doc/bf6695671.html,, The TIGR Rice Database release 6.0）下载水稻基因组12条染色体的蛋白质序列。然后利用基于隐马尔科夫模型的HMMER 程序(版本3.0)来搜索, E <=10-10的序列被认为是水稻中的含有SBP 结构域的候选序列（共31条）。再利用SMART在线工具分析结构域, 把没有显示SBP 结构域蛋白除掉（3条）, 最后得到水稻的SPB基因基因家族成员。 2.基因结构分析 将从TAIR获得的水稻SPB家族基因的CDS序列和对应的全基因组序列, 利用Gene Structure Display Server(https://www.wendangku.net/doc/bf6695671.html,/)绘出基因结构图

8种水稻基因组DNA提取方法的比较

8种水稻基因组DNA提取方法的比较 朱世杨;罗天宽;张小玲;陈海英;唐征;刘庆 【期刊名称】《安徽农业科学》 【年(卷),期】2009(037)005 【摘要】[目的]寻找操作简便、耗时短、成本低的水稻基因组DNA提取方法,[方法]分别以水稻幼嫩黄化叶片和老叶片为材料,用8种方法提取其中的DNA,测定所提DNA的浓度和纯度,并对其进行PCR扩增和电泳检测,比较各方法的提取效果.[结果]8种方法提取的DNA浓度分别为35.15、30.80、67.30、26.15、23.55、8.95、48.0.5、54.26 μg/ml,方法③提取的DNA浓度最大,但PCR扩增效果较差;改进的SDS法(方法⑦、⑧)提取的DNA纯度较高,PCR扩增产物电泳条带较亮,但这2种方法操作程序复杂,成本较高,提取每份样品的成本分别为14、31元,远高于其他提取方法.[结论]除方法③外,其余5种简化方法均能得到较高质量的水稻基因组DNA,且提取成本远低于传统SDS法. 【总页数】3页(1929-1931) 【关键词】水稻;基因组DNA;提取 【作者】朱世杨;罗天宽;张小玲;陈海英;唐征;刘庆 【作者单位】温州科技职业学院农业与生物技术系,浙南作物育种重点实验室,浙江温州,325006;温州科技职业学院农业与生物技术系,浙南作物育种重点实验室,浙江温州,325006;温州科技职业学院农业与生物技术系,浙南作物育种重点实验室,浙江温州,325006;温州科技职业学院农业与生物技术系,浙南作物育种重点实验室,浙江温州,325006;温州科技职业学院农业与生物技术系,浙南作物育种重点实验室,浙江温州,325006;温州科技职业学院农业与生物技术系,浙南作物育种重

功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。

1.基因克隆的步骤

基因克隆的步骤 一、RNA的提取 1. 提取RNA前将洗净干燥的瓷研钵放入-70℃预冷10 min； 2. 从液氮罐中取出样品组织放入预冷的研钵中，加液氮淹没后立即研磨，边研磨边加液氮，整个过程都 不要使液氮挥干； 3. 趁冷，将样品粉末50-80 mg加入1.5 mL离心管后再加入1 mL Trizol，样品体积应不超过所使用Trizol 体积的10%，然后按照Trizol试剂盒说明操作； 4. 室温静止5-15 min。对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织Trizol裂解后可能会有不溶物或 油脂状漂浮物，需12000g、4℃离心10 min，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中；5. 每mL Trizol中加0.2 mL氯仿。小心盖上离心管，剧烈地涡旋振荡15 sec，室温（24℃）静置3-5 min； （必需步骤） 6. 12000 g、4℃离心15 min，此时混合物分成三部分：底层为苯酚-氯仿层，中间层，上层水相层，RNA 完全存在水相中； 7. 把小于80%的水相层（每mL Trizol约可吸0.5-0.55 mL）转移至一新的离心管中，并弃去下面的有机 相（小心避免吸到中间层）。往水相中加入异丙醇来沉淀RNA，每使用1 mL Trizol，便加500 uL的异丙醇，颠倒混匀，室温下孵育样品10 min； 8. 4℃、12000 g离心样本10 min弃去上清，每mL Trizol加入1 mL 75%乙醇，涡旋混匀，室温沉淀10 min 后，7500 g、4℃离心5 min，弃上清。再用离心机甩一下（5000rpm，离心1 s）； 9. 小心吸走乙醇，短暂地在室温下置2-5 min，让RNA团风干，不要用离心干燥装置或真空干燥装置， 因为过度干燥会导致很难用水重新溶解RNA，然后在55-60℃温浴10 min，然后-70℃保存。[RNA]（ng/uL）=A260×40×稀释倍数 [DNA]（ng/uL）=A260×50×稀释倍数 纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存） 二、M-MLV RT反转录 1. oligo dT 1 uL + dNTP（ 2.5 mM）4 uL + 1-5 ug total RNA + 水= 12 uL Heat mixture to 65℃ for 5 min and quick chill on ice； 2. 上述12 uL液体+ 5×Buffer 4 uL + 0.1 M DTT 2 uL + RNase OUT 1 uL Mix contents of the tube，incubate at 37℃for 2 min 3. 上述19 uL液体加M-MLV RT 1 uL

2013-138水稻功能基因组研究进展与发展展望

中国农业科技导报,2013,15(2):1-7 Journal of Agricultural Science and Technology 一收稿日期:2013-02-28;接受日期:2013-03-29 一基金项目:国家863计划项目(2012AA10A303;2012AA10A304)资助三 一作者简介:肖景华,副教授,博士,主要从事水稻功能基因组学研究三E-mail:xiaojh@https://www.wendangku.net/doc/bf6695671.html, 水稻功能基因组研究进展与发展展望 肖景华,一吴昌银,一张启发 (作物遗传改良国家重点实验室,国家植物基因研究中心(武汉),华中农业大学,武汉430070)摘一要:水稻是重要的粮食作物也是功能基因组研究的模式植物三近年来水稻功能基因组研究发展迅速,技术和资源平台不断完善和拓展,大批重要功能基因被分离鉴定三高通量基因组新技术开始被应用于水稻育种三回顾了水稻功能基因组研究的发展历程,在对国内外研究现状总结基础上,围绕 稻2020 研究计划对未来水稻发展方向进行了展望三关键词:水稻;功能基因组; 稻2020 doi :10.3969/j.issn.1008-0864.2013.02.01 中图分类号:S511一一一文献标识码:A一一一文章编号:1008-0864(2013)02-0001-07 The Progress and Perspective of Rice Functional Genomics Research XIAO Jing-hua,WU Chang-yin,ZHANG Qi-fa (National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement,National Center of Plant Gene Research (Wuhan), Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China) Abstract :Rice is a staple food crop and model system for genomic research among cereal plants.There has been rapid advances in rice funciotnal genomic research in the last decade including development of technological and resource platforms and the isolation of functional genes.High-throughput genomic technologies have been used in rice breeding.This review gave a glimpse on the progress made in rice functional genomics research,and the perspective of rice development direction in the future around a goal referred to as Rice 2020 :a call for an international coordinated effort in rice functional genomics. Key words :rice;functional genomics; Rice 2020 一一水稻是世界和我国三大主要粮食作物之一,全球超过半数以上的人口以稻米为主粮三水稻在我国和全球粮食安全以及可持续发展中具有极其重要的地位和作用三水稻在农作物中基因组最小,并与玉米二大麦及小麦等其他禾本科粮食作物存在广泛的共线性,已成为禾谷类作物基因组研究的模式植物三此外,水稻中有高效成熟的遗传转化体系,拥有丰富的种质资源,研究历史悠久三自1998年启动国际水稻基因组测序计划以来,水稻基因组和功能基因组研究取得了巨大的进展三伴随着新一代高通量二高精度测序技术的发展,水稻功能基因组学的研究正不断深入,并开始推动作物遗传育种理念和育种技术手段的革新三 1一植物功能基因组发展现状与趋势 水稻和拟南芥分别是单子叶和双子叶基因组研究的模式植物三拟南芥全基因组测序于2000年底完成(The Arabidopsis Genome Initiative 2000),2001年国际上启动了拟南芥功能基因组研究计划(Arabidopsis 2010),目标是揭示全部基因的功能,全面阐明拟南芥的生物学基础三拟南芥全基因组测序的完成和功能基因组计划的实施,极大的推动了植物功能基因组学的发展,为重要农作物基因组研究提供了研究方法和研究策略三