小牛肠碱性磷酸酶活性检测方法的建立

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小牛肠碱性磷酸酶活性检测方法的建立

作者：赖晓芳等

来源：《安徽农业科学》2014年第18期

摘要[目的] 建立适用于科研用小牛肠碱性磷酸酶活性的检测方法。[方法] 通过模拟科研中小牛肠碱性磷酸酶的使用条件及缓冲液，并研究不同底物浓度、反应时间、显色时间、缓冲液pH等对酶活性检测的影响。[结果] 使用不同缓冲液对酶活性进行检测，其测量值差异较大。若使用添加硼酸的铁氰化钾溶液，则可以实现颜色的稳定显示。最佳水浴时间为10 min，最佳底物浓度为0.04 mol/L。随着温度的增加，对低浓度酶活性的影响不大，但对高浓度酶活性的影响逐渐增大。当缓冲液pH为7.0～8.0时，能够较好维持酶活性的稳定性。缓冲液粒子强度对酶活性的影响不大。[结论]成功建立了科研用小牛肠碱性磷酸酶的活性检测方法。

关键词碱性磷酸酶；小牛肠；活性检测；紫外分光光度法；科研

中图分类号S852.2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）18-05870-04

碱性磷酸酶在科研上的应用目前主要集中在用于DNA片段的去磷酸化，即从核酸中去除5’磷酸以减少质粒载体在连接反应中的环化，使DNA易受或抵抗某些作用于核酸的酶。碱性磷酸酶根据其来源不同分为小牛肠碱性磷酸酶、虾源碱性磷酸酶和细菌源碱性磷酸酶等[1]。

其中，小牛肠碱性磷酸酶为目前科研中最常用的且最容易购买到的，其活性部位由

Asp101Ser102Ala103、3个在空间上相靠近的金属离子及配体、Arg166及其他一些相邻氨基酸残基组成[1-2]。最佳反应pH取决于反应底物以及反应底物浓度和所选择的缓冲液类型，然而碱性磷酸酶对于各种已知的缓冲液及底物，其最适酶活pH不低于8.0[3]。

碱性磷酸酶测定常用的缓冲体系分为激活型、抑制型和惰性型3类，其测定结果差异很大，其主要原因是其缓冲体系不仅具有缓冲作用，还可作为磷酸酰基的受体，提高酶促反应的速度，从而导致了测定结果的差异[4]。磷性磷酸酶检验方法有化学抑制法、电泳法、免疫

法、分光光度法等，前2种方法的灵敏度和特异性较低，免疫法虽有较高的灵敏性和特异性但操作复杂耗时，而基于碱性磷酸酶活力的分光光度法更加方便和快捷[5]。科研用小牛肠碱性

磷酸酶目前国内外均无专门的检验标准。国内关于碱性磷酸酶活性检测的现有标准有NY/T 8012004《生鲜牛乳及其制品中碱性磷酸酶活度的测定方法》[6]、WS/T 3512011《碱性磷酸酶（ALP）催化活性浓度测定参考方法》[7]，这2个标准中采用的底物、缓冲液和酶活单位定义均大不相同。

由于NY/T 8012004中检测对象为牛乳因此需要大量使用挥发性有机试剂正丁醇，对通常以毫克级别提供的科研用小牛肠碱性磷酸酶极不合适；WS/T 351-2011检测对象为血清，因此对试验环境条件控制严格，对分光光度计要求配制恒温模块，恒温模块价格昂贵，普通实验室难以达到[6-7]。由于科研中常用Tris·HCl缓冲液，与标准中所用不同会造成检测结果的偏差，因此有必要建立与科研中使用条件一致的检测方法。笔者比较科研中小牛肠碱性磷酸酶反应条