第九节 疏水作用色谱

第九节疏水作用色谱

疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。

关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。

由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。

一、疏水作用色谱基本原理

(一) 疏水作用

疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。

根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。而根据热力学公式

△G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。在疏水作用发生时，疏水性溶质分子相互靠近，疏水表面积减少，相当一部分水分子从有序结构回到溶液相中导致熵值增加(△S>0)，引入了负的△G，从而在热力学上有利。因此非极性分子间的疏水作用不同于其他的化学键，而是由

自由能驱动的疏水分子相互聚集以减少其在水相中表面积的特殊作用。

(二) 生物分子的疏水性

对于小分子物质，根据其极性的人小可以分为亲水性分子和疏水性分子，一般来说亲水性的小分子是很难与HIC介质发生作用的。但对于疏水作用色谱的主要对象生物大分子如蛋白质而言，其亲水性或疏水性是相对的，即使是亲水性分子也会有局部疏水的区域，从而可能与HIC介质发生疏水作用，因此能够根据其疏水性的相对强弱不同进行分离。

以蛋白质为例，球状蛋白质在形成高级结构时，总体趋势是将疏水性氨基酸残基包裹在蛋白质分子内部而将亲水性氨基酸残基分布在分子表面。但实际上真正能完全包裹在分子内部的氨基酸侧链仅仅占总氨基酸侧链数的20%左右，其余均部分或完全暴露在分子表面。蛋白质表面的疏水性是由暴露在表面的疏水性氨基酸的数量和种类，以及部分肽链骨架的疏水性所决定的。因而可以认为蛋白质分子表面含有很多分散在亲水区域内的疏水区(疏水补丁)，它们在HIC过程中起着重要的作用。然而研究表明不同的球状蛋白质的疏水表面占分子表面的比例差异并不大，但即使是疏水表面比例非常接近的蛋白质，其在HIC中的色谱行为却可能有很大的差别。造成这一现象的原因是蛋白质分子表面的不规则性，即使是球状蛋白质，其分子表面也远非平滑球面，而是粗糙而复杂的，由于空间位阻的关系，有些疏水补丁是无法与HIC介质发生作用的，因此蛋白质在HIC中的色谱行为不仅取决于分子表面疏水区的大小和疏水性的强弱，还取决于其疏水区在分子表面的分布。

(二) 生物分子与疏水作用色谱介质间的作用

HIC介质是在特定的基质如琼脂糖上连接疏水配基如烷基或芳香基团组成的。HIC介质与具有疏水性的生物分子间的作用被认为与疏水性分子在水溶液体系中的自发聚集一样，是由熵增和白由能的变化所驱动的。盐类在疏水作用中起着非常重要的作用，高浓度盐的存在能与水分子发生强烈作用，导致可以在疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进了疏水性分子与色谱介质的疏水配基之间发生结合。因此在HIC过程中，在样品吸附阶段采用高盐浓度的溶液，使得目标分子结合在色谱柱中，而在洗脱阶段，采用降低洗脱剂中盐浓度的方式使溶质与色谱介质间的疏水作用减弱，从而从色谱柱中解吸而被洗脱下来。对于以芳香

基团作为疏水配基的色谱介质来说，还存在潜在的发生π-π作用的可能当待分离物质表面具有芳香基时，就会表现出疏水作用和π-π作用的混合分离模式。

较大的生物分子与色谱介质发生结合时的情况是比较复杂的，一般来说每个分子被吸附的过程都会有一个以上的配基参与，换句话说，分子在色谱介质上发生的结合是多点结合。经研究发现吸附过程是多步反应过程，其中的限速步骤并非酶与色谱介质接触的过程，而是酶在色谱介质表面发生缓慢的构象改变和重新定向的步骤。

(四) 疏水作用色谱与反相色谱的区别

从理论上看，HIC和RPC是两种密切相关的液相色谱技术，它们都是基于生物分子表面的疏水区域与色谱介质上的疏水配基(烷基或芳香基)之间的疏水相互作用，然而在分子水平的色谱机理以及实践层面上这两种技术是有所不同的。RPC介质上疏水配基的取代程度大大高于HIC介质。RPC介质可以认为是连续的疏水相，其配基如C4~C18烷基的取代程度通常在数百微摩/rnL凝胶；而HIC介质上配基如C2~C 8烷基或简单芳香基的取代程度通常在10~50mmol/mL 凝胶范围内，可以看作是不连续的疏水相，在与生物分子结合时由一个或数个配基参与。那么很显然，疏水溶质与RPC介质间的作用力要比H I C介质强得多，需要使用有机溶剂梯度等剧烈的洗脱条件才能将溶质从色谱柱中洗脱下来，对于球状蛋白质，在这样剧烈的洗脱条件下往往会发生变性，因此RPC更适合在水-有机溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分子蛋白质的分离纯化。而HIC过程的洗脱条件要温和得多，通常降低洗脱剂的盐浓度就能达到目的，因此H IC既利用了蛋白质的疏水性质，又能够在更为极性和低变性的环境中进行，因而在蛋白质的纯化中有着更为广泛的应用。

尽管这两种技术都是利用生物分子的疏水性质进行分离，但由于在吸附的分子机理上存在差异，它们对于同一组样品的选择性往往是不同的。例如，有人研究用疏水色谱柱TSK Gel Phenyl-5-PW和反相色谱柱SynChropak对12种常见蛋白质进行色谱，对选择性作了比较，如表6.9-1所示，各种蛋白质被洗脱的顺序全然不同。

表6.9-1 12种蛋白质在疏水色谱柱和反相色谱柱中的选择性比较

①疏水作用色谱：色谱柱尺寸55mm×200mm，流动相A为含1.0mol/LNaSO4的1mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.0)，流动相B为10mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)，梯度为20min内0~100%B，流速为1mL/min。

②反相色谱：色谱柱尺寸4.6mm×50mm，流动相A为0.1% TFA水溶液(pH2.0)，流动相B 为含0.1% TFA的60%异丙醉溶液，梯度为20min内0~100%B，流速为1mL/min。

(五) 影响疏水作用色谱过程的参数

影响疏水作用色谱过程的因素来自于固定相类型、流动相组成和色谱条件。

1. 固定相

固定相条件，包括采用基质的类型、配基的种类和取代程度都会影响对样品的分离效果，这也是色谱时合理选择色谱介质的依据。

疏水配基的种类直接决定着目标分子在色谱时的选择性，是选择疏水作用色谱介质时首先要考虑的问题。常见的配基包括烷基和芳香基两大类，其中烷基配基与溶质间显示出单纯的疏水作用，而芳香族配基往往由于和溶质间存在π-π作用而呈现出混合模式的分离行为。对于烷基配基，烷基的链长决定着色谱介质疏水性的强弱，同时还影响着色谱介质的结合容量。在其他条件相同的情况下，HIC介质对蛋白质的结合容量随着烷基链长的增加而增加。

在配基种类确定的情况下，取代程度的高低决定着HIC介质的结合容量和疏水作用强度。在色谱介质上配基取代程度较低时，随着取代程度的增加。色谱介质对蛋白质的结合容量会增加，这是由于配基数量的增加使得蛋白质在色谱介质表面的结合位点增多，从而单位体积的色谱介质能够吸附更多的溶质分子。但是当取代程度达到一定数值后，结合容量就会趋于稳定，此时进一步提高取代程度并不能再增加结合容量。这是由于空间位阻决定了单位色谱介质表面只能结合

特定数量的蛋白质，因此当这些表面饱和后结合容量就不再随取代程度而变化了。但是需注意的是取代程度的进一步上升将会使得与每个蛋白质发生作用的配基数量增加，从而使蛋白质更为牢固地结合于色谱介质上而难以洗脱。

基质同样会对色谱结果产生影响，具有相同配基种类和取代程度但不同基质的吸附剂会具有不同的选择性。通常HIC介质所采用的是高度亲水性的基质。

2. 流动相

流动相条件对HIC的影响主要表现在所用盐的种类和浓度、流动相的pH，以及其他添加剂的影响。HIC过程是在高盐浓度下实现样品的吸附，而后在低盐浓度下完成洗脱过程。显然，流动相中盐的种类和浓度是HIC中至关重要的参数。

不同的离子，特别是阴离子在HIC中的作用是不同的。有些离子存在于溶液中时会促进蛋白质发生沉淀，它们能够增加疏水作用；而另一些离子的存在却会促进蛋白质的溶解，称为促溶盐类，它们的存在会破坏疏水作用。Hofmeister 系列指出了不同离子对疏水作用的影响（表6.9-2），表中左边的离子能够促进疏水作用，因而经常在HIC中使用，而右边的离子属于促溶离子，它们能破坏疏水作用，有时在对色谱介质进行清洗时可以用来洗脱一些结合特别牢固的杂质。

表6.9-2 不同离子对疏水作用强弱产生影响的Hofmeister系列

在所用盐的种类已经确定的情况下，盐浓度的高低会影响到溶质分子与色谱介质的结合强度及色谱介质的结合容量。盐浓度的升高能促进疏水作用，因此HIC通常都是在高盐浓度下加样并完成吸附，而通过降低洗脱剂中盐浓度的方法进行洗脱。除此之外，色谱过程的起始盐浓度的高低还会影响色谱介质对蛋白质的结合容量。

流动相的pH对色谱行为的影响比较复杂。多数情况下pH升高会使得疏水作用减弱，而降低pH则增强此作用力，但是对于一些等电点较高的蛋白质，在高的pH下却能够牢固地结合在HIC介质上。

流动相中的其他添加剂主要指能够减弱疏水作用的醇类、去污剂、促溶盐类

等，它们的存在能有效地将溶质分子从HIC介质上洗脱下来，同时它们还会影响分离过程的选择性。但是它们的存在一般会破坏蛋白质等生物大分子的本间结构，使后者丧失部分或全部活性，所以在HIC过程中尽量避免使用此类试剂。

3. 色谱条件

除了固定相和流动相之外，色谱过程中的一些其他条件，例如温度、流速等也会影响到色谱结果。其中温度对HIC的影响比较复杂，根据疏水性溶质在水相中相互作用的理论，一方面疏水作用随温度的升高而增强，但另一方面温度的升高会对蛋白质的构象状态和在水中的溶解性等产生影响，从而表现为复杂的特征，由于温度对疏水作用的明显影响，在执行一个特定的色谱任务时应当维持恒定的温度。流速对HIC的影响与其他色谱技术类似，然而由于HIC的分离对象主要是蛋白质这类大分子。对流速的敏感性相对较低，因此流速的选择主要考虑分离时间和色谱介质类型等因素。

二、疏水作用色谱介质

(一) 疏水作用色谱介质的基本结构

HIC介质的结构与其他吸附技术所用的吸附剂类似，由作为骨架的基质和参与疏水作用的配基。

许多类型的基质都可以用来合成HIC介质，但是使用最为广泛的是琼脂糖、硅胶和有机聚合物等。琼脂糖凝胶是很早就被采用的一种基质，至今仍被大范围地使用，其优点是亲水性强，表面经基密度非常大，衍生化后可以产生取代程度和结合容量较大的HIC介质，并且其大孔结构可以容纳体积很大的分子，适合于大分子蛋白质的分离，而且pH稳定性良好。硅胶的特点是硬度大，够承受很高的流速和压力，有良好的机械稳定性，能适合于在HP-HIC系统中使用。但是其表面可供衍生的基团少，pH稳定性也差（pH2~8范围内稳定），因此其应用受到了限制。但随后诞生了聚合物包裹技术，在硅胶或其他有机聚合物表面包裹一层带有可衍生基团的高分子材料，从而克服了硅胶基质的上述缺点，使其具备良好的色谱性能而被广泛地使用。

HIC介质所用的疏水配基分为烷基和芳香基，与反相色谱介质相比，其烷基通常在C8以下，而很少使用疏水性更强的具有更长碳链的烷基，芳香基则多为苯基。图6.9-1显示了几种经常使用的疏水配基连接至基质的情况。

图6.9-1 偶联至基质的常见配基类型

方框内部分为疏配基；斜杠部分代表基质；剩余部分是将配基连接至基质的基团

将疏水配基偶联至基质的方法视基质的表面基团而定，其中最有代表性的是羟基，琼脂糖基团带有大量的羟基、而硅胶及其他聚合物基质也会因表面包裹修饰后带上羟基。将疏水配基连接至羟基通常是使用带有环氧化物基团的配基分子与羟基发生成醚反应而形成稳定的共价键，环氧化物基团反应后开环形成配基与基质之间的连接部分。

式中R——疏水配基；M——基质。

通过调节两种反应物的比例可以方便地控制所得疏水作用色谱介质的配基密度。

(二) 常见疏水作用色谱介质的种类

表6.9-3列出了部分已经商品化的HIC介质(包括部分色谱柱)的类型及特性。

表6.9-3 部分商品化的HIC介质和色谱柱的类型及特性

三、疏水作用色谱实验技术

(一) 疏水作用色谱介质的选择和色谱柱的准备

由于HIC介质的基质类型、疏水配基类型和取代程度都会影响到色谱行为，因此在选择疏水作用色谱介质种类时对这些因素都需要进行考虑。

基质的类型会影响疏水作用色谱介质的选择性，但这种对选择性的影响往往是难以预测的，因此确定疏水作用色谱介质时带有经验性。然而色谱过程中需要采用的流速和承受的压力在选择基质种类时必须予以考虑，若操作过程在HPLC 系统中进行，则应当选用机械强度较大的刚性基质。此外，若待分离物质是分子量很大的蛋白质，并且样品量也较大，则应当选择大孔型基质，如琼脂糖凝胶，这样能够获得较高的结合容量；若待分离物质为较小的分子，或者样品量很小，但对于分辨率的要求较高，则可以考虑选用孔径较小的基质甚至非孔型基质，以便获得较高的柱效和良好的分辨率。

疏水配基类型和取代程度实际上决定了色谱介质的疏水性强弱和结合容量的高低，配基(烷基)链越长，取代程度越高，则疏水性越强；反之，链长越短，取代程度低，则疏水性越弱。在HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4~C8，苯基的疏水性大致与戊基相当，不过由于可能与溶质发生π-π相互作用，它与戊基有着不同的选择性，寡聚乙二醇固定相的疏水性界于丁基与苯基之间。

选用何种疏水程度的色谱介质，最终依据是目标分子的疏水性强弱，总体趋势是在分离疏水性弱的分子时选用疏水性强的色谱介质，分离疏水性强的分子时选用疏水性弱的色谱介质。如果目标分子疏水性很弱，在分离时需要确保有足够强的疏水作用使其能够与色谱介质发生结合，提高结合时流动相的盐浓度是增加疏水作用的方法之一，但如果色谱介质本身疏水性不够强，单方面提高盐浓度将是事倍功半，并且疏水作用色谱时盐的消耗量很大，盐浓度的高低直接关系到分离过程的成本，另外含高浓度盐类的废水在排放时涉及环保问题，因此在可能的情况下，人们更愿意采用盐浓度较低的流动相，此时选用配基链长更长，取代程度更高因而有着更强疏水性的固定相将是十分有效的手段。反之，如果日标分子疏水性很强，则应当考虑该分子是否会与色谱介质结合得过于牢固而难以洗脱，一般的考察方法是用不含盐的缓冲液作为流动相，看是否能够将目标分子从色谱

柱中洗脱，对于特别难以洗脱的物质，原则上通过往流动相中加入非极性溶剂可以达到洗脱目的，但是对于蛋白质等生物分子，有机溶剂的添加很容易造成其失活，因此在这种情况下，人们更愿意选用疏水性较弱的色谱介质以减弱溶质与色谱介质的结合强度。

由于在第一次进行色谱时，样品中目标分子的疏水性并不能确定，因此在选择色谱介质前可以进行一次预备实验对色谱介质进行筛选。具体的方法一般是选出疏水性强弱存在明显差异的几种色谱介质填充成很小规模的色谱柱，以含有

1mol/L硫酸铵的缓冲液作为流动相A，不含盐的缓冲液作为流动相B，采用盐浓度下降的线性梯度进行洗脱，观察目标分子与固定相结合及被洗脱的情况来确定合适的色谱介质。

在色谱柱的选择方面，由于疏水作用色谱属于吸附色谱技术，一般采用较粗而短的色谱柱，其中柱长的选择一定程度上取决于所需的分辨率，而柱内径的大小与分离样品的规模有关。

(二) 样品的准备

与其他色谱技术相比，HIC在样品准备方面的要求比较低，一般来说，往色谱柱中加样前无需改变样品的缓冲液体系，所需采取的措施是往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与流动相A中基本一致，并根据需要调节样品溶液的pH使其满足吸附条件。往样品中添加盐时既可以以固体形式加入，也可以以浓缩盐储液形式加入，前一种方式有时会因为局部盐浓度过大导致出现沉淀，因此后一种加盐方式更为人们所常用。需要注意的是，有时为了确保目标分子发生吸附，需要很高的盐浓度条件，但在此盐浓度下部分样品组分会发生沉淀，为了解决此矛盾，可以采取样品如溶液中盐浓度适当低于流动相A中盐浓度的方式。加样前色谱柱先用流动相A充分平衡，加样时虽然样品中盐浓度较低，但样品进入盐浓度较高的色谱柱后还是能有效发生吸附。

与其他吸附色谱技术类似，HIC的样品体积主要受到样品中组分浓度和色谱介质的结合容量的影响。对于稀释样品无需浓缩可以直接加样。但如果遇到上述样品溶液盐浓度低于流动相A的情况时一次加样体积不能太大，否则无法确保样品有效吸附，此时如果样品体积较大。可以采用将样品分做若干份进行加样的方式，加完一份样品后用一定体积的流动相A通过色谱柱，重新提高柱中盐浓

度，使组分完成吸附，再进行下一份样品的加样，如此循环直到样品添加完毕。

对于所有色谱实验，黏度过大的样品均会导致色谱结果不理想，遇到这种情况，同样可以通过稀释的方法降低样品猫度。另外在加样前样品中如有颗粒状物质，必须通过过滤或离心的方法除去。

(三) 色谱条件的确定和优化

确定色谱条件的目标是在目标分子达到所需纯度的基础上，获得尽可能高的回收率，同时力求缩短分离所需时间、降低分离成本等。在HIC中，色谱条件主要包括流动相A、流动相B、洗脱方式、色谱柱的柱长、流速、温度等。

流动相A是色谱的起始条件，在绝大多数情况下，人们采用使目标分子结合至色谱柱而疏水性较弱的杂质不被吸附而穿透的方式。此时需要确定的是流动相A中缓冲液的种类、盐的种类和浓度、pH等条件。确定缓冲液的种类主要考虑所需采用的pH，缓冲液在此pH附近必须具备强的缓冲能力，此外所用缓冲盐不会对蛋白质的稳定性造成不利影响。由于流动相中盐浓度主要依靠额外添加的盐类维持，缓冲液中缓冲盐本身的浓度一般不需要很高，通常0.01~0.05mol/L，仅需具有足够的缓冲能力即可。不同盐类疏水作用的影响在前面已经讨论过，在HIC中最有效并且使用最广泛的盐是(NH4)2SO4和Na2SO4，此外NaCl有时也被使用，不同盐类除了对疏水作用的强度有影响外，在色谱中表现出的选择性也会不尽相同。所以盐的浓度也随样品中目标分子的疏水性而异，使用(NH4)2SO4作为色谱盐时常用的浓度为0.75~2mol/L，使用NaCl时浓度多在1~4mol/L。在理想的状态下，所选择的盐的种类和浓度应当能够使得目标分子结合在色谱柱上，而主要的杂质成分不被吸附而穿过色谱柱。在试探性实验中，1mol/L的(NH4)2SO4是常用的条件，根据洗脱后的出峰情况再对其进行调整。如果目标分子在洗脱过程的早期就从色谱柱中洗脱，可以适当提高流动相A中盐的浓度，当然也可换用疏水性较强的色谱介质；如果目标分子在洗脱过程中很晚才被洗脱，则可以适当降低流动相A中的欲浓度，或者换用疏水性较弱的色谱介质。流动相A的pH 条件对吸附过程至关重要，它直接影响着目标分子在色谱介质上的结合强度及分离过程的选择性。但是pH对色谱结果的影响并不存在一般规律，因此色谱操作大多是在能够使目标蛋白保持良好稳定性的pH条件下进行的。如果在这种pH 下目标蛋白与色谱介质不能有效结合，或者色谱结果选择性不佳，可以考虑对色

谱过程的pH进行优化，即分别在具有不同pH的流动相条件下进行色谱分离，确定分离过程的最佳pH。当然这个过程也必须考虑到目标蛋白的稳定性，确保色谱分离后目标蛋白有足够高的活性回收率。

当样品被添加至色谱柱，并用1~2个柱体积的流动相A通过色谱柱完成样品的吸附过程后，就要对吸附样品进行洗脱了。HIC中将样品洗脱的方式主要有3种：①采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱，随着盐浓度的下降，样品组分与色谱介质间的疏水作用不断减弱从而各组分按疏水性由弱到强的顺序被洗脱，这是HIC中最常用的洗脱方式；②通过往流动相中添加有机溶剂，例如，乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱，极性的降低会大大减弱疏水作用，从而使得一些与色谱介质间存在强疏水作用，较难被洗脱的组分从色谱介质上解吸而被洗脱，这种方式常常与第一种方式结合使用，即洗脱过程中在降低盐浓度的同时逐渐增加有机溶剂的浓度，但由于溶剂的存在往往对生物大分子的稳定性产生不利影响，因此这种洗脱方式仅限于在溶剂中稳定性良好的物质的分离；③往流动相中添加去污剂等试剂进行洗脱，去污剂本身能与色谱介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来，但是去污剂一般会破坏蛋白质的空间结构，并且有的与色谱介质结合过于牢固而难以被清洗下来，对色谱介质的再次使用非常不利，因此这种洗脱方式有较大的局限性，一般在分离膜蛋白时会采用。

对于最为常用的降低盐浓度的洗脱方式，又可分为梯度洗脱和阶段洗脱，其概念在离子交换色谱等节中已有阐述。在进行试探性实验时首选梯度洗脱，并且一般采用简单下降的线性梯度，梯度的终点即流动相B多为不含盐的与流动相A 具有相同pH的缓冲液。一方面，梯度的斜率直接影响着色谱过程的分辨率，斜率较低的梯度能产生好的分辨率，但是另一方面，如果洗脱过程都是从100%的流动相A(或者表示为0%流动相B)过渡到100%的流动相B，斜率降低会使分离所需时间延长。解决这一矛盾的方法有两种，一种是在试探性实验后对梯度进行优化，采用复合梯度，在目标分子的洗脱峰附近降低梯度斜率以获得足够的分辨率，而在其他部分提高梯度斜率以缩短色谱时间，当然这些部分组分间的分辨率会变差，但不会对目标产物产生影响（图6.9-2 a）。另一种优化方法是采用低的梯度斜率，同时根据首次色谱分离时目标分子的出峰位置适当降低流动相A中

的盐浓度或增加流动相B中的盐浓度，这样由于梯度的范围变窄，所需时间也会缩短，从而弥补斜率降低对分离时间产生的不利影响。对于特别复杂的样品，还能采用凹形、凸形等更为复杂的梯度形式以达到满意的分辨率。阶段洗脱的优脱问样有一足的优势在于操作简单，不同批次间重复性良好，因此在大规模分离纯化中较常使用。在分析型分离时只要流动相条件选择恰当，阶段洗脱同样有一定的优势，可以缩短分离时间，得到浓度较高的分离后产物，同时也能提高分辨率，因为阶段洗脱相当于在每一阶段内部采用斜率为零的梯度进行洗脱（图6.9-2 b）。

图6.9-2 根据试探性实验结果对洗脱进行优化

阴影部分代表目标分子的洗脱峰；直线代表洗脱过程中盐浓度的变化在HIC过程中温度对色谱结果的影响是显著的，这是由于温度升高会增加疏水作用这在前面已经提到过。因此从溶质结合至色谱介质的角度看，升高温度是有利的，但是蛋白质等生物大分子在较高温度下会发生变性，所以事实上HIC 过程并不主张在升高温度的条件下进行。但是对于特定的分离任务，操作过程的温度需要保持恒定，这样才能确保色谱结果具有良好的重复性。

（四）色谱介质的再生、清洗和储存

对于不同类型的色谱介质，再生和清洗的方法有所不同。最常规的再生方法

是在洗脱过程完成后用蒸馏水清洗，如果有疏水性很强的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在色谱介质上则需要用合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗色谱柱的同时还能使微生物钝化灭活起到消毒的效果。此外，前面提及的促溶盐类的水溶液往往也是良好的清洗剂。HIC介质在储存时一般可以悬浮在20%的乙醇中，如果在水溶液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微生物生长。

四、疏水作用色谱的应用

HCI已被广泛地应用于生物分子特别是蛋白质的分离纯化中，而且可作为变性蛋白色谱复性的主要应用技术。

(一) 混合物的分离

李冲峰等将疏水色谱技术用于从猪胰脏中分离纯化激肽释放酶，建立了一种简便、快速的分离提纯方法：将粗品溶解后经过硫酸铵沉淀处理，在比较3种疏水色谱介质分离纯化的效果后（见图6.9-3），进一步选择Butyl Sepharose FF疏水色谱后得到目标蛋白，分析其纯度大于500U/rng，盐析和疏水两步纯化的收率大于85%。

杨海荣等将一步冷乙醇沉淀后的血浆上清进行脱盐除乙醇，用阳离子交换色谱介质CM-Sepharose FF以透过式色谱的模式吸附非白蛋白组分，再Butyl Sepharose FF疏水色谱后所得样品经SDS-PAGE银染显示一条单带，分析其纯度大于99%，收率为81.2%。

图6.9-3 三种疏水色谱介质上的色谱分离结果

(二) 蛋白质的复性

疏水色谱同样可进行蛋白复性并同时分离纯化。其主要原理：高盐浓度下，

疏水色谱介质与变性蛋白质之间以较强的疏水作用力相合，防止了变性蛋白分子的聚集或沉淀，而变性剂则能快速地随流动相一同流出，实现了变性剂与变性蛋白的分离，然后，在变性浓度降低的微环境下，随着盐浓度的不断降低，变性蛋白质在解吸过程中重新正确折叠，实现复性。

疏水色谱复性应用的研究报道较多，例如关怡新等研究发现重组人干扰素-2γ(rhIFN-2-γ)在大肠杆菌中高效表达，并形成包含体。利用疏水作用色谱法(HIC)对rhIFN-2-γ进行复性，在优化的线性尿素梯度复性条件下，尿素浓度在10个柱体积内从6mol/ L下降到2mol/ L，流速为I mL/min、上样量为0.568mg时，rhIFN-2-γ的活性收率比稀释复性法提高6.5倍，蛋白质量收率为36%，比活力达1.9×108IU/mg。

同一种蛋白质在错误折叠和正确折叠两种不同状态下与疏水色谱介质结合情况不同，因此疏水色谱也可以对它们进行分离。如赵荣志等利用疏水色谱分离正确折叠与错误折叠的复合于扰素，可达到较好的分离效果(见图6.9-4)。

图6.9-4 疏水色谱介质纯化复合干扰素

P1—正确折叠；P2—错误折叠

此外，一些疏水色谱介质的不断改进与开发，使疏水色谱有更好和更广泛的分离应用前景，如在其基础上发展出来的疏水电荷诱导色谱等；疏水色谱的另一个发展趁势则是建立蛋白质的疏水特性与色谱保留值之间的关系，从而实现预测待分离的蛋白质的保留时间。

疏水层析填料

2008-6 Volume 8 疏水层析填料 疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。 Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。 三种疏水层析填料的疏水性差异（左图） 色谱柱：8.2 x 150 mm 柱体积：8 ml 流动相：2.0 – 0.0M Ammonium Sulfate in 0.01M phosphate, pH 7.0 流速：1.32 ml/min 样品：5 mg/3 ml– 100 μl 2008-6 Volume 8 Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱） Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。 聚合物基材氨基柱与硅胶基材氨 基柱的柱寿命比较 左图为Asahipak NH2P色谱 柱与硅胶基材氨基柱的寿命对 比试验。结果显示：随着使用时 间的延长，硅胶基材氨基柱对单 糖、二糖的保留快速下降，其原 因应是硅胶基材氨基柱的氨基 降解所致。 色谱柱：Asahipak NH2P-50 4E,

亲水作用色谱柱的基本性能评价及应用举例

新型亲水作用色谱柱TSKgel NH 2-100 3μm TSK l NH1003 的基本性能评价及应用举例 东曹达（上海）贸易有限公司技术服务中心 东曹公司生命科学事业部

亲水作用色谱模式的特点 亲水作用色谱(HILIC)的分离原理 利用样品在流动相和固定相中的分配平衡，样品中的极性官能团与固定相表面进行亲水相互作用 特点 1)固定相一般为极性官能团（如氨基、酰胺基、羟基等）修饰硅胶或聚合物 固定相般为极性官能团（如氨基酰胺基羟基等）修饰硅胶或聚合物2)流动相类似反相的流动相，一般使用比固定相极性低的溶液。如：乙腈/水≥7/3等 3)极性化合物保留强，适合多肽、糖、核酸等低分子、高极性化合物的分离极性化合物保留强适合多肽糖核酸等低分子高极性化合物的分离4)疏水性杂质不积累，可以最大程度避免色谱柱损坏。

东曹HILIC色谱柱 １．TSKgel Amide80（5μm，3μm） TSKgel Amide-80 －硅胶基质（酰胺基型）HILIC色谱柱 －极性化合物保留强、分离性能强，但还原糖分离发生峰分裂现象２．TSKgel NH2-60(5μm) －硅胶基质（氨基型）HILIC色谱柱 －适合糖类化合物分离，但化学稳定性不高 适合糖类化合物分离但化学稳定性不高 新型HILIC色谱柱：TSKgel NH2-100 3 μm －氨基型色谱柱耐久性大幅度提高 －与Amide-80具有相同或更高的保留性能和更高的分离性能

TSKgel NH-1003μm TSKgel NH2-100 3μm色谱柱及填料 基质硅胶 平均粒径3μm 孔径10nm 比表面积450m2/g 表面官能团氨基 封端处理TMS 封端 色谱柱 2.0mm I.D. x 15cm 4.6mm I.D. x 15cm 保护柱 2.0mm I.D. x 1.0cm 3.2mm I.D. x 1.5cm

完整版第九节疏水作用色谱

第九节疏水作用色谱 疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。 关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC 已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。 由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。 一、疏水作用色谱基本原理 (一) 疏水作用 疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。 根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。而根据热力学公式 △G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。在疏水作用发生时，疏水性溶质分子相互靠近，疏水表面积减少，相当一部分水分子从有序结构回到溶液相中导致熵值增加(△S>0)，引入了负的△G，从而是由因此非极性分子间的疏水作用不同于其他的化学键，而在热力学上有利。．自由能驱动的疏水分子相互聚集以减少其在水相中表面积的特殊作用。 (二) 生物分子的疏水性 对于小分子物质，根据其极性的人小可以分为亲水性分子和疏水性分子，一般来说亲水性的小分子是很难与HIC介质发生作用的。但对于疏水作用色谱的主要对象生物大分子如蛋白质而言，其亲水性或疏水性是相对的，即使是亲水性分子也会有局部疏水的区域，从而可能与HIC介质发生疏水作用，因此能够根据其疏水性的相对强弱不同进行分离。 以蛋白质为例，球状蛋白质在形成高级结构时，总体趋势是将疏水性氨基酸残基包裹在蛋白质分子内部而将亲水性氨基酸残基分布在分子表面。但实际上真正能完全包裹在分子内部的氨基酸侧链仅仅占总氨基酸侧链数的20%左右，其余均部分或完全暴露在分子表面。蛋白质表面的疏水性是由暴露在表面的疏水性氨基酸的数量和种类，以及部分肽链骨架的疏水性所决定的。因而可以认为蛋白质分子表面含有很多分散在亲水区域内的疏水区(疏水补丁)，它们在HIC过程中起着重要的作用。然而研究表明不同的球状蛋白质的疏水表面占分子表面的比例差

疏水作用层析

疏水作用层析 实验概要 通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。 实验原理 疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。 溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。 Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。 主要试剂 1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.0 3. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4

4. 蛋白质样品溶于溶液B 主要设备 层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计 实验步骤 1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。 2. 装柱：将层析柱洗净，固定在铁架台上，层析柱下口用螺旋夹夹紧。加入溶液B，打开下口让溶液流出，排出残留气泡，柱中保留高度约2厘米的溶液。将准备好的层析介质轻轻搅匀，用玻璃棒引流，沿层析柱内壁将层析介质缓慢加进柱中。等到层析介质在柱中沉积高度超过1厘米时，打开下口。柱床高度达到6-8厘米时关闭下口，装柱尽可能一次装完，避免出现界面。 3. 柱平衡：用溶液B平衡1-2个床体积。注意始终保持层析介质处于溶液中，不要干柱。 4. 上样：取样品加入平衡好的层析柱，并收集层析柱下口流出组分，调节流速为1ml/min,每管3ml。 5. 洗涤：用溶液B洗涤1个床体积，洗去上样不吸附组分。收集层析柱下口流出成分。 6. 洗脱与收集：梯度混合器左面装入250ml溶液A，右面装入250ml溶液B。按照 100%-0%1.7M (NH4)2SO4梯度洗脱500ml，收集洗脱液。 7. 检测：取各收集管样品，280nm处测定紫外吸收。 8. 疏水层析介质清洗与保存：层析介质先用水清洗，然后用0.5MNaOH洗脱，最后用水洗至中性。处理好的层析介质放在20%乙醇中，4℃保存。 9. 以各个收集管的管号为横坐标，280nm处紫外吸收值为纵坐标作图，得到洗脱曲线。分析实验结果并讨论。

色谱术语

色谱图 chromatogram 色谱峰 chromatographic peak 峰底 peak base 峰高 h，peak height 峰宽 W，peak width 半高峰宽 Wh/2，peak width at half height 峰面积 A，peak area 拖尾峰 tailing area 前伸峰 leading area 假峰 ghost peak 畸峰 distorted peak 反峰 negative peak 拐点 inflection point 原点 origin 斑点 spot 区带 zone 复班 multiple spot 区带脱尾 zone tailing 基线 base line 基线漂移 baseline drift 基线噪声 N，baseline noise 统计矩 moment 一阶原点矩 γ1，first origin moment 二阶中心矩 μ2，second central moment 三阶中心矩 μ3，third central moment 液相色谱法 liquid chromatography，LC 液液色谱法 liquid liquid chromatography，LLC 液固色谱法 liquid solid chromatography，LSC

正相液相色谱法 normal phase liquid chromatography 反相液相色谱法 reversed phase liquid chromatography，RPLC 柱液相色谱法 liquid column chromatography 高效液相色谱法 high performance liquid chromatography，HPLC 尺寸排除色谱法 size exclusion chromatography，SEC 凝胶过滤色谱法 gel filtration chromatography 凝胶渗透色谱法 gel permeation chromatography，GPC 亲和色谱法 affinity chromatography 离子交换色谱法 ion exchange chromatography，IEC 离子色谱法 ion chromatography 离子抑制色谱法 ion suppression chromatography 离子对色谱法 ion pair chromatography 疏水作用色谱法 hydrophobic interaction chromatography 制备液相色谱法 preparative liquid chromatography 平面色谱法 planar chromatography 纸色谱法 paper chromatography 薄层色谱法 thin layer chromatography，TLC 高效薄层色谱法 high performance thin layer chromatography，HPTLC 浸渍薄层色谱法 impregnated thin layer chromatography 凝胶薄层色谱法 gel thin layer chromatography 离子交换薄层色谱法 ion exchange thin layer chromatography 制备薄层色谱法 preparative thin layer chromatography 薄层棒色谱法 thin layer rod chromatography 液相色谱仪 liquid chromatograph 制备液相色谱仪 preparative liquid chromatograph 凝胶渗透色谱仪 gel permeation chromatograph 涂布器 spreader

色谱术语中英对照

1、气相色谱法（GC）—gas chromatography用气体做为流动相的色法。 2、气液色谱法（GLC）—gas liquid chromatography 将固定液涂在载体上作为固定相的气相色谱法。 3、气固色谱法（GSC）—gas solid chromatography 用固体（一般指吸附剂）作固定相的气相色谱法。 4、程序升温气相色谱法—programmed temperature gas chromatography 色谱柱按照预定的程序连续地或分阶段地进升温的气相色谱法。 5、反应气相色谱法—reaction gas chromatography 试样以过色谱前、后的反应区进行化学反应的气相色谱法。 6、裂解气相色谱法—pyrolysis gas chromatography 试样经过高温、激光、电弧等途径，裂解为较小分子后进入色谱柱的气相色谱法。 7、顶空报相色谱法—haed （应为head -编者注）space gas chromatography d在密闭的容器中与液体（或）固体）试样处于势力学平衡（应为热力学平衡 -编者注）状态的气相组分，是间接测定试样中挥发性组分的一种方法。 8、毛细管气相色谱法—capillary gas chromatography 使用具有高分离效能的毛细管柱的气相色谱法。 9、多维气相色谱法—multidimensional gas chromatography 将两个或多个色谱柱组合，通过切换，可进行正吹、反吹或切割等的气相色谱法。 10、制备气相色谱法—preparative gas chromatography 用能处理较大量试样的色谱系统，进行分离、切割和收集组分，以提纯化全物的气相色谱法。 11、色谱柱：chromatographic column内有固定相用以分离混合组分的柱管。 12、填充柱：packed cklumn （应为column-编者注）填充了固定相的色谱柱。 13、微填充柱：micro-packed column填充了微粒固定相的内径一般为0.5-1mm的色谱柱。 14、毛细管柱：capillary column 内径一般为0.1—0.5mm的色谱柱。 15、空心柱：open tubular column 内壁上有固定相的开口毛细管柱。 16、涂壁空心柱（WCOT）：wall –coated open tubular column 内壁上直接涂渍固定液的空心柱。 17、多孔层空心柱（PLOT）：porus –layer open tubular column 内壁上有多层孔的固定相的空心柱。 18、涂载体空心柱（SCOT）：support –coated open tubular column 内壁上沉积载体后涂渍固定液的空心柱。 19、填充毛细管柱：packed capillary column 将载体或吸附剂疏松地装入玻璃管中，然后拉制成内径一般为0.25—0.5mm的毛细管柱。 20、分流器：splitter 按一定比例将气流分成两部分的部件。 21、进样器：sample injector 能定量和瞬间地将度样注入色谱系统的器件。通常指进样阀或注射器。 22、汽化室：vaporizer 使试样瞬间汽化并预热载气的部件。 23、检测器：detector 能检测色谱柱流出组分及其量的变化的器件。 24、浓度敏感型检测器：concnetration sensitive detector 响应值取决于组分浓度的检测器。 25、质量敏感型检测器：mass(flow rate)sensotive detector. 响应值取决于组分质量流量的检测器。 26、积分型检测器：integral detector 响应值取决于组分累积量的检测器。

疏水色谱的原理和应用

疏水色谱的原理和应用 疏水色谱是利用样品分子与固定相的疏水力作用的不同，用流动相洗脱时，各组分迁移速度不同而达到分离的目的。流动相一般为pH6-8的盐水溶液，具有对蛋白质的回收率高，蛋白质变性可能性小等优势。由于流动相中不使用有机溶剂，也有利于蛋白质保持固有的活性。 疏水作用色谱是在高离子强度的条件下，蛋白质溶解度降低，易吸附在中等疏水性的填料表面。随着离子强度的降低，蛋白质的溶解度增加，逐步从柱子上洗脱下来。该法具有高分辨率及保持蛋白质生物活性的特点。 疏水作用色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先流出。在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的组成使蛋白质得到分离。 疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品。目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。 1

(分析化学)亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用

研究报告DOI :10.3724/SP.J.1096.2014.30310亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用江静1,2　应万涛*2　钱小红*2 1(中国人民解放军总医院,军医进修学院,北京100039)2(蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,解放军医学院,北京102206)摘　要　蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用三由于技术条件的限制,传统的糖蛋白分析方法中,通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构,而忽略了蛋白质与糖链的连接关系三本研究旨在以完整糖肽作为检测对象,对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析三采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化,联合生物质谱中碰撞诱导解离(CID)二高能诱导解离(HCD)二电子转移解离(ETD)等裂解模式,对完整糖肽的糖基化位点二糖链结构二肽段序列等进行全方面的解析三结果表明,亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽,采用30%CID 能量,主要产生糖苷键断裂的碎片,为糖链的结构组成分析提供了线索;采用25%HCD 能量,在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息,并产生明确的糖肽Y1特征离子;ETD 保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂,可以提供有效的肽段序列信息三本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式,为完整糖肽的结构解析提供了一种快速二有效的研究方案三关键词　亲水作用色谱;串联质谱;完整糖肽;碰撞诱导解离;高能诱导解离;电子转移解离　2013?06?07收稿;2013?08?05接受本文系国家高技术研究发展计划(No.2012AA020203)二国际科技合作项目(No.2011DFB30370)二北京市科技新星计划(No.Z121107002512014)资助*E?mail:yingwtll@https://www.wendangku.net/doc/b36937089.html,,qianxh1@https://www.wendangku.net/doc/b36937089.html, 1　引　言 蛋白质的糖基化修饰是生物体内普遍存在的一种重要翻译后修饰方式[1,2],但其研究面临很多挑战三糖基化修饰具有多样性三糖基化修饰没有任何模板[3],而是由200多种糖基转移酶调控,同一蛋白质的不同位点的修饰水平不一,同一位点所携带的糖链也存在多种结构,这给分析技术和软件工具带来了巨大挑战;目前完整糖肽的分析手段有限,主要以质谱分析为主,但由于糖肽修饰的微不均一性,及在质谱中离子化困难二碎裂情况复杂等特点,严重制约了完整糖肽的富集和质谱分析技术的发展三2012年,Doerr 等[4]总结了糖蛋白质结构解析的经典研究手段,并指出主要的研究方法是先将糖链从蛋白上释放,然后分别对两者进行解析,这导致了蛋白与糖链之间联系的缺失三聚糖结构解析[5],可以解析大量糖链结构,却忽视了糖链的来源;蛋白部分研究[6],可以得到明确的蛋白序列及大规模糖基化位点,却丢失了糖链信息三Nakano 等[7]研究发现,特异位点的糖基化修饰影响生物学功能,这表明位点特异性水平的糖基化修饰研究对进一步阐释糖蛋白质的生理功能及其在病理过程中的变化具有重要意义三因此,开发完整糖肽水平的研究方法,保留蛋白质与聚糖之间的连接,已成为当前的研究热点三 完整糖肽的复杂结构对分析方法的制约,需要从富集和鉴定两方面解决三首先是由不均一性导致的糖肽低化学计量水平,及其在质谱中离子化效率不高而受非糖肽信号抑制的问题三可以通过完整糖肽的富集与分离,去除非糖肽的干扰而提高糖肽的相对丰度三目前应用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]二二氧化钛[9]二酰肼[10]和亲水相互作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)[11]等三其中,HILIC 是基于富含多羟基的糖链结构的强亲水特性,而使糖肽与非糖基化肽段得以分离三HILIC 对不同类型的糖肽没有偏性,且能保持糖链结构的完整性,适合作为完整糖肽结构研究中的富集技术三其次,完整糖肽包含肽段和糖链两部分,其结构和连接方式的差异导致两者在串联质谱第42卷 2014年2月 分析化学(FENXI HUAXUE )　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第2期159~165

疏水层析填料

2008-6V o l u m e8 疏水层析填料 疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。 Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图： 填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，Cellfine TM Octyl 对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。 三种疏水层析填料的疏水性差异（左图） 色谱柱： x 150 mm 柱体积：8 ml 流动相：– 0.0M

Ammonium Sulfate in 0.01M phosphate, pH 流速： ml/min 样品：5 mg/3 ml–100 μl 2008-6 Volume 8 Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱） Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。 聚合物基材氨基 柱与硅胶 基材氨基 柱的柱寿 命比较 左图为 Asahipak NH2P 色谱柱与硅胶

亲水作用色谱理论简介

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μM。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的PH值。但需要注意的是，C18和C8使用的PH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的PH值会使硅胶溶解，太低的PH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在PH 1.5~10范围操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法反相色谱法 固定相极性高～中中～低 流动相极性低～中中～高 组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。 3．离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的PH值和离子强度影响。PH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。

亲水作用色谱

亲水作用色谱（HILIC）在体内药物分析中 的研究进展 姓名: 李沙沙学号： 201212282939 专业：药剂导师赵永星

亲水作用色谱（HILIC）在体内药物分析中的研究进展 摘要近年来亲水作用色谱（HILIC）成为色谱领域研究的热点之一。亲水作 用色谱是一种结合亲水固定相与极性有机溶剂-水体系流动相的色谱分离技术，对反相作用色谱中难以保留的极性化合物能够实现有效分离。本文简要介绍了HILIC的分离机制，固定相，联用技术，并综述了其在体内药物分析中的研究进展。 关键词亲水作用色谱；体内药物分析；分离机制；固定相 Hydrophilic interation charomatography and its Research Development in Biopharmaceutical Analysis Abstract Hydrophilic interaction chromatography(HILIC) is popular in the analy- sis of hydrophilic solute in recent years. Hydrophilic interaction chromatography(HI LIC) separation system consists of polar stationary phase and mobile phase with high polar organic solvent content and small portion of water phase. It has been shown to be a powerful tool for separating polar analytes which have poor retention on traditi- onal reversed-phase liquid chromatography.This article briefly reviews concept, me- chanism and stationary phase of HILIC, and its recent Research Development in Biopharmaceutical Analysis. Key words HILIC ; Biopharmaceutical Analysis ; stationary phase ; mechanism 体内药物分析是对体液或组织中药物及其代谢物、生物标记物等进行的定性或定量分析。生物样品成分复杂，因此分析物检测手段的选择成为需要密切关注的问题。反相液相色谱（RPLC）是当前分离分析和分离制备中应用最为广泛的色谱模式，其依靠疏水固定相与溶质之间的疏水相互作用实现弱极性和中等极性化合物的高效分离。生物基质中含有其他多种亲水性组分，包括内源性物质以及外源性物质，当目标化合物在反相色谱保留较弱时，可能会与这些成分发生共洗脱。对强极性化合物的保留很弱，甚至不保留，因此强极性化合物在上不能得到很好的分离。目前，用来分离强极性化合物的液相色谱方法主要有离子交换色谱法（IEC）、正相色谱法（NPLC）和亲水作用色谱法（HILC）。 亲水作用色谱（HILIC）的概念是由Alpert[1]首次提出，它是指采用极性固定相(如硅胶或衍生硅胶) 和含高浓度极性有机溶剂（如乙腈）和低浓度水溶液流动相的色谱模式，具有和反相色谱正交的选择性所使用的流动相与传统反相色谱相似，弱洗脱剂为有机相，强洗脱剂为水相，可达到与反相色谱相媲美的柱效和

流体动力色谱法和障碍色谱法及其应用概要

流体动力色谱法和障碍色谱法及其应用 [ 11-04-23 15:04:00 ] 作者：李建军刘鹏耿信 笃编辑：studa20 【摘要】介绍了流体动力色谱（HDC）和障碍色谱（SC）及其在生物、化工分离中的研究进展，着重于它们的分离原理、理论发展及二者之间的联系 与转化，引用52篇文献。 【关键词】动力学液相色谱, 流体动力色谱, 障碍色谱，DNA分离，评述 Abstract Hydrodynamic chromatography(HDC) and slalom chromatography(SC) called as dynamic liquid chromatography(DLC) were introduced and reviewed, mainly for the recent development of separation principle, theoretical model, and applications. Fifty two references were cited. Keywords Dynamic liquid chromatography, hydrodynamic chromatography, slalom chromatography, deoxyribonucleic acid separation, review 1 引言 随着生命科学研究的不断深入，液相色谱法(LC)在分离纯化多肽及蛋白质方面的应用也得到了迅速地发展，尽可能提高其分离度已成为LC研究中最重要的课题之一[1,2]。多年来，研究溶质组分的色谱保留行为基本上依据热力学因素，即根据各组分在固定相和流动相中的分配系数的差异实现对组分的分 离，并且假定组分在该二相间的分配或吸附平衡是瞬时完成的。然而，早在 1956年，荷兰学者Van Deemter便提出了色谱过程的动力学理论——速率理论[3]。他将色谱过程视为一个动态的非平衡过程，研究分离过程中的动力学因素对峰展宽的影响。此后，Giddings等[4]在Van Deemter方程的基础上，提出 了LC的速率方程，即Giddings方程，他们认为溶质在流动相和固定相转移的 过程并不是瞬间达到平衡，实际上组分传质速度是有限的，说明分离中总是存 在着动力学的非平衡过程。液相色谱的分类是依据溶质与固定相之间的作用特征，如电荷作用的离子交换色谱，疏水相互作用的疏水相互作用色谱和反相色谱，亲合作用的亲合色谱及分子大小的尺寸排阻色谱等。本文介绍的流体动力 色谱（hydrodynamic chromatography, HDC）和障碍色谱（slalom chromatography, SC），其溶质均与固定相之间的作用特征无关，或关系甚 小，而主要与流动相的流动特征有关，或是基于动力学因素发展起来的两种新 的色谱方法，二者通称为动力学液相色谱法。目前, 它们已经在测定和分离聚 合物、多肽、DNA和生物大分子方面广泛应用。文献[5]从与SEC 比较的角度简要地介绍了HDC和SC的分离原理及二者之间的不同点。本文详细并系统地说明了HDC和SC的分离原理、模型、理论发展、仪器设备和最新应用，并探讨了HDC与SC之间的联系及相互转化。 2 流体动力色谱（HDC）